kiss1过表达对肺癌a549细胞生物学作用的研究

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1、AⅡ1esis(dissertation)submittedtoZhengzhouU1：liVers时forthedegreeofMaster(doctor)TheExpressionofⅪSSlinLungCancerandRoleofⅪSSlinBiolo醇calFunctionofLungCancerCeUByAiguoxuSupervisor：(沁ojullzhangClinicalMedicineTheFirstAmliatedHospitalofZhengzhouUniVersityMarch，2013原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人

2、在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：许爱国日期：2013年05月26日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者

3、其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：许爱国日期：2013年05月26日摘要摘要肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的生命及健康，其发病机制迄今尚不完全明确。肺癌的早期临床症状轻微，多数患者在确诊时已属中晚期，因而造成了大量的术后转移和复发，在相当长的时间内寻找与肺癌侵袭转移的相关因子仍然是人类面临的亟需解决的重大问题。ⅪSSl是Lee等在1997年利用修饰递减杂交技术在黑色素瘤细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因，编码

4、一个由145个氨基酸组成的亲水性蛋白，其氨基酸位点上存在着具有Src癌蛋白SH．3区特征的PXⅪ，，可抑制带有SH．3的各种因子，参与转移级联反应抑制多种肿瘤的浸润、转移。NF．KB是近年来发现的转录调控因子，转录因子NF．KB广泛存在于人的各种细胞中，调节从免疫系统、细胞生长到炎症等多个基因的表达，它的失调会导致包括肿瘤在内多种疾病的发生。NF．1cB最常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体，NF．1cB在细胞中与其阻抑物IKBQ蛋白结合，以非活性形式存在于胞质中，当它被激活后，通过信号传导引起11(B的泛素化及蛋白酶体途径的降解，导致NF．1(B．11

5、cB复合物解体，解离的NF．1cB进入到核内并暴露它的核识别位点，与特定靶基因结合而启动靶基因转录开放，调节多种基因的表达，在很多癌症中可以观察到NF．1cB的异常，它通过转录调控激活一些与细胞增殖、血管新生、转移、肿瘤恶化、抑制细胞凋亡等有关基因的表达来参与肿瘤的发生和恶化过程。基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMPs)是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润、转移中起重要作用，在肿瘤演进等众多生理和病理过程中均发挥着重要的作用。研究发现，在许多肿瘤组织中，都发现有较高MMP9的表达，且其

6、表达程度与肿瘤的侵袭性有关。目前研究表明ⅪSSl、NF．出p65和MMP9在多种肿瘤组织中均存在异常表达，并证实与肿瘤的侵袭和转移过程存在密切关系，但目前对三者的研究多数是在各自独立的层面上，且三者之间的关系及相互作用机制至今尚未完全阐明，在肺癌中三者结合起来研究尚无文献报道。多种肿瘤细胞KISSl处于低表达状摘要态，通过基因修饰可以增加ⅪSSl蛋白的表达，肿瘤细胞中KISSl过表达若能激活NF．1cB信号通路，封锁NF．1cB的核内转移，减少其与MMP．9启动子的结合，进而使MMP9转录水平下降，MMP．9蛋白合成减少，籍以降低对Ⅳ型胶原及层粘连蛋白等成份的降

7、解，减少对基底膜完整性的破坏，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移，这也成为本课题立题的切入点所在。本研究中，我们首先利用免疫组化技术、逆转录．PCR技术及免疫印迹技术测定人肺癌及癌旁组织中ⅪSSl、NF．KBp65和MMP9mRNA及蛋白的表达情况及相互关系，旨在探讨三者在肺癌发生发展、侵袭和转移过程中的作用机制。随后利用基因扩增技术获得人ⅪSSl基因cDNA序列，构建pEGFP。ⅪSSl表达载体，并构建用于FI通T实验的pECFP．ⅪSSl及pEYFP．p65载体；将成功构建的pECFP．ⅪSSl及pEYFP—p65载体转染到A549细胞中，利用激光共聚焦扫描显微镜进行

8、基于感应发射法的FRET