虾肝肠胞虫病理学检测技术的建立.pdf

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1、学校代码：10264研究生学号：M150150256上海海洋大学硕士学位论文题目：虾肝肠胞虫病理学检测技术的建立EstablishmentofPathologicalDetection英文题目：TechniqueforEnterocytozoonhepatopenaei专业：渔业研究方向：水产动物疾病学姓名：常晓晴指导教师：房文红（研究员）二O一八年四月三日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果

2、的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注徐田军上海海洋大学教授主席么宗利东海水产研究所副研究员委员李新苍东海水产研究所副研究员委员周俊芳东海水产研究所副研究员委员王元东海水产研究所助理研究员秘书答辩地点东海水产研究所答辩日期2018.5.20上海海洋大学硕士学位论文虾肝肠胞虫病理学检测技术的建立摘要虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。该病原最早于2004年作为一种未知微孢

3、子虫在泰国生长缓慢的斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞内被发现，2009年Tourtip等也从斑节对虾肝胰腺发现了这种微孢子虫，在宿主细胞的细胞质中能观察到处于不同时期的虫体，SSUrRNA序列同源性比对表明，该微孢子虫与比氏肠胞虫的同源性为84%。综合其独特的超微结构，寄生细胞质位置及SSUrRNA序列同源性分析，将之命名为虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei），并认定其为肠上皮细胞微孢子虫属的一个新种。虾肝肠胞虫作为养殖对虾的重要病原，近年来各地都有检出的报道，且呈上升趋势，该寄生虫威胁着整个对虾养殖产业的发展。本文围绕虾肝肠胞虫病理学检测技术，建立了虾肝肠胞虫的孢

4、子染色方法与荧光镜检法、组织内虾肝肠胞虫的特殊染色方法与荧光染色方法、原位杂交显色方法共两种孢子检测技术和三种组织中孢子染色检测技术，为EHP和白便综合征的快速临床诊断和进一步研究提供了技术支持和指导。（1）EHP孢子染色效果比较与方法建立。首先，本文利用分离纯化到较纯的EHP孢子，选用24种常用染色液对EHP孢子进行染色，比较染色效果筛选染色液。24种染色液分别为吉姆萨染色液、考马斯亮蓝R250和G250、藏红T、结晶紫、维多亚蓝B、龙胆紫、亚甲基蓝、灿烂绿、甲基绿、孔雀石绿、胭脂红B、曙红Y水溶、台盼蓝、苯胺蓝、吡罗红G、中性红、甲基蓝、刚果红、固绿、苏丹III、甲基红、碱性品红、曙红

5、Y醇溶。实验结果表明，效果较好可用于孢子染色的染色液有吉姆萨染液、考马斯亮蓝G250、结晶紫、龙胆紫、亚甲基蓝、孔雀石绿、碱性品红、曙红Y醇溶8种染色液。可使孢子染色但存在染色过浅、背景杂质较多等问题的染色液有考马斯亮蓝G250、藏红T、维多亚兰B、甲基绿、胭脂红B、曙红Y水溶染液、吡罗红G染液、灿烂绿8种染色液；对孢子上色浅或不上色并存在背景颜色过深、杂质过多等问题的染色液有台盼蓝、苏丹III醇溶、甲基红醇溶染液、水溶苯胺兰、中性红、甲基蓝、刚果红、固绿FCF染液共8种染色液。I上海海洋大学硕士学位论文（2）对虾肝胰腺中EHP染色方法建立。病理检测是一种诊断病原及观察机体组织病理变化的重

6、要方法，特殊染色是在病变组织中寻找病原体的前提手段，良好的染色有助于将病原体与组织区别，从而增加病原在组织切片中的检出率。为筛选出一种适用于虾肝肠胞虫病理切片检测的最佳染色方法，本文使用苏木精-伊红（HE）染色法、Masson染色法、爱显蓝-雪夫（AB-PAS）染色法、甲苯胺蓝（TB）染色法、伟郝夫范吉森（EVG）染色法、劳克坚牢蓝（LFB）染色法、天狼猩红（Siriusred）染色、普鲁士蓝（PB）等八种染色方法对凡纳滨对虾肝胰腺中的虾肝肠胞虫进行组织病理切片染色，并结合对EHP检出率的统计分析，比较了这些染色方法的优缺点。结果表明：HE染色法、AB-PAS染色法、TB染色法、EVG染色

7、法、天狼猩红Siriusred染色法和PB染色法对孢子的染色效果较差，与背景颜色对比不明显，单个视野检出率较低；劳克坚牢蓝（LFB）染色法虽然使孢子易被识别，但是有孢子丢失现象，且组织染色效果差；Masson染色结果显示孢子呈现品红色，与组织颜色对比鲜明，孢子颗粒清晰可见，对组织细胞结构染色效果较好，且检出率也最高。综合分析染色效果及检出率，Masson染色法是一种非常适用于组织内的虾肝肠胞虫孢子染色的方法，本研究为微孢