虾肝肠胞虫实时荧光定量pcr检测技术的建立及其与对虾生长相关性的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M120104131上海海洋大学硕士学位论文虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检题目：测技术的建立及其与对虾生长相关性的研究Developmentofreal-timePCRassayfordetectionofmicrosporidian英文题目：Enterocytozoonhepatopenaeianditsgrowthcorrelationwithshrimpsamples专业：临床兽医研究方向：水产动物疾病控制姓名：刘珍指导教师：黄倢研究员二O一五年五月二十九日上海海洋大学学位论文原创性声明本

2、人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全

3、部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会人员名单是否硕士导姓名工作单位职称备注师相建海中科院海洋所研究员是主席孙黎中科院海洋所研究员是委员战文斌中国海洋大学教授是委员张士璀中国海洋大学教授是委员张晓华中国海洋大学教授是委员李晨黄海水产研究所工程师否秘书答辩日2015年6月4日上午答辩地点黄海所1号楼3楼会议室期9:00II虾肝肠胞虫实

4、时荧光定量PCR检测方法建立及其与对虾生相关性的研究摘要虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei）是近几年新发现的寄生于对虾肝胰腺组织的新病原，2009年泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾首次发现并命名。尽管虾肝肠胞虫不会引起对虾的死亡，但它与对虾生长缓慢有关。早期死亡综合征或者急性肝胰腺坏死病（AHPND/EMS）引起的虾高致死率使得人们将更多的注意力集中到AHPND/EMS上面，忽视了虾肝肠胞虫造成的影响，这使得虾肝肠胞虫的传播越来越广泛，有信息表明在中国、印度尼西亚、马来西亚、越南、印度和泰国中都有检出

5、。本文从实时荧光定量检测方法的建立、人工感染实验、肝肠胞虫的寄生数量与对虾生长相关性几个方面进行研究。根据Genbank中公布的对虾肝肠胞虫SSUrDNA序列设计一对特异性引物，通过对引物的特异性以及灵敏度检测实验表明引物具有良好的特有性和较高的灵敏度。利用pMD18-T构建含有SSUrDNA序列的重组质粒作为实验标准品，对反应体系进行多次优化建立了肝肠胞虫SYBRGreen实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，构建的方法扩增循环数与目的基因拷贝数呈良好的线性关系，且Tm值为60℃时扩增效果最好，熔解曲线仅有一个单一的特异峰，

6、扩增所的扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数标的准曲线为Ct=-3.3692log(Sq)+39.364，相关系数R=0.992，扩增效率为98.5%。利用建立III的荧光定量方法检测了海南采集的31份个体生长大小不均匀的凡纳滨对虾样品，肝肠胞虫的阳性检出率为67.7%，高于常规PCR检测，而且通过溶解曲线分析特异性良好，表明该方法具备较好的适用性。建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点，可为肝肠胞虫进行快速检测以及定量研究提供参考。人工感染实验利用凡纳滨对虾幼虾和卤虫进行，用

7、冰冻和鲜活的的感染有肝肠胞虫的凡纳滨对虾肝胰腺组织去投喂健康的凡纳滨对虾，投喂一周后的样品套式PCR检测结果显示投喂冰冻和鲜活肝胰腺组织病料都可以使健康幼虾感染肝肠胞虫。说明肝肠胞虫的孢子能够抵抗较差的外界环境，低温冰冻后仍然具有感染力，这也为生产上肝肠胞虫的预防和治疗带来了麻烦。卤虫感染实验样品套式PCR检测结果显示为阴性，利用实验建立的实时荧光定量PCR方法检测结果显示为阳性。说明肝肠胞虫感染卤虫后并没有在卤虫体内大量繁殖，但是肝肠胞虫可以在卤虫体内寄生存活。在对虾肝肠胞虫的流行病学调查过程中，我们采集了山东即墨、江苏赣榆

8、以及海南儋州三个地区生长缓慢且个体大小差异明显的凡纳滨对虾样品，并测量了这几批凡纳滨对虾的体长，怀疑这几批样品是因为感染对虾肝肠胞虫而导致其生长缓慢，并且出现个体大小差异的明显症状，利用实时荧光定量PCR检测方法分析了肝肠胞虫对这几批凡纳滨对虾样品生长的影响。实验同时对WSS