大豆两个myb 转录因子基因的克隆及表达分析

《大豆两个myb 转录因子基因的克隆及表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

中国农业科学2008,41(4):961-970ScientiaAgriculturaSinica大豆两个MYB转录因子基因的克隆及表达分析1,234122杨文杰，杜海，方芳，杨婉身，吴燕民，唐益雄123（四川农业大学生命科学与理学院，四川雅安625014；中国农业科学院生物技术研究所，北京100081；四川农业大学玉米研究所，4四川雅安625014；哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东威海264209）摘要：【目的】克隆新的植物MYB转录因子基因，进行序列分析，并对其功能进行初步鉴定。【方法】RT-PCR法结合RACE-PCR法分离克隆MYB基因cDNA全长序列；酵母系统检测其转录激活活性；半定量RT-PCR检测目的基因在植物体中的表达情况，及对类黄酮代谢途径中生物合成酶的影响。【结果】根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物，以大豆品种中豆27的叶片为材料，RT-PCR扩增出两个MYB基因同源片段；据此设计基因特异引物，通过RACE-PCR分离克隆出两个新的MYB基因GmMYBZ1、GmMYBZ2。酵母系统检测表明，GmMYBZ2具有转录激活功能，β－半乳糖苷酶活性为10.35U；半定量RT-PCR在中豆27的茎和叶中检测到GmMYBZ1的表达，而GmMYBZ2在植物的根、茎、叶及未成熟种子中均有表达；对转基因烟草的RT-PCR检测结果显示，GmMYBZ2的表达可抑制类黄酮代谢途径中PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F4H及FLS等生物合成酶基因的表达。【结论】从大豆栽培品种中豆27中克隆出了两个新的MYB基因GmMYBZ1、GmMYBZ2；功能研究表明，GmMYBZ2可能参与植物类黄酮合成调控。关键词：大豆；MYB转录因子；基因表达调控CloningandCharacterizationofTwoNewMYBTranscriptionFactorGenesfromSoybean1,234122YANGWen-jie,DUHai,FANGFang,YANGWan-shen,WUYan-min,TANGYi-xiong12(CollegeofLifeandScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,Sichuan;BiotechnologyResearchInstitute,Chinese3AcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081;MaizeResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,4Sichuan;MarineCollege,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,Weihai264209,Shandong)Abstract:【Objective】GenesencodingnewMYBtranscriptionfactorsweretobeclonedandtheirfunctiontobeclarified.【Method】RT-PCRwasusedtoisolatecDNAsequencesofMYBgenesandtoanalyzetheirexpressioninplants.ThetranscriptionalactivitiesoftheMYBproteinsweredetectedbyyeastexpressionsystem.【Result】ApairofdegenerateprimersweredesignedaccordingtotheconservedregionswhichencodetheMYBDNAbindingdomainsinplantMYBgenes.Two168bpfragmentswereamplifiedfromtheleavesofsoybeancultivarZhongDou-27usingRT-PCR.TwonewMYBgenes,GmMYBZ1andGmMYBZ2,wereisolatedbyRACE-PCR.ThetranscriptionalactivationabilityofGmMYBZ2proteinwasconfirmedbytheyeastsystemwithβ-galactosidaseactivityof10.39U.Resultsofthesemi-quantitativeRT-PCRanalysisshowedthatGmMYBZ2wasexpressedinroots,stems,leavesandimmatureseedsofsoybean,whereastheexpressionofGmMYBZ1wasdetectedonlyinthestemsandleaves.Semi-quantitativeRT-PCRanalysisindicatedthatGmMYBZ2mayalsorepresstheexpressionofsomeflavonoidbiosyntheticgenes,suchasPAL,C4H,4CL,CHS,CHI,F4HandFLS.【Conclusion】Twonovelgenes,GmMYBZ1andGmMYBZ2encodingMYBtranscriptionalfactorswereisolatedandcharacterizedfromsoybeancultivarZhongDou-27.FunctionalstudyofthesetwogenesshowedthatGmMYBZ2maybeinvolvedintheregulationofflavonoidbiosynthesis.Keywords:Soybean;MYBtranscriptionfactors;Geneexpressionandregulation收稿日期：2007-01-05；接受日期：2007-03-16基金项目：中国-荷兰国际合作项目作者简介：杨文杰（1970-），男，山东泰安人，博士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。Tel：010-62121920；E-mail：yangwenjie01@yahoo.com.cn。通讯作者唐益雄（1965-），湖南邵东人，研究员，博士，研究方向为生物化学与分子生物学。Tel：010-62121506；E-mail：tangyx@mail.caas.net.cn 962中国农业科学41卷的植物抗毒素前体，具有丰富的医疗和保健价值。大0引言豆是最重要的异黄酮来源，而大多数MYB转录因子【研究意义】在不同条件下，通过转录因子在转对植物类黄酮的代谢均有调控作用。【拟解决的关键录水平上调控目的基因的表达水平，是植物对其生长问题】本研究以富含异黄酮的大豆品种－中豆27为研[23]发育及生理代谢调控的一种重要方式。自从Paz-Ares究材料，期望从中分离克隆出调控大豆类黄酮生物[1]首次克隆了玉米的转录因子基因C1以来，已有数百合成的新的MYB基因，并对其进行序列分析及部分功种调控干旱、盐渍、激素、低温及生长发育等相关基能的初步鉴定，为研究其在植物胁迫耐受及次生代谢因表达的转录因子基因被分离克隆，据推测拟南芥中调控中的作用奠定基础。至少有1553个转录因子基因，约占其基因总数的[2~5]1材料与方法5.9%。MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应1.1植物材料与总RNA提取答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物供试大豆品种中豆27，由中国农业科学院作物科[6,7]叶片的形态建成具有重要的调节作用；对MYB转学研究所、作物种质资源保护与研究中心及北京国家录因子基因LHY和CCA1的研究结果显示，它们可能大豆改良分中心孙君明博士共同提供。自然光照和温[8]通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控。【前室条件下培养2周后开始取材，分别剪取根、茎、叶人研究进展】MYB转录因子具有高度保守的DNA结及未成熟种子，液氮冻存备用。TRNzol（TianGen）合域——MYB结构域。在每个MYB区域中，一般都小量提取总RNA。含有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18～19个氨基1.2药品、试剂与所用引物酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋-转角-螺RNA提取试剂TRNzol购自北京天根科技有限公TM旋（HTH）的构型起着非常重要的作用。此外，大多司；SuperScriptⅢReverseTranscriptase及GeneTM数MYB转录因子在C-端与DNA结合域之间都具有Racerkit购自Invitrogen公司；pMD18-T载体购自[9]一个富含酸性氨基酸的转录激活功能域。根据所含宝生物公司；大肠杆菌DH-5感受态购自北京天根科MYB结构域的数目，植物中的MYB类转录因子可分技有限公司；MatchmakerThree-HybridSystem购自为单一MYB结构域蛋白、两个重复MYB结构域蛋Clontech公司。试验所用引物见表1。白和3个重复MYB结构域蛋白3个亚类。植物体中1.3中豆27MYB基因cDNA的克隆绝大多数MYB蛋白有两个重复MYB结构域（R2R3），1.3.1RT-PCR扩增cDNA同源片段根据植物中MYB推测在拟南芥中有130多个R2R3MYB基因，约占拟基因DNA结合域保守区设计一对简并引物S和AS，[10]南芥基因组编码基因的0.2%～0.6%；玉米中至少有以叶片为材料提取总RNA进行RT-PCR，PCR条件为：[11]80个MYB基因。近年来，利用DNA微阵列、转座94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃30s，30个循子标签、T-DNA激活标签及同源克隆等方法分离克隆环；72℃10min。将回收的PCR产物连接至pMD18-T[12~20]出了大量MYB基因，对这些基因的修饰与表达，载体上，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR加深了人们对其生物学功能的认识。MYB蛋白家族庞筛选阳性克隆，并对所得片段进行测序。大、功能复杂多样，对MYB转录因子在植物生长发1.3.2cDNA末端扩增根据已获得的中间片段的核育及生理代谢中的调控机理的深入研究和解析，尚有苷酸序列设计基因特异引物。采用TRNzol方法提取赖于大量MYB转录因子基因及相关基因的克隆和功叶片总RNA，以引物QT作反转录获得cDNA为模板，能分析。【本研究切入点】类黄酮是植物体中一类重分别用3ZD1-GSP1、3ZD1-GSP2、3ZD2-GSP1和要的次生代谢物，广泛存在于各种植物类群中。黄酮3ZD2-GSP2与3′通用引物Q1和Q2进行3′cDNA末端类次生代谢物具有多种生物学功能，在植物基础生理扩增。利用5′特异引物5ZD1-GSP1、5ZD1-GSP2和代谢中发挥着极为重要的作用。此外，类黄酮还具有5ZD2-GSP1、5ZD2-GSP2与GeneRacer5′Primer和抗氧化、抗癌、降低胆固醇、抑制和预防冠心病以及GeneRacer5′NestedPrimer进行5′cDNA末端扩增，具[21,22]其它老年性疾病的作用，作为人类食物中的组成体操作参照Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒说明成分，对人体的健康具有非常重要的影响；其中，仅书。回收扩增产物并连接至pMD18-T载体，转化大存在于豆科等少数植物种类中的异黄酮，是许多重要肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆测序鉴定。 4期杨文杰等：大豆两个MYB转录因子基因的克隆及表达分析963表1本研究所用引物（共33条）Table1Theprimersusedinpresentstudy(Atotalof33)引物编号Primercode引物序列PrimersequenceS5′-G(G/A)TG(T/C)GG(A/G/C)AA(G/A)AGCTG(C/T)AGACT(A/C)(A/C)G-3′AS5′-T(T/C)TCATTG(T/G)C(A/T)GTTC(T/G)TCC(T/A)GG(T/C/A)A(A/G)-3′3ZD1-GSP15′-ACCAGAGAAGAAGAGGACACCATAA-3′3ZD1-GSP25′-TGAAATGTTGGGAAACAGATGGTC-3′3ZD2-GSP15′-CGGTAACAAGTGGTCTTTGATAGCT-3′3ZD2-GSP25′-TTGATAGCTGGAAGATTACCTGGAC-3′5ZD1-GSP15′-CTTCGGTGCGTCCTGGTAATCGT-3′5ZD1-GSP25′-GTCCTGGTAATCGTCCAGCAATG-3′5ZD2-GSP15′-AGTCAGGGCAGCGTCCCAAGAT-3′5ZD2-GSP25′-GGAACCTTTAACAACGCTTCCG-3′ZD1-F15′-CATTTTCAGGTTCCCACATGGAAAC-3′ZD1-F25′-ATGGAAACGAAGGACGACAGTGCT-3′ZD2-F15′-AATTGAGTATGGGAAGGTCCCCTTG-3′ZD2-F25′-GAGTATGGGAAGGTCCCCTTGCT-3′ZD2-R15′-TTCATTCTCTCACTTCTCTCCAACAA-3′ZD2-R25′-TCTCTCACTTCTCTCCAACAACACTAACT-3′ZD1-Y(F)5′-CTCGAATTCATTATGGAAACGAAGGAC-3′ZD1-Y(R)5′-CCACTCGAGTGTCCACCTTATTACTTCA-3′ZD2-Y(F)5′-ACAGAATTCAGTATGGGAAGGTCCC-3′ZD2-Y(R)5′-GCAGTCGACTCTCACTTCTCTCCAA-3′GmUBI-F5′-CTCTGACAGGGAAGACCGTAAC-3′GmUBI-R5′-GAGACCGTGCATAGCAAGCTA-3′ZD1-RT(F)5′-CTATTTGAGAAAGGAGGCAGAAG-3′ZD1-RT(R)5′-ATAAAAAAGCACAACATGGTTGA-3′ZD2-RT(F)5′-CGGGGAGAACAGACAATGAAATAAA-3′ZD2-RT(R)5′-CAAACCCAAACTGCAAACGAAAC-3′QT5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)-3′Q15′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′Q25′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′pBI121-ZD2(F)5′-ACATCTAGAAGTATGGGAAGGTCCC-3′pBI121-ZD2(R)5′-GCTGGTACCTCTCACTTCTCTCCAA-3′N-Act(F)5′-GCTGTTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3′N-Act(R)5′-AATACCTGTTGTACGGCCACTG-3′1.3.3全长cDNA扩增根据已得到的5′序列和3′序pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆列设计基因全长扩增引物，以基因特异引物ZD1-F1、测序鉴定。ZD1-F2和3′通用引物Q1、Q2巢式PCR，扩增基因1.4在不同组织中的表达分析GmMYBZ1cDNA全长序列；以基因特异引物ZD2-F1、以大豆泛素蛋白基因Subi-1（D16248）为内标基ZD2-F2、ZD2-R1及ZD2-R2巢式PCR，扩增基因因，设计大豆泛素蛋白基因特异引物GmUBQ-F和GmMYBZ2cDNA全长序列。回收扩增产物并连接至GmUBQ-R；分别提取中豆27的根、茎、叶和未成熟 964中国农业科学41卷种子等不同器官的总RNA，反转录获得的cDNA作为筛选出5个阳性克隆，测序后得到两条不同的168bpPCR扩增模板；预试验确定RT-PCR循环数，以保证的序列，命名为Z1和Z2。序列检索结果显示，Z1与目的基因与内标基因的扩增均在指数期。根据大豆MYB160和玉米的MYB28核苷酸序列一致性达GmMYBZ1和GmMYBZ2的3′非翻译区设计特异引物56%；Z2与水稻的OSMYB2和拟南芥的MYB3核苷酸ZD1-RT（F）、ZD1-RT（R）及ZD2-RT（F）和ZD2-RT一致性分别达79.76%和79.17%，初步判断这两个片（R）进行RT-PCR扩增，检测其在中豆27不同组织段为大豆MYB基因保守区。中的表达情况。2.2cDNA末端片段的克隆1.5转录激活功能分析利用基因特异引物3ZD1-GSP1、3ZD1-GSP2和合成引物ZD1-Y（F）、ZD1-Y（R）、ZD2-Y（F）3ZD2-GSP1、3ZD2-GSP2及3′通用引物Q1、Q2进行和ZD2-Y（R）从连接有全长GmMYBZ1和3′RACE扩增，电泳检测分别得到两条约500bp和700GmMYBZ2cDNA的pMD18-T载体上扩增出完整的开bp的扩增产物（图1-B，1-C），测序结果表明，这两放阅读框。将扩增片段克隆在Matchmaker酵母系统个片段分别为514bp和678bp，且5′端序列与原同源中pBridge载体的EcoRⅠ和SalⅠ位点，构建与BD片段部分重叠，判断为目标MYB基因的3′端序列。（bindingdomain）翻译融合的效应质粒pBridge-利用特异引物5ZD1-GSP1、5ZD1-GSP2和GmMYBZ1和pBridge-GmMYBZ2，经测序验证5ZD2-GSP1、5ZD2-GSP2及GeneRacer5′Primer和GmMYBZ1和GmMYBZ2与BD融合表达的读码框正5′NestedPrimer进行5′RACE扩增，电泳检测得到约确后，转化酵母菌株AH109，均匀涂于SD/-Trp单缺400bp和500bp两条扩增产物（图1-D，1-E），测序陷平板上，结合菌落PCR筛选转化子；YPD培养基结果表明，这两个片段分别为385bp和452bp，且3′摇菌培养2～3d后，在SD/-Trp/-His双缺陷平板上划端序列与原同源片段部分重叠，判断为目标MYB基因板培养，观察转化子的生长情况，按Matchmaker酵的5′端序列。母系统操作流程进行Whatman滤纸显色检测；并以2.3MYB基因全长cDNA的克隆ONPG（o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside）为底物，利用基因全长特异引物ZD1-F1、ZD1-F2和3′通进行β-半乳糖苷酶活性检测。用引物Q1、Q2，巢式PCR获得一条约900bp的扩增1.6GmMYBZ2对类黄酮生物合成基因表达的影响产物；利用基因全长特异引物ZD2-F1、ZD2-F2、利用分别设计有酶切位点XbaⅠ和KpnⅠ的引物ZD2-R1、ZD2-R2，进行全长cDNA扩增，获得一条pBI121-ZD2（F）和pBI121-ZD2（R），从连接有全约1kb的扩增产物（图1-F，1-G）。测序结果表明，长GmMYBZ2cDNA的pMD18-T载体上扩增出完整的这两个全长序列分别为807bp和970bp，序列比对开放阅读框。XbaⅠ和KpnⅠ双酶切将载体pBI121的结果显示，与多种植物MYB家族的基因有较高相似GUS基因切除，然后，将经双酶切处理的GmMYBZ2性，推断为新的MYB基因，分别命名为GmMYBZ1连接至pBI121的XbaⅠ和KpnⅠ位点；HindⅢ和EcoR（DQ902862）和GmMYBZ2（DQ902861）。Ⅰ切下连接有GmMYBZ2的完整表达框并连接至2.4GmMYBZ1和GmMYBZ2全长序列分析pCAMBIA2301的HindⅢ和EcoRⅠ位点，构建表达载GmMYBZ1序列全长807bp，开放阅读框528bp，体pCAMBIA2301-GmMYBZ2，利用农杆菌LBA4404编码175个氨基酸，其氨基酸序列与棉花的GHMY36介导转化烟草NC89，以转化pCAMBIA2301空载体一致性为29.68%，与玉米的PL一致性为28.62%；的转化烟草为对照，半定量RT-PCR检测类黄酮代谢GmMYBZ2序列全长970bp，开放阅读框744bp，编途径中有关酶基因的表达变化。码247个氨基酸，其氨基酸序与大豆的MYB54一致性达到92.91%，与棉花的GHMYB9一致性达到2结果与分析66.04%。预测的氨基酸序列如图2，GmMYBZ1和2.1同源片段的克隆GmMYBZ2均具有两个MYB结构域，为典型的以叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板，通R2R3MYB转录因子；GmMYBZ2的氨基酸序列中，过简并PCR扩增出约170bp的目标带（图1-A），与具有一个与转录激活抑制有关的氨基酸基序，推测预期大小一致。将回收的PCR产物连接至pMD18-T具有一定的转录抑制功能，或具有较弱的转录激活功载体上，转化大肠杆菌DH-5α，利用α互补及菌落PCR能。 4期杨文杰等：大豆两个MYB转录因子基因的克隆及表达分析965A：同源片段的RT-PCR；B，C：GmMYBZ1andGmMYBZ2的3′RACE-PCR结果；D，E：GmMYBZ1andGmMYBZ2的5′RACE-PCR结果；F，G：GmMYBZ1和GmMYBZ2全长A:RT-PCRamplificationofhomologousfragments;B,C:3′RACEamplificationofGmMYBZ1andGmMYBZ2;D,E:5′RACEamplificationofGmMYBZ1andGmMYBZ2;F,G:fulllengthPCRamplificationofGmMYBZ1andGmMYBZ2图1中豆27MYB基因的RT-PCR,RACE-PCR及cDNA全长电泳结果分析Fig.1ElectrophoresisanalysisofRT-PCR,RACEandcDNAfulllengthPCRamplification2.5在不同组织中的表达酶活性检测表明，含有质粒pBridge-GmMYBZ1的酵以大豆泛素蛋白基因Subi-1（D16248）为内标基母菌落仅为3.59U，含有质粒pBridge-GmMYBZ2的酵因，对GmMYBZ1、GmMYBZ2两个基因进行半定量母菌落为10.35U（图5）。以上试验结果表明，RT-PCR扩增，结果只在茎和叶中检测到了GmMYBZ1GmMYBZ2具有一定的转录激活功能，但其转录激活的表达；而GmMYBZ2在根、茎、叶及未成熟种子中功能不强，这可能与3′端的转录抑制基序有关，而均有表达（图3）。GmMYBZ1没有明显的转录激活功能，因此，笔者主2.6转录激活功能验证要对GmMYBZ2进行了进一步的研究分析。将效应质粒pBridge-GmMYBZ1和pBridge-2.7对类黄酮合成酶基因的调控GmMYBZ2分别转入酵母菌株AH109中，含有质粒以农杆菌LBA4404介导，将表达载体pBridge-GmMYBZ1的酵母菌落能够在只缺少Trp的pCAMBIA2301-GmMYBZ2转入烟草NC89，利用KanSD培养基上生长，说明pBridge-GmMYBZ1已成功转抗性、Gus染色及RT-PCR筛选阳性苗，以转化化入酵母菌株AH109中，但不能在缺少Trp和His的pCAMBIA2301空载体的转化烟草为对照，烟草ActinSD双缺陷培养基上生长（图4-A，4-C），Whatman基因（AB158612）为内标基因，设计基因特异引物滤纸显色反应未能呈现明显的蓝色；而含有质粒N-Act（F）和N-Act（R）；预试验确定RT-PCR循环pBridge-GmMYBZ2的酵母菌落能够在缺少Trp和His数，以保证目的基因与内标基因的扩增均在指数期。的SD双缺陷培养基上生长，Whatman滤纸显色反应半定量RT-PCR检测显示，在GmMYBZ2转基因烟草呈现明显的蓝色（图4-B，4-D，4-E）。β-半乳糖苷中，苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶 966中国农业科学41卷阴影部分氨基酸序列代表植物MYB蛋白中高度保守的R2和R3DNA结合区域；黑体字母表示MYB结构域中保守的色氨酸(W)残基；虚线部分氨基酸代表可能的转录激活区；方框内部分为植物MYB蛋白C-端中参与转录抑制的氨基酸基序；波浪线部分为可能的锌指结构域TheshadedregionsrepresenttheconservedR2andR3DNA-bindingdomainofMYBprotein.TheboldlettersindicatetheconservedtryptophanresiduesintheMYBdomain.Thedashedregionindicatesputativetranscriptionalactivationdomain.TheconservedmotifintheC-terminalregionwhichisinvolvedintherepressionoftranscriptionisboxed.Wavylineindicatetheregionpotentiallyformingazincfingerdomain图2GmMYBZ1（A）和GmMYBZ2（B）核苷酸序列及推测的氨基酸序列Fig.2NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofGmMYBZ1(A)andGmMYBZ2(B) 4期杨文杰等：大豆两个MYB转录因子基因的克隆及表达分析967（C4H）、4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、茶尔酮合成酶（CHS）、黄酮醇合成酶（FLS）等基因的表达均有所下降（图6）。3讨论MYB是最大的植物转录因子家族之一，它们高度保守的DNA结合域使得利用PCR方法分离克隆MYB基因家族成员成为可能。MYB基因的分离克隆可以为A：GmMYBZ1的RT-PCR结果；B：GmMYBZ2的RT-PCR结果；C：大豆泛素蛋白基因的RT-PCR结果；R：根；S：茎；L：叶；IS：未成研究者提供这类转录因子在转录水平对植物某些生理熟种子A:RT-PCRamplificationofGmMYBZ1;B:RT-PCRamplificationof过程的调控机制的相关信息。本研究根据植物中MYBGmMYBZ2;C:RT-PCRamplificationofUbiquitinfromsoybean;R:Root;基因DNA结合域保守区设计简并引物，利用RT-PCRS:Stem;L:Leave;IS:Immatureseed及RACE-PCR的方法从大豆品种中豆27中分离得到图3GmMYBZ1和GmMYBZ2在大豆不同部位表达的RT-PCR了两个新的MYB基因GmMYBZ1和GmMYBZ2。分析酵母系统分析结果表明，GmMYBZ1没有明显的Fig.3ExpressionofGmMYBZ1andGmMYBZ2insoybean转录激活功能；而GmMYBZ2具有一定的转录激活功byRT-PCRanalysis能，但其转录激活功能不强。大多数MYB转录因子A：含pBridge-GmMYBZ1的酵母菌株在SD/-Trp上的生长情况；B：含pBridge-GmMYBZ2的酵母菌株在SD/-Trp上的生长情况；C：含pBridge-GmMYBZ1的酵母菌株在SD/-Trp/-His上的生长情况；D：含pBridge-GmMYBZ2的酵母菌株在SD/-Trp/-His上的生长情况；E：含pBridge-GmMYBZ2的酵母菌株滤纸显色情况A:YeastcontainingpBridge-GmMYBZ1growsontheplateofSD/-Trp;B:YeastcontainingpBridge-GmMYBZ2growsontheplateofSD/-Trp;C:YeastcontainingpBridge-GmMYBZ1growsontheplateofSD/-Trp/-His;D:YeastcontainingpBridge-GmMYBZ2growsontheplateofSD/-Trp/-His;E:Colony-liftfilterassayofyeastcontainingthepBridge-GmMYBZ2图4GmMYBZ1andGmMYBZ2蛋白在酵母系统中的转录激活功能分析Fig.4TranscriptionalactivationassayoftheGmMYBZ1andGmMYBZ2proteinbyyeastexpressionsystem 968中国农业科学41卷具有转录激活功能，转录激活功能域一般存在于其氨基酸序列的中间或C-端，常以富含酸性氨基酸，脯氨[24]酸、谷氨酰胺或丝氨酸和苏氨酸为特征。此外，形成同源或异源二聚体也是MYB类转录因子发挥其生理功能的重要方式。如玉米中的C1、矮牵牛中的An2及拟南芥中的TT2，都依赖于特定的[1,19,25]bHLH蛋白的相互作用而发挥转录调节功能。与其它植物MYB转录因子的同源性比对可以看出GmMYBZ1与拟南芥的TT2具有较高的同源性（图7），图5GmMYBZ1和GmMYBZ2蛋白在酵母中的β-半乳糖苷酶活因此，GmMYBZ1蛋白的功能是否也需要bHLH蛋白性检测或其它蛋白因子的协同作用，值得深入研究。Fig.5β-GalactosidaseactivityassayofGmMYBZ1and近些年的研究表明，有些MYB转录因子参与基GmMYBZ2proteininyeast因的转录沉默，如：拟南芥中的AtMYB4、牵牛中的AmMYB308、AmMYB330以及从红草莓果实中分离得到的FaMYB1。这一类MYB转录因子的C-末端都具有一个保守的基序pdLNLD/ELXiG/S和一个锌指结构域。对AtMYB4的这一保守序列的缺失和突变结果分析表明，这个保守的C-末端基序是转录抑制区的一部分。推测这类转录因子的抑制作用很可能是通过与其[26~28]它MYB转录因子竞争DNA结合位点而实现的。序列分析表明，GmMYBZ2的C-端也存在一个pdLNLD/ELXiG/S氨基酸基序和一个锌指结构域，而且，GmMYBZ2与拟南芥的AtMYB4和红草莓的FaMYB1具有较高的同源性（图7）。同时，GmMYBZ2PAL：苯丙氨酸氨基裂解酶；C4H：肉桂酸-4-羟化酶；4CL：4-香豆酰CoA连接酶；CHS：茶尔酮合成酶；CHI：茶尔酮异构酶；F3H：黄烷酮-3-羟化酶；FLS：黄酮醇合成酶PAL:Phenylalanineammonialyase;C4H:Cinnamate-4-hydroxylase;4CL:4-coumaroyl-CoAligase;CHS:Chalconesynthase;CHI:Chalconeisomerase;F3H:Flavanone3-hydroxylase;FLS:Flavonolsynthase图6GmMYBZ2在烟草中的表达对类黄酮代谢相关基因在图7GmMYBZ1和GmMYBZ2与部分植物R2R3MYB蛋白同源性转录水平的影响比较Fig.6EffectoftheexpressionofGmMYBZ2ontranscriptionalexpressionofsomekeygenesintheflavonoidFig.7ComparisonofdeducedaminoacidsofGmMYBZ1andmetabolismpathwayintransgenictobaccoGmMYBZ2withMYBproteinsfromotherspecies 4期杨文杰等：大豆两个MYB转录因子基因的克隆及表达分析969仍然具有一定的转录激活功能，因此推测，GmMYBZ2planttranscriptionfactors.ChineseScienceBulletin,2001,46(4):可能与AtMYB4和FaMYB1相似，即通过与其它MYB271-278.(inChinese)蛋白竞争DNA结合位点而对靶基因的转录进行微调。[3]刘强,赵南明,Yamaguch-ShinozakiK,ShinozakiK.DREB转录MYB转录因子广泛参与植物生理代谢和发育过因子在提高植物抗逆性中的作用.科学通报,2000,45(1):11-16.程的调节，并应答激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗LiuQ,ZhaoNM,Yamaguch-ShmozakjK,ShinozakiK.Regulatory病原菌的侵害。当AmMYB308在转基因烟草中过量表roleofDREBtranscriptionfactorsinplantdrought,saltandcool达时，类黄酮代谢途径中的肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、tolerance.ChineseScienceBulletin,2000,45(11):970-975.(in4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）及肉桂醇脱氢酶（CAD）Chinese)[18][4]黄荣峰,杨宇红,王学臣.植物对低温胁迫响应的分子机理.农业等基因的表达量均有所下降，与此相似，AtMYB4在转基因拟南芥中的过量表达也同样导致了C4H的生物技术学报,2001,9(1):92-96.表达量降低，C4H是芥子酸酯生物合成的关键酶，而HuangRF,YangYH,WangXC.Molecularmechanismofplant芥子酸酯的积累可有效增强植物抵御紫外辐射的能responsetolowertemperature.JournalofAgriculturalBiology,2001,力。试验表明，在AtMYB4转基因植株中，当AtMYB49(1):92-96.(inChinese)被敲除后，C4H的表达量增加，同时伴随着芥子酸酯[5]RiechmannJL,HeardJ,MartinG,ReuberL,JiangC,KeddieJ,AdamL,PinedaO,RatcliffeOJ,SamahaRR,CreelmanR,PilgrimL,合成量的增加，由此看来，AmMYB308和AtMYB4均[20]BrounP,ZhangJZ,GhandehariD,ShermanBK,YuG.Arabidopsis可抑制C4H的表达。半定量RT-PCR检测表明，在表达GmMYBZ2的转基因烟草中，PAL、C4H、4CL、transcriptionfactors:Genome-widecomparativeanalysisamongCHS及FLS等基因的表达均明显下降，由此看来，eukaryotes.Science,2000,290:2105-2110.GmMYBZ2对类黄酮合成中的关键酶具有一定的抑制[6]MartinC,Paz-AresJ.MYBtranscriptionfactorsinplants.Trendsin作用，并以此参与植物类黄酮生物合成的调控，这与Genetics,1997,13:67-73.其序列分析及其转录激活功能的检测结果一致。[7]王栋,李利红,陈志玲,夏桂先.拟南芥根特异表达转录因子GmMYBZ2的其它生物学功能有待进一步深入研究。AtMYB305的鉴定及功能研究.科学通报,2001,46(21):1804-1809.4结论WangD,LiLH,ChenZL,XiaGX.Characterizationandpilot本研究利用RT-PCR及RACE-PCR方法，从大豆functionalstudyofarootspecificMYBtranscriptionfactorof品种中豆27中克隆出了两个MYB基因，序列分析表Arabidopsis.ChineseScienceBulletin,2002,47(4):297-301.(in明，GmMYBZ1和GmMYBZ2均具有两个MYB结构域，Chinese)为典型的R2R3MYB转录因子。其中，GmMYBZ1没[8]CarreIA,KimJY.MYBtranscriptionfactorsintheArabidopsis有明显的转录激活功能，而GmMYBZ2具有较弱的转circadianclock.JournalofExperimentalBotany,2002,53(374):录激活功能；GmMYBZ2在烟草中的表达，可使植物1551-1557.类黄酮生物合成途径中的PAL、C4H、4CL、CHS及[9]KranzHD,DenekampM,GrecoR,JinH,LeyvaA,MeissnerRC,FLS等基因的表达量下降，并以此参与植物类黄酮生PetroniK,UrzainquiA,BevanM,MartinC,SmeekensS,TonelliC,物合成的调控。Paz-AresJ,WeisshaarB.TowardsfunctionalcharacterizationofthemembersoftheR2R3-MYBgenefamilyfromArabidopsisthaliana.ReferencesPlantJournal,1998,16:263-276.[1]Paz-AresJ,GhosalD,WienandU,PetersonPA,SaedlerH.The[10]StrackeR,WerberM,WeisshaarB.TheR2R3-MYBgenefamilyinregulatoryC1locusofZeamaysencodesaproteinwithhomologytoArabidopsisthaliana.CurrentOpinioninPlantBiology,2001,4:myboncogeneproductsandwithstructuralsimilaritiesto447-456.transcriptionalactivators.EuropeanMolecularBiologyOrganization[11]RabinowiczPD,BraunEL,WolfeAD,BrowenB,GrotewoldE.Journal,1987,6:3553-3558.MaizeR2R3-MYBgenes:sequenceanalysisrevealsamplificationin[2]刘强,张贵友,陈受宜.植物转录因子的结构与调控作用.科学thehigherplants.Genetics,1999,153:427-444.通报,2000,45(14):1465-1474.[12]GoodrichJ,CarpenterR,CoenES.AcommongeneregulatesLiuQ,ZhangGY,ChenSY.Structureandregulationfunctionofpigmentationpatternindiverseplantspecies.Cell,1992,68:955-964. 970中国农业科学41卷[13]WeigelD,AhnJH,BlazquezMA,BorevitzJO,ChristensenSK,2002,28(4):267-274.(inChinese)FankhauserC,FerrandizC,KardailskyI,MalancharuvilEJ,NeffM[21]YangCS,LandauJM,HuangMT,NewmarkHL.InhibitionofM,NguyenJT,SatoS,WangZ,XiaY,DixonRA,HarrisonMJ,carcinogenesisbydietarypolyphenoliccompounds.AnnualReviewofLambCJ,YanofskyMF,ChoryJ.ActivationtagginginArabidopsis.Nutrition,2001,21:381-406.PlantPhysiology,2000,122:1003-1013.[22]RossJA,KasumCM.Dietaryflavonoids:bioavailability,metabolic[14]BorevitzJO,XiaY,BlountJ,DixonRA,LambC.Activationtaggingeffects,andsafety.AnnualReviewofNutrition,2002,22:19-34.identifiesaconservedMYBregulatorofphenylpropanoid[23]韩粉霞,丁安林,孙君明.高异黄酮含量大豆新品种中豆27.大豆biosynthesis.PlantCell,2000,12:2383-2394.科学,2002,21(3):231-233.[15]MathewsH,StephanieK,Clendennen,ColbyG,Caldwell,LiuXL,HanFX,DingAL,SunJM.DevelopmentofanewsoybeanvarietyConnorsK,MatheisN,DebraK,SchusterDJ,Menasco,WagonerW,withhighisoflavoneZhongDouNo.27anditscultivationpractices.LightnerJ,WagnerDR.ActivationtaggingintomatoidentifiesaSoybeanScience,2002,21(3):231-233.(inChinese)transcriptionalregulatorofanthocyaninbiosynthesis,modification,[24]JinH,MartinC.Multifunctionalityanddiversitywithintheplantandtransport.ThePlantCell,2003,15:1689-1703.MYBgenefamily.PlantMolecularBiology,1999,41:577-585.[16]ChenBJ,WangY,HuYL,WuQ,LinZhP.Cloningand[25]QuattrocchioF,WingJ,KvanderWoude,SouerE,NdeVetten,Molcharacterizationofadrought-inducibleMYBgenefromBoeaJ,KoesR.Molecularanalysisoftheanthocyaningeneofpetuniaandcrassifolia.PlantScience,2005,168:493-500.itsroleintheevolutionofflowercolor.ThePlantCell,1999,11:[17]LiuCJ,BlountJW,SteeleCL,DixonRA.Bottlenecksformetabolic1433-1444.engineeringofisoflavoneglycoconjugatesinArabidopsis.[26]TamagnoneL,MeridaA,ParrA,MackayS,Culianez-MaciaFA,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesRobertsK,MartinC.TheAmMYB308andAmMYB330transcriptionofAmerica,2002,99:14578-14583.factorsfromantirrhinumregulatephenylpropanoidandlignin[18]BruceW,FolkertsO,GarnaatC,CrastaO,RothB,BowenB.biosynthesisintransgenictobacco.ThePlantCell,1998,10:135-154.Expressionprofilingofthemaizeflavonoidpathwaygenescontrolled[27]JinH,CominelliE,BaileyP,ParrA,MehrtensF,JonesJ,TonelliC,byestradiol-inducibletranscriptionfactorsCRCandP.ThePlantCell,WeisshaarB,MartinC.TranscriptionalrepressionbyAtMYB42000,12:65-79.controlsproductionofUV-protectingsunscreensinArabidopsis.[19]NesiN,JondC,DebeaujonI,CabocheM,LepiniecL.TheEuropeanMolecularBiologyOrganizationJournal,2000,19:ArabidopsisTT2geneencodesanR2R3MYBdomainproteinthat6150-6161.actsasakeydeterminantforproanthocyanidinaccumulationin[28]AharoniA,DeVosCH,WeinM,SunZ,GrecoR,KroonA,MolJN,developingseed.PlantCell,2001,13:2099-2114.O′ConnellAP.ThestrawberryFaMYB1transcriptionfactor[20]陈俊,朱英,王宗阳.水稻MYBcDNA的克隆和表达分析.suppressesanthocyaninandflavonolaccumulationintransgenic植物生理与分子生物学学报,2002,28(4):267-274.tobacco.PlantJournal,2001,28:319-332.ChenJ,ZhuY,WangZY.CloningandexpressionanalysisofMYBcDNAinrice.JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,（责任编辑于竞）