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四川农业大学博士学位论文大豆MYB转录因子基因的克隆及其表达研究姓名：杨文杰申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：杨婉身;唐益雄20070601 摘要通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达，是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。MYB转录因子基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片等器官的形态建成具有重要的调节作用。大豆是重要的油料作物，同时也是蛋白和异黄酮的重要来源，而大多数MYB转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作用。因此，本文以大豆为研究材料，从中分离克隆新的MYB转录因子基因，以期为MYB转录因子在类黄酮的生物合成调控及其胁迫应答等方面的研究提供一定的理论基础。主要研究结果如下：1．根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物，以大豆品种中豆27、吉林3号、淮豆l号及张家口黑豆的叶片为材料，RT-PCR扩增出14个MYB基因同源片段；据此设计基因特异引物，通过RACE-PCR分离克隆出4个MYB转录因子基因，GmMYBZ](D0902862)、GmMYBZ2(D0902861)、GmMYBJd(D0902863)和GmMYBJ7(DQ902864)；氨基酸序列比对表明，这4个基因分别具有两个MYB结构域，为典型的R2R3MYB转录因子基因。2．半定量RT-PCR对这4个基因的组织特异性表达情况进行了检测，结果只在叶片中检测到了GmMYBJ6的表达，在茎和叶中分别检测到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表达，而GmMYBZ2在植物的根、茎、叶及未成熟种子中均有表达。对胁迫应答的检测结果显示，在紫外辐射、高盐及干旱(PEG)条件下，随着处理时间的增长，GmMYBJ6的表达量增加，而GmMYBZ2和GmMYBJ7的表达量降低。3．以基因组DNA为模板对GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYRl6和GmMYBJ7进行了PCR扩增，扩增产物经序列分析表明，GmMYBZI不含内含子，GmMYBZ2含有1个内含子，而GmMYBJ6和GmMYBJ7分别含有2个内含子。4．构建四个酵母效应质粒pBridge-GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2、pBridge,-GmMYBJ6和pBfidge．GmMYRl7，转入酵母菌株AHl09中，并分别在缺少色氨酸的sD培养基和缺少色氨酸、组氨酸的SD双缺陷培养基上筛选阳性转化子。酵母表达表明，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7均具有明显的转录激活功能，p·半乳糖苷酶活性分别为10．35U、28．48U和24．31U，What-man滤纸显色反应均能呈现出明显的蓝色；l 而GmMYBZl酵母转化株的13．半乳糖苷酶活性仅为3．59U，Whatman滤纸显色反应未能呈现出明显的蓝色。5．构建绿色荧光蛋白融合表达载体，基因枪法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达，结果表明，C．maMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均定位于细胞核中，与亚细胞定位预测一致。6．构建植物表达载体pCAMBIA2301．GmMYBZ2、pCAMBIA2301一GmMYBJ6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7，利用农杆菌介导法转化烟草NC89；通过Kan抗性、Gus染色及RT-PCR筛选鉴定阳性苗；RT-PCR检测结果显示，GmMYBJ6可提高类黄酮代谢途径中的苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、肉桂酸4．羟化酶(C4H)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、黄酮醇合成酶ffLS)等关键酶的表达，结果在GmMYBJ6表达的烟草中，总黄酮含量增加；而由于GmMYBZ2和GmMYBJ7抑制了多数类黄酮代谢途径中基因的表达，从而导致转化烟草中总黄酮含量减少。耐胁迫检测结果表明，GmMYBJ6在烟草中的表达，增强了转基因烟草对UV-B、高盐及干旱等非生物胁迫的耐受性。关键词：大豆；MYB转录因子；酵母表达；亚细胞定位；类黄酮；转基因烟草；基因表达调控Ⅱ AbstractTranscriptionfactorsplayanimportantroleinregulationofplantgrowthandphysiologicalmetabolismbyregulationofgeneexpressionatthen'anscriptionlevel，MYBtranscriptionfactorgeneisoneofthelargestfamiliesinplants，whichinvolvedinregulationofsecondarymetabolism，respondingtohormonesandenvironmentalfactors，alsoregulationofcelldifferentiation,cellcyclesandtheformationofleavesandotherorgans．Soybeanisnotonly姐importantoilcropandasourceofproteins．butalsothemostimportantsourceofisoflavonoids．ManyMYBtranscriptionfactorsWerereportedtohaveabilitytoregulatethemetabolismofflavonoids．Inthispaper,somenovelgenesencodingMYBtranscriptionfactorswareisolatedandcharacterizedfromsoybeancultivars．Themainresultsofthisstudyareasfollows：1．ApairofdegenerateprimerswasdesignedaccordingtotheconservedregionswhichencodingtheMYBDNAbindingdomainsinplantMYBgenes．FourteenfragmentswereamplifiedfromleavesofsoybeancultivarsZhongDou-27，JiLin-3，HuaiDou-1andZhangJiaKouBlackSoybeanusingRT-PCR．FournovelgenesencodingMYBtranscriptionfactors，GmMYBZl，GmMYBZ2,GmMYBJ6andGmMYBJ7wereisolatedbyRACE-PCR．ComparisonofdeducedaminoacidsequencesshowedthattheyaretypicalR2R3MYBtranscriptionfactorsbecauseofincludingtwoMYBdomainsrespectively．2．TheexpressionpatternofthefourmembersindifferentorgansWasstudiedusingsemi。quantitativeRT-PCILTheresultsshowedthatGmMYBZ2wasexpressedinroots，stems，leavesandimmatureseedsofsoybean，theexpressionofGmMYBZlandGmMYBJ7WaSdetectedinthestemsandleaves，whereastheexpressionofGmMYBJ6Wasdetectedonlyintheleaves．ExpressionofGmMYBJ6couldbeincreasedunderUV-Bradiation，droughtandhigh-salttreamaent,whiletheexpressionofGmMYBJ6andGmMYBJ6wouldbedecreasedunderthesmetreatments．3．Thefull-lengthDNAsequencesofGmMYBZl，GmMYBZ2，GmMYBJ6andGmMYBJ7werealsoamplifiedusinggenomicDNAastemplates．TheresultsindicatedthatGmMYBZ2containsoneintron，GmMYBJ6andGmMYBJ7containtwointromrespectively,whereasthegeneGmMYBZllacksintron．IⅡ 4．TherecombinantvectorspBridge·GmMYBZI，pBridge—GmMYBZ2，pBridge—GmMYBJ6andpBridge—GmMYBJ7wereconstructedandtransformedintotheyeaststainsAHl09，thenthepositiveyeasttransformantswel"eselectedusingtheSD／-TrpselectivemediumandtheSD／-Trp／-Hisselectivemedium．ThetranscriptionalactivationofCrmMYBZl，GmMYBZ2，CmLMYBJ6andC_anMYBJ7proteinsWasconfirmedbytheyeastsystem。andits13-galactosidaseactivityWasdetected嬲3．59U，10．39U,28．48Uand24．31U，respectively．Theresultsofthecolony-liftfiltersassayindicatedthattheyeasttransformantsofGmMYBZ2，GmMYBJ6andGmMYBJ7showedaclearblue，whereastheyeasttransformantsofGmMYBZIdi血’t．5．Thegreenfluorescentproteinexpressionvectorsp163-GFP·GmMYBZ2、p163-GFP·GmMYBJ6andp163—·GFP··GmMYBJ7wereconstructedandtransformedintotheepidermalcellsofonionviaparticlebombardmentalmethod．TheresultsofinstantaneousexpressionshowedthatCanMYBZ2、GmMYBJ6andGmMYBJ7proteinsallwerelocalizedincellnucleus，whichwasconsistentwiththepredictionofthesubcellularlocalization．6．GmMYBZ2、GmMYBJ6andGmMYBJ7weretransformedintotobaccoNC89withAgrobacteriumLBA4404containingtheplantexpressionvectorspCAMBIA2301一GmMYBZ2，pCAMBIA2301·GmMYBJ6andpCAMBIA2301一GmMYBJ7,respectively．ThepositivetobaccotransformantswereselectedusingMSmediumcontainmgkanamycin,GnsactivityassayandRT-PCR．Semi-quantitativeRT-PCRanalysisindicatedthatGmMYBJ6couldimprovetheexpressionofsomeflavonoidbiosyntheticgenes．suchasPAL(Phenylalanineammonialyase)，CAH(cinnamate-4-hydroxylase)，4CL(4-coumaroyl·CoAligase)，CHS(ChalconeSynthase)，CHI(chaleoneisomerase)，F3H(flavanone：3-hydroxylase)，andFLS(flavonolsynthase)，resultingtheincreaseofthetotalflavonoidlevels．Whereas，OVerexprssionofGmMYBZ2andGmMYBJ7coulddecreasethetotalflavonoidlevelintheWansgenictobaccoplantsduetotherepressionofthegenesinflavonoidbiosynthesis．Resultsofanti-stressexperimentsshowedthattheexpressionofGmMYBJ6couldimproveresistancetoUV-Bradiationanddroughtoftransgenictobaccoobviously．Keywords：Soybean；MYBtranscriptionfactor；Yeastexpression；Subcellularlocalization；Fiavonoids；Transgenictobacco；GeneexpressionandregulationⅣ 符号说明V 论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：1．扔支互叩年二月刁日关于论文使用授权的说明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：拓互互裼蝴川年／月≯7日Z／砷7年多月7日 四川农业大学博士学位论文第一章第一章文献综述1植物转录因子研究转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过他们之间以及其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转录【l】。1．1植物转录因子的特征与种类典型的转录因子一般包括DNA结合区、转录调控区(激活区或抑制区)、寡聚化位点和核定位信号四个功能域。植物转录因子种类极其繁多，根据DNA结合功能域的结构，转录因子可分为以下几类：bHLH(碱性螺旋一环一螺旋)、bZIP(碱性亮氨酸拉链)、homeodomain蛋白、MADS-box蛋白、zinc-finger蛋白、MYB蛋白、AP2／EREBP蛋白、HSF蛋白和HMG蛋白等【2】多个不同家族，目前，对拟南芥转录因子的研究比较深入，拟南芥中已经分离的以及根据保守序列预测的转录因子总数达到1553个，占其整个基因组基因总数的5．9％左右，大约是酵母和线虫的1．7倍，是果蝇的1-3倍，它们很少串连或成簇分布，而是散布在整个染色体组上【3】。转录调控区分为激活区和抑制区，其相应的功能为激活或抑制转录。目前对抑制域的特征了解很少，但对激活域的研究比较清楚，激活域包括三种类型，一是类似于GCN4基因的酸性域(acidicactivationdomain)，它们的氨基酸排列成两性的∞螺旋，并使其中酸性氨基酸都展现在Ct．螺旋的同一表面上，这种结构特征是转录激活的必要条件。根据有关资料的统计数据，从酵母和人体中分离出来的大多数转录因子，都共同具有酸性激活域。但是，也有一些报告指出，转录因子中还存在着另一类非酸性的激活域。如类似于人类印J基因的富含谷氨酰胺的转录激活域(glutamine-richactiva-tiondomain)。在组成型表达的转录因子Spl的两个最强的激活域中，谷氨酰胺几乎占了25％，而带负电荷的氨基酸所占的比例则非常低。当这个区域缺失时，此激活域激活转录的功能也就随之消失了，由此证明，这个富含谷氨酰胺的基序是这些激活域激活靶基因转录的必要条件。与以上两种类型的转录因子激活域不同，与CCAAT元件结合的组成型转录因子CTF／NTl则具有另一种转录激活域。它位于转录因子的C- 四川农业大学博士学位论文第一苹端，其中酸性氨基酸及谷氨酰胺所占比例都很低，但却含有大量的脯氨酸，约占该区域氨基酸总数的l／4，这种转录激活域称为富含脯氨酸的转录激活域(proline—richactivationdomain)。同其它类型的转录激活域一样，当此种激活域同另一种转录因子的DNA结合域连接时，便具备了激活靶基因转录的能力。目前，已在许多转录因子中鉴定出了富含脯氨酸的激活域，如原癌基因蛋白质产物fun和AP2以及Oct-2等。此外，还有些转录因子富含丝氨酸和苏氨酸口-习。但是，有研究表明，有些转录因子并不符合上述特点，而是在其激活域中富含异亮氨酸【6】，甚至，由高亲水性的、带正电的碱性氨基酸组成【7】。由此看来，植物转录因子的激活域种类繁多，其作用机理也有待进一步深入研究。核定位信号(NLS)是指转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的区域。一个转录因子可以包含一个或多个核定位信号区，它们不规则地分布在转录因子中，如玉米的02转录因子的核定位信号还存在于该蛋白的其它功能区域内。而核定位信号与DNA结合域独立发挥作用，目前，这种现象已经在水稻的GT-2基因和玉米的02基因中得到证实【8一。寡聚化位点是指不同转录因子间相互作用的区域，大多与DNA结合区域相连并形成一定的空间构象，它们的核苷酸序列也比较保守。AF2／ERF类转录因子AP2／ERF类转录因子是植物中所特有的一个庞大的转录因子家族，在拟南芥中有147个成员，水稻中大约有139个ERF成员。Sakuma等‘101对拟南芥中的145个AF2／ERF成员进行了分类，其中121个属于ERF亚族，Nakano等叫研究认为有122个属于ERF亚族。ERF类转录因子最早是作为烟草与PR基因启动子中顺式作用元件GCC盒的结合蛋白分离得到的【12l，主要参与调控植物对乙烯、干旱、高盐和低温等胁迫应答反应【3】。近来的研究表明ERF类转录因子不仅调控植物病害相关的应答，还参与了植物渗透胁迫和ABA应答、生长发育以及不同信号途径问相互作用等的调控【131。bZIP类转录因子bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中。bzm类转录因子的共同特点是：N-端含有与DNA特异序列相结合的碱性结构域；参与寡聚化作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连，转录因子常以二聚体的形式结合DNA；C．末端含有酸性激活区【141。2 四川农业大学博士学位论文第一章bZP类转录因子识别的核心序列为ACGT的顺式作用元件，如CACGTG(G盒)、GACGTC(C盒)、TACGTA(A盒)等，一些受光或ABA诱导的基因的启动子区都含有·这些元件。其中G盒元件普遍存在于ABA、生长素、茉莉酸和水杨酸诱导的基因中，它还是光诱导基因中最常见的顺式作用元件之一。锌指(zinc-finger)蛋白锌指结构最初是在研究爪蟾(Xenopuslaevis)5S核糖体RNA基因调控5s基因转录时发现的。锌指蛋白的氨基酸序列中存在着半胱氨酸和组氨酸(Cys-N2-Cys-N12-His·NrI-Iis)有规律的重复。在这一功能区中，大约每30个氨基酸就有一对半胱氨酸和一对组氨酸，前者在反平行折叠中，后者在0‘．螺旋中，它们能与锌离子形成配位键，一共有9个重复单位，形成9个手指状结构【15，1神。至今，已发现了三类锌指结构蛋白。一类是类似TFIIIA的锌指成员，如哺乳动物细胞的sPl；第二类锌指结构蛋白类似于HTH结构，由两个环．螺旋结构组成，命名为“双环．锌．螺旋”(doubleloop-Zn-helix)，如糖皮质激素受体蛋白；第三类锌指结构蛋白是含有两对半胱氨酸，而不含组氨酸，每个DNA结合域有6个半胱氨酸和2个锌离子，酵母的DAL4就具有这类结构。Tjaden等【1-q发现了具有锌指结构的转录因子3AFl。它可以结合在豌豆RBCS3A基因的启动子区中含有GATA的序列上，从而激活基因的转录。有报道显示，在番茄、烟草中也发现了这类能结合GATA的转录因子。有人认为，这类锌指蛋白应属于第四类锌指结构。MADS盒结构MADS盒的定义来源于MCMI、AGAMOUS、DEFlClENS、SRF4个蛋白的保守区。MADS盒基因在植物的花发育中起着重要作用‘18，191。植物体中的APJ、AP3、Ⅳ和AG等MADS盒基因，不仅影响特异器官形成的后期发育，而且对特异的花器官分生组织的形成也具有重要作用。此外，在植物的MADS盒蛋白AP3、AG-2、APl中还有一个长度66个氨基酸残基组成的同源区域，称为K盒，推测此盒与蛋白之间的相互作用有关。WRKY转录因子WRKY蛋白家族的各成员都含有l-2个WRKY结构域。该结构域包括大约60个氨基酸残基，N端的七肽WRKYGQK十分保守，C端有一个C2H2或C2HC的锌指结构。研究显示，在拟南芥中大约有74个WRKY家族成员t20l。水稻中大约有lOO3 四川农业大学博士学位论文第一苹个【2“221。腿Ky基因的表达受生物或非生物胁迫诱导。真菌、细菌、病毒侵染，水杨[1受(salicylicacid,SA),及其类似物和H202处理等均可导致黼基因的表达上升叫o】。此外，WRKY蛋白对很多非生物胁迫如伤害阢32]、冷(冻)口孓351、干旱、高盐、热及氧化胁迫等口5。3明均可产生应答。表1．1植物中主要的转录因子家族Table1．1Majorfamiliesofplanttranscriptionfactors4 四川农业大学博士学位论文第一章MYB／MYC转录因子MYB转录因子是一类广泛存在的保守的转录因子，由三个不完全的重复组成，形成螺旋．转角一螺旋结构，在每个重复中，每18．19个氨基酸存在3个保守的色氨酸残基，有助于形成二级结构，提供一个有功能的MYB结构域。植物MYB相关的基因组成了一个大家族，参与植物各种各样的功能[40l。MYC转录因子含有两个相连的基本亚区，其中碱性氨基酸与DNA结合有关，螺旋．环．螺旋区CollLh")参与二聚体的形成。1．2植物转录因子的研究方法1．2．1植物转录因子基因的克隆分离克隆转录因子基因是分子生物学研究中的一项基础性工作，基于转录因子具有表达丰度低、家族成员DNA结合序列保守等特点，目前，比较常用的研究方法包括以下几种：1．文库筛选法建立高质量的基因组成cDNA文库，以感兴趣的转录因子基因为探针，经过噬菌体铺板、转膜、标记探针、杂交、压片、放射自显影等多个步骤进行杂交筛选，从而获得目标基因。如水稻的GAMYB基因、大麦的hvGAMYB基因及苜蓿的MBF基因等【41，42】。2．基于序列同源的PCR扩增克隆方法‘转录因子一般含有比较保守的DNA结合序列，根据某一家族中的保守区域，可以设计合成简并性寡核苷酸引物，通过PCR扩增出目的转录因子基因片段，并结合RACE等方法进一步获得完整的转录因子基因，利用这一方法已克隆到玉米、拟南芥、棉花、兰花等植物中的多个MYB转录因子基因f43删。3．转座子标签法与RNA差异显示法(DDRT-PCR)相结合的克隆方法首先利用转座子标签法，获得大量的突变体材料，根据某些转录因子家族成员的功能分析，推测某类转录因子可能与该突变体表型变异相关时，进而根据转座子保守序列和转录因子的保守序列设计两端引物，通过野生型和突变体之间DDRT-PCIL差异基因序列的分析，克隆获得目的转录因子基因。Shin等利用这种方法获得了拟南芥AtMYB21基因闱。4．酵母单杂交 四川农业大学博士学位论文第一章—■蔓舅舅量曼曼皇皇曼曼皇曼曼曼皇曼量寡詈目_置■■——■童量皇曼喜曼皇量皇篁■|曼皇量量■————邑曼曼—鼍量皇曹■葺■皇曼曼曼曼曼曼薯曼鼍lip!酵母单杂交方法(yeastonchybridmethod)是通过转录因子与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达来分离克隆转录因子基因。该方法也是在细胞内(invivo)分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。将已知的特定顺式作用元件构建到基本启动子(minimalpromoter,l。min)上游，Pmin下游连接报告基因。进行eDNA融合表达筛选文库时，编码目的转录因子的DNA融合表达载体转化进入酵母细胞后，其编码产物(转录因子)与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达，根据报告基因的表达筛选出与已知顺式元件结合的转录因子基因。随着酵母单杂交系统的不断发展和完善，近年来该方法已被广泛用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子。利用此方法已经分离克隆到bzD、ARF-1、DREB2A，2B及ABF等转录因子[47-o]，2002年，齐楣等用此方法从胡萝h体细胞中分离得到一个生长素应答元件结合因子【斓。实践证明，酵母单杂交是研究蛋白质与DNA相互作用及筛选新基因的行之有效的方法。1．2．2植物转录因子功能分析方法1．瞬时表达分析瞬时表达分析可以快速提供转录因子的DNA结合特性和转录调控特性(转录激活或抑SU)等信息。根据所用的材料，可以植物细胞瞬时转化分析，酵母细胞瞬时转化分析和动物细胞瞬时转化分析等【511。2．基因功能缺失自然突变体的筛选概率极低，目前常利用反义抑制、共抑制、插入突变和RNAi等方法产生功能缺失突变体，通过比较目的基因功能部分或全部丧失的植株与野生型植株在表型、生理代谢和基因表达上的差异，进一步分析该基因的功能，但这几种方法各有利弊。反义抑制和共抑制方法鉴定转录因子功能的研究已经有多篇成功报道，xie等【52】的研究证明，拟南芥的转录因子NACl能够激活其下游生长素应答基因DBP和AIR3韵表达，并促进侧生根的发育。ke【s31利用共抑制的方法证明，编码拟南芥锌指蛋白的转录因子基因HOSl，以核质互作的方式参与冷信号的负调控作用。但是这种方法具有局限性，即抑制作用仅发生在转基因植株的某些个体中，而研究一个转录因子需培育大量的转基因植株，工作量大，并且可能导致转基因植株的致死或强烈的多重效应，很难从表型鉴定出所需的转基因植株，因此，必须结合某些生化功能的深入分析，6 四川农业大学博士学位论文第一苹才能准确定论某个转录因子的功能。利用T-DNA插入法已成功分离鉴定出拟南芥转录因子MYB家族的突变体，该家族包括90多个成员，利用不同的转座子标记群体和T-DNA标记群体反向筛选了其中的73个基因，结果得到了36个基因的47个插入突变体，这些确定的突变体株系将可用于R2R3MYB基因家族中各个成员特殊功能的详细分析Is41。但插入突变体分析转录因子的功能的局限性在于植物中有些基因是多拷贝的，有的甚至紧密地串连在一起，通常不易得到目标基因的纯合突变体。RNAifRNAinterference)技术最早在线虫中应用，是指通过反义RNA与正义RNA形成双链RNA特异性抑制靶基因表达的现象。现指人为引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因的mRNA降解，达到了阻止基因表达的目的。Fernandez等[551和Chuang等[50"1利用该技术对拟南芥MADS家族(APl和AGAOUS)和bZIP家族(pAN)一些成员功能的研究。随着对RNAi技术抑制相应内源基因表达机理的深入研究，该技术将成为获得基因功能缺失型突变体最有潜力的方法之一。3．基因功能增加利用组成型和诱导型启动子表达来创造转基因植物，筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与野生型植株及基因功能缺失突变体在表型、生理代谢和基因表达上的差异，分析该基因的功能。在这方面已有许多成功的报道。超表达HvGAMYB的转基因大麦，出现花药变小、长度变短以及颜色变浅等形态变异，甚至有时会出现不育，预示HvGAMYB与花药发育有关；超表达AtMYB21的拟南芥会出现茎、花瓣、叶片和心皮等形态变异，说明它可能参与了花形态建成的某些调控【5”。拟南芥基因组测序结果表明，转录因子占其整个基因组基因总数的5．90左右，另外还发现同一家族内不同成员之间存在功能重叠的现象，如控制拟南芥花分生组织建成的转录因子SEPl、SEP2和SEP3之间存在一定的功能互补作用，单个基因发生突变时表型没有明显变异‘钿。综上所述，通过不同的研究方法，对植株表型、生理代谢、基因表达等方面进行综合分析，才有可能获得某个转录因子的完整功能。1．3转录因子自身的表达调控转录因子基因与其它结构基因一样，受到转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平的多种层次的调控，但转录因子基因自身表达的调控主要发生在转录水平上。研究表明CJ的表达受ABA或光照等因素的正调控[59,60l。7 四川农业大学博士学位论文第一章不仅如此，转录因子基因的表达还受到转录后水平的调控。如水稻MYB7的mRNA存在两种剪接方式：一种属于完全剪接形式，翻译成正常的MYB蛋白；另一种是第一个内含子滞留的Mybleu形式，它翻译成不完全的DNA结合域和30个连续的亮氨酸串，缺少转录激活域和核定位信号区，因此表达产物没有功能，但与正常的MYB蛋白竞争结合bHLH型Opaque2，形成二聚体，水稻通过这两种剪接方式来应答缺氧胁迫，即缺氧程度不同，两种MYB7的mRNA丰度也不同【611。此外，磷酸化作用也影响转录因子自身的核定位、与DNA的相互作用及转录调控功能。核定位信号(NLS)首先通过与受体蛋白NBP(NLS-bindingprotein)的相互作用，再与位于核孔处的亲核蛋白结合，然后借助与亲核蛋白的转移通过核孔复合体。没有核定位信号的转录因子则靠与具有核定位信号的转录因子相互作用进入细胞核。转录因子的入核过程受到转译后磷酸化修饰及分子间的相互作用的影响，NLS及其旁侧序列的磷酸化是调节转录因子入核的重要的方式【62】。对DNA结合域的影响一般发生在磷酸化位点上，如果磷酸化位点在转录因子的DNA结合域或在其附近，蛋白质与DNA的磷酸化位点之间会彼此排斥；如果磷酸化位点与DNA结合域相距较远，磷酸化作用很可能是通过改变蛋白质的构象而间接影响转录因子与DNA的结合。磷酸化介导的转录调控机制在于：增强转录因子激活域与基础转录元件或转录起始复合物之间的亲和力，形成活性较高的以负电荷o【螺旋为特征的“酸性团”区，从而改变转录激活域的空间构象，或通过磷酸化作用促使转录因子与阻遏蛋白解离，而产生正调控功能，目前，磷酸化对转录复合物的抑制作用在高等植物报道极少。总之，转录因子对植物表达调控的影响也是多方面的，往往需要不同转录因子之间的共同作用，研究证明，大多转录因子之间可以通过寡聚化位点与其它转录因子相互作用，以相互干扰，相互协同或复合应答等多种形式，共同调控多个靶基因的转录。不同情况下，同一转录因子会表现出激活和抑制双重功能，如玉米转录因子CPl(viviparous1)，既能抑制大麦0‘．淀粉酶基因的表达，又能激活小麦EM和玉米CJ基因的转录，但激活机制有所不同【神，631。2．植物舳转录因子研究进展通过转录因子在转录水平调控目的基因的不同时空和不同条件下的表达水平，是植物对其生长发育及生理代谢的一种重要的调控方式。在植物体中存在大量的转录因子基因，据推测拟南芥中至少有1553个转录因子基因，约占其基因总数的5．9％【12】。 四川农业大学博士学位论文第一章1982年Klempnaner等在禽成髓细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus)中鉴定出一个能直接导致急性成髓细胞白血病(acutemyeloblasticleukemia)的癌基因，称为v-MYB。之后在正常动物细胞中也发现了相应的原癌基因c-MYB，随后的研究结果表明，v-MYB、e-MYB蛋白都定位在细胞核中，与核基质和染色质紧密相连，而且都具有DNA结合活性和转录调节功能‘64，651。1994年，Ogata等利用核磁共振OqMR)最终确定了ff-MYB蛋白的螺旋一转角一螺施aelix-turn-helix，HnI)DNA结合域空间结构嘲。2．1植物中的MYB转录因子的结构特征与分类MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，它们都具有高度保守的DNA结合域——MYB结构域。每个MYB结构域约含有50．53个氨基酸残基，其中，有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18．19个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋-转角一螺旋(HTH)的构型起着非常重要的作用。MYB蛋白借助此结构插入靶DNA分子大沟与目的DNA结合，研究表明，每一重复子的C．端螺旋是结合DNA的识别螺旋，而R3的识别螺旋特异性地与其识别序列的核心结合，而R2的识别螺旋与核苷酸的结合专一性较差嘲，有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸或疏水氨基酸所取代；植物MYB蛋白R3重复子中第一个色氨酸残基通常为苯丙氨酸(Phe)或异亮氨酸(meu)所代替。此外，大多数MYB转录因子在c．端与DNA结合域之间都具有一个富含酸性氨基酸的转录激活功能域嗍。根据所含MYB结构域的数目，植物中的MYB类转录因子可分为单一MYB结构域蛋白、2个重复MYB结构域蛋白和3个重复MYB结构域蛋白三个亚类。拟南芥的LHY、CCAI、CPC和RTBPI，水稻的RTBP21、玉米的IBP21等均为单一MYB结构域蛋白，它们可能是一类重要的端粒结合蛋白，在维持染色体结构的完整性和调节基因转录上起重要作用【69，70】。1999年，Braun和Grotewold从拟南芥中鉴定出两个R1R2R3MYB基因【71】，2000年，Kranz等又在苔藓、蕨类、单子叶和双子叶植物中发现了RIR2R32MYB基因，而且在每个物种的基因组中都只存在2．3个成员【碉。RIR2R3亚类成员含有3个MYB结构域，与动物、真菌中的R1R2R3MYB蛋白高度同源，主要参与细胞周期的控制和细胞分化的调节【731。植物体中绝大多数MYB蛋白具有2个重复的MYB结构域0也R3)，推测在拟南芥中有130多个彪'R3M阳基因，约占拟南芥基因组编码基因的0．2--0．6％【74，75】玉米、牵牛9 四川农业大学博士学位论文第一苹及棉花分别约有80个、30个和200个MYB基斟43·徊，这类转录因子参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用。1998年，Kranz'等依据DNA结合域的特点，通过系统进化树分析，将拟南芥的MYB家族分成22个亚群【醯】；SWacke的进一步研究表明，可将MYB家族分出更多的亚群(图1．1)rM】。亚群的系统分析不仅揭示了不同成员之间的亲缘关系，也为某些未知功能的肘憎基因的研究提供了一些线索。研究表明，同一亚群的成员具有相似的功能，如属同一甄群的AtMYB91／ASl和AmMYB都是器官原基Knox基因表达的负调控因子册；第15亚群的成员AtNYB66／WER和AtMYB0／GLl具有相似的调节表皮细胞分化的功能，但由于两个基因的表达具有组织特异性，AtMYB66，wER是根表皮细胞分化的调节因子；而AtMYB0／GLl是叶片表皮细胞分化的调节因子。尽管如此，这一假设仍然需要更多的肠糟基因的功能研究来证实。2．2植物MYB转录因子的起源与进化1996年，Lipsick提出了一个MYB基因的进化模型ITS]，由于后来又在植物中发现了R1R2R3MYB基因，Jin和Martin对此模型进行了适当的补充【79】。该模型认为大约在lO亿年以前产生了MYB结构域，MYB结构域通过复制或3倍扩增，产生了含有2．3个MYB结构域的MYB基因，而Rl的丢失导致了R2R3MYB蛋白的产生嗍。这些MYB基因在生物体内又经过扩增产生了现有的MYB基因，这种全基因的扩增程度在动物和真菌中相对较低，只产生了为数不多的MYB基因，而在拟南芥和玉米中均产生了100个以上的MYB基因。而Jiang等人【蚓对来自38个物种的139个MYB蛋白进行了比对，并构建了含有317个独立的MYB序列的进化树，研究结果发现，MYB结构域的进化具有较大的区别，但哪个是最古老的MYB结构域尚不清楚；而R2R3MYB基因和RIR2R3MYB基因在动植物分化之前就已经在真核生物中出现了，他们推测R2R3MYB基因在古老的基因扩增中获得了R1，从而演化出了R1R2R3MYB基因，此结论与Lipsick等人建立的MYB基因进化模型不同。对植物MYB基因进化的研究结果显示，各植物物种中MYB基因的数目和功能的多样性与植物体发育和代谢途径的复杂性几乎平行【431。Rabinowicz等(1999)指出R2R3MYB基因的扩增是显花植物所特有的现象。认为大部分的R2R3MYB基因的扩增发生在单双子叶植物歧化之前，而在单子叶植物内部又发生了很重要的R2P,3MYB基因扩增事件。并认为植物通lO 四川农业大学博士学位论文第一章过选择性地使用R2R3MYB基因来控制它们的特殊生理功能。MYB类转录因子在植物漫长的进化过程中巧妙地完成了保守性和多样性的统一，可能是植物为适应和应答环境的变化而产生的一类富有弹性调节机制的调节蛋白。图1．1拟南芥MYB家族的系统分类(Stracke，2001)Fig．1一lClassificationofTheMYBproteinfamilyinArabidopsia 四川农业大学博士学位论文第一苹2．3植物姗转录因子的功能2．3．1参与对植物激素的应答植物激素是调节植物生命活动极为重要的生物活性物质，可分为生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯等五大类。植物的激素应答反应及植物体内相关的信号传导途径的研究，是植物生理和分子生物学研究的热点。拟南芥中雕JAtMYB2基因是第一个被发现受ABA诱导表达的R2R3MYB基因。AtMYB2蛋白与bHLH类蛋白RdBPl相互作用，协同调节Rd22基因的表达。Abe等【81】认为AtMYB2蛋白和RdBPlbHLH蛋白的互作可能是植物体内除了bZIP／G-BOX之外的另一条应答ABA的途径；此外，Cpm5、Cpm7和Cpml0蛋白也参与植物柬jABA和干旱的应答。HvGAMYB基因是最早在大麦糊粉层cDNA文库中发现的MYB转录因子基因家族的一个成员，该基因以单拷贝形式存在，其蛋白能够与洳淀粉酶基因启动子上游．174到．108bp处的TAACAAA元件结合【4”，Northern-Blot分析表明，它受GA3正调控，并同时激活下游高度磷酸化的a·淀粉酶的表达。RNA免疫沉淀技术分析证明，此基因在花药中受GA的影响不如在胚乳中明显，而超量表趔S．HvGAMYB的转基因大麦植株的表现与施加外源赤霉素相似，当HvGAMYB蛋白的表达量增加时，花药将会变小，同时颜色变淡；当HvGAMYB蛋白的表达量超过非转基因对照株的四倍时，花药则不能正常开裂，最终，导致雄性不育【57】。此外，水稻的OsGAMYB：及拟南芥的AtGAMYB33、AtGAMYB65、AtGAMYBl01等基因均与HvGAMYB同源，并参与对赤霉素的应答。尽管还没有鉴定出应答IAA、乙烯及细胞分裂素的MYB类转录因子，但是l矗a皿等【6町用乙烯、IAA、ABA、GA3和细胞分裂素分别处理拟南芥，通过“反向Northern印迹”方法研究了拟南芥中74个R2R；枷瞎基因的表达情况，发现大约有11个彤彤M功基因受ABA诱导，9个受IAA诱导，6个受乙烯诱导，5个受细胞分裂素诱导，1-tp受GA3诱导。这些初步的结果表明植物中的R2R3MYB转录因予可能广泛地参与对植物激素的应答。2．3．2控制植物细胞的形态和模式建成植物MYB转录因子另一个研究得较清楚的功能是控制细胞的形态和模式建成(patt锄formation)。在这个领域中取得的进展大都归功于大量的拟南芥根毛和表皮毛突变体研究。目前从拟南芥中克隆的与根毛发育有关的基因有TTG、CPC、WER和GL2。刀’G基因编码WD40类蛋白，CPc基因编码只含一个MYB结构域的MYB蛋白，WER基因编码一个R2R32MYB蛋白，GL2编码一个同源异形蛋白(home．domain12 四Jfl农业大学博士学位论文第一苹protein)。除此之外，还发现一个与玉米R蛋白类似的bHLH蛋白也参与根毛的特化，但此基因尚未被克隆。Lee和Schiefelbein综合根毛突变体的研究结果，提出了一个调节根表皮细胞发育的分子模型，认为两个MYB类转录因子CPC蛋白和WER蛋白是决定根表皮细胞命运的关键因素【蜊。CPC蛋白和WER蛋白可能与同一个类似R的bHLH蛋白相互作用。WER蛋白与bHLH蛋白相互作用产生具有转录激活功能的蛋白复合体，一方面通过结合在GL2基因启动子区MYB蛋白结合位点和MYC类蛋白结合位点激活GL2基因的表达，抑制根毛的形成而产生不成毛细胞；另一方面在不成毛细胞中调节与细胞分裂和成熟相关基因的表达，抑制细胞的分裂。而CPC蛋白与bHLH蛋白的相互作用产生无活性的蛋白复合体，不能激活GL2基因的表达，从而使细胞分裂，形成突起，进而发育成根毛，产生成毛细胞。此模型表明根表皮细胞的形态建成是不成毛细胞中WER蛋白相对高的活性和成毛细胞中CPC蛋白相对高的活性协调作用的结果。可见MYB类转录因子在根毛形成中起了决定性的作用。在拟南芥下胚轴表皮细胞特化成气孔的过程中，MYB蛋白也发挥了与根表皮细胞特化过程中相同的作用。拟南芥中另一个表皮细胞特化的例子是表皮毛的形成。拟南芥中叶表皮毛的形成与根毛形成非常类似，也是由卯1G、GL2、GLl、聊和GL3基因控制的【83】。GLl编码一个R2R3MYB转录因子，GL3编码一+bHLH类转录因子。GLl蛋白通过与GL3蛋白相互作用，结合到GL2基因启动子区上，激活GL2基因在叶表皮细胞中表达，从而控制叶表皮细胞的特化。植物MYB转录因子不仅参与根毛和茎表皮毛建成的调控，还参与了其它组织器官的形态建成。shin研究证明，AtMYB21不仅是队L的正调控因子，同时它的异位表达也会导致胚轴细胞伸长缓慢、幼苗致死、转基因植株叶片和花瓣变小、心皮形态变异等一系列形态变异嗍。胚胎发育后期新生长点的建立使植物呈现多种形态的花组织，这一过程起始于营养生长和生殖生长分支的分生组织，许多重要的转录因子参与了这一过程的调控。2002年，schm娩等利用图位克隆的方法得到了编码315个氨基酸的尉玩d基因刚，检测表明，它在茎尖、小花芽和腋芽中表达大量较高，推测参与植物侧生组织的形成。此外，还发现了控制拟南芥种皮黏液沉积和释放所必需的AtMYB61和参与花药形态建成的彳纨fyB2拜口硒，G!栅等转录因子基因瞰-1171。2．3．3调控植物类黄酮代谢2．3．3．1类黄酮的种类、分布及其生物功能 四川农业大学博士学位论文第一苹类黄酮是植物体中一类重要的次生代谢物，广泛存在于从苔藓植物到被子植物的各种植物类群中【明，迄今为止，已发现了6000多种类黄酮，而且这一数字仍在增长【黯1。类黄酮都具有共同的基本结构——黄烷核心，它是由一个三碳环(C环)连接着两个六碳芳香环(A环和B环)形成，根据c环的不同修饰以及B环的不同连接方式，可以将其分为黄烷酮、异黄酮、黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花青苷等不同的结构类群。黄酮类次生代谢物具有多种生物学功能，在植物基础生理代谢中发挥着极为重要的作用。类黄酮可以使植物的花、果实和种子具有各种不同的颜色，以此吸引传播花粉和种子的昆虫及动物；同时，还具有保护植物体免受紫外辐射伤害、抵御微生物病虫害、影响植物的生育力和花粉萌发率等功能f矧。此外，类黄酮作为人类食物中的组成成分，对人体的健康也具有非常重要的影响。据报道，类黄酮具有抗氧化、抗癌、降低胆固醇、抑制和预防冠心病以及其它老年性疾病的作用‘扑蚴，其中，仅存在于豆科等少数植物种类中的异黄酮，是许多重要的植物抗毒素前体，更是极富医疗和保健价值；由于类黄酮具有类雌性激素的作用，因此，对妇女尤其是更年期妇女的身体健康非常有益；Shirwaikar等对卵巢切除的患有骨质疏松症的模鼠进行了实验，结果证实，类黄酮具有较强的抗骨质疏松的作用∞】；另外，类黄酮与信号转导途径间的相互作用可导致相关基因的表达发生变化，进而影响细胞的生存、增殖和凋194,95]。因此，对类黄酮代谢及相关作物的研究和培育，引起了人们极大的兴趣和关注。随着对植物次生代谢研究的不断深入，植物次生代谢基因工程也逐渐发展成为具有广阔应用前景的热点研究领域，人们力图通过对植物次生代谢途径进行遗传改良，培育出大量合成和积累目标次生代谢物的植物品种，服务于社会、造福于人类。2．3．3．2类黄酮的代谢途径及其调控植物次生代谢的研究中，在基因水平上研究最清楚的是类黄酮的生物代谢途径，它是苯丙烷类代谢途径中的一个重要分支，此代谢途径由多种转录因子参与调控，MYB类转录因子是其中之一。如图1．2所示，大多数类黄酮生物合成的前体是分别来自糖代谢和苯丙氨酸途径的丙二酰辅酶A和香豆酰辅酶A，在查尔酮合成酶(ChaleonesynthaseCHS)催化下，生成查尔酮。查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成基因中最先被克隆的，目前，该基因已从许多植物中被克隆出来，人们对其表达也进行了详细的研究。而且，查尔酮合成酶基因已成为植物基因工程中非常重要的靶基因，降低或共抑制其表达将会导致植物的花由于缺乏类黄酮而变为白色，同时，类黄酮途径受阻还会导致雄性不育等多方面14 四川农业大学博士学位论文第一章的影响[蛔。3x丙二酰coA大豆黄素●—一异甘草素◆cⅢ甘草素卜大豆苷II雕{胍I异戊烯黄酮芥子酸酯木质素I菜豆双氢异黄酮◆DFR无色花青苷I3．羟基花青苷IUFG花青昔＼I浓缩单宁图1-2类黄酮代谢途径F培l-2ThepathwayoftheFlavonoidBiosynthesisPAL,Phenylalanineammonialyase；C4H,cinnamate．4-hydroxylase；4CL,4-coummuyl-CoAligase；CHS，ChalqA)neSynthase；CI-m,chalconereductase；CHI，chalconeisomerase,AS，aureusidinsynthase；FNS，flavonesynthase；IFS，isoflavonesynthase；STS，stilbenesynthase；F3Hflavanone3-hydroxylase；FLS，flavonolsynthase；DFR,dmydmflavonol4-reduct-ase；LAR,LeucoAnthocyanidinreductase；LDOX,leucomthocyanidindioxygenase；UFGT,UDPG-flavonoidglucosyltransferase；WH，isoilavonehydroxylase；IFR．isoflavonereductase大多数的植物体内都不能大量累积查尔酮，查尔酮一经合成便经过一系列的酶促反应，转化为不同种类的黄酮类代谢物。在查尔酮还原酶(chalconereductaseCHR)催化下生成异甘草素，在查尔酮异构酶(Chalconeisomerasecm)催化下生成柚皮素，这两种产物分别是形成大豆异黄酮的重要组分～大豆苷和大豆染料木苷的前体，而柚皮素则是大豆染料木苷和花青苷的共同底物，在异黄酮合成酶0soflavonesynthaseIt'S)作用下将合成大豆染料木苷，而在黄烷酮．3堀化酶(Flavanone3-HydroxylaseF3H)作用下则可进入花青昔合成途径；同时，在代谢途径的不同环节，在相关酶的催化下可_●T__●I_l 四川农业大学博士学位论文第一苹进入黄酮类、橙酮类、黄酮醇、木质素及芥质酸等代谢支路。在一个植物种类中可能存在着多种不同的类黄酮，而且，它们往往与不同的糖基结合，以复合物的形式存在。2．3．3．2植物中调控类黄酮代谢的MYB转录因子植物的类黄酮代谢途径大多是由多种酶共同催化完成的，而且受发育阶段、病虫害及环境等生长因子的影响，单纯只对代谢途径中的某一个基因进行修饰，往往难以获得满意的效果。研究表明，一些转录因子可调控代谢途径中的多个基因，它们通过与靶基因启动子区的相互作用来调控不同目的基因的表达和mRNA的转录起始，从而，特异性地调控目的产物合成的形式和强度阳。近年来，许多类黄酮代谢途径中的转录因子基因已从拟南芥、番茄等模式植物中被克隆出来，根据其结构特点可以分为两个转录因子家族：一类是与脊椎动物原发癌基因c-MYB编码蛋白同源的MYB转录因子，它们都具有相似的螺旋一转角-螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)结构，多数MYB转录因子都具有两个相关的HTH结构，参与靶序列的结合。在每个MYB区域中，一般都含有3个保守的色氨酸残基，其间隔18．19氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持HTH的构型起着非常重要的作用；另一类是与脊椎动物原发癌基因c-MYC编码蛋白同源的MYC转录因子，它们具有共同的螺旋．环．螺旋(basicHelix．Loop-Helix,姗皿结构，可与MYB转录因子相互作用，共同调节类黄酮的代谢【9s】。在玉米中，与花青苷生物合成相关的酶基因，大多受到bHLH蛋白和MYB类转录因子的调控。CJ在无色素的玉米组织细胞中的异位表达，可使一系列的基因协同表达，最终，导致花青苷在无色素的玉米细胞组织中大量合成和积累。此外，在玉米中，具有抗虫和抗真菌活性的3．脱氧类黄酮的合成，依赖于另一个MYB类转录因子—P的调控，P基因的异位表达也可导致与类黄酮合成有关基因的协同表达，但不同于和cl调控的基因嗍。研究表明，C1和PL分别通过与Ⅲm类转录因子的不同成员R和B的相互作用，然后与ARE顺式作用元件结合，从而调控下游基因在不同组织中的表达。ZINCl与尺主要在种子糊粉层和一些花组织中表达，爿与占基因主要在植物的茎和叶片中表达。将R蛋白插入C1蛋白D1qA结合域和转录激活域之间，构建的融合蛋白CRC，同样可以导致玉米细胞中花青苷的大量表达。将cRc转入拟南芥、烟草及白三叶草等植物中，也得到了同样的结果。Lm等将CRC导入大豆并使其超量表达，同时，共抑制F3H以阻断花青苷和黄酮醇合成途径，结果使大豆种子中异黄酮含量比野生型增加了4倒100]。玉米正是利用CI／R，尸J倡基因的组织特异性表达，来控制其茎、叶和种子16 四川农业大学博士学位论文第一章等不同器官中花色素生物合成的，这也是植物不同转录因子组合调控的典型例子之一[101,102]。纠基因的另一个等位基因P阿也编码一个MYB转录因子，调控红色类黄酮类色素合成，转基因的瞬时表达表明，在种皮、穗轴、颖片、外果壳、花丝及雄穗呈现明显的颜色多态性变异。Moy姐。等发现金鱼草AmMYB305与AmMYB304共同调控苯丙烷代谢途径的第--YMrl每PAl．,(Phenylalanine彻∞ia_lya∞)的合成【103】，-当AmMYB305-U：jAmMYB304在同一细胞中表达时，AInMYB305优先结合在目的基因的启动子，从而减弱了AmMYB304的激活效率，因此，它们之间通过一种内部协调机制共同参与苯丙烷代谢。来自拟南芥的MYB转录因子—_PAPl(Prodactofanthoeyaninpigment)的异位表达，可有效增强类黄酮生物合成基因的表达，并使植物的大多数器官呈现出深紫刨104]。PAPl及另一个相关基因PAP2的序列与c，非常相似，推测以Pf和PAP2可能是C珀q同源基因，但剧尸朋q表现型并不需要bHLH蛋白的协同表达，这说明其在功能上具有相对的独立性。原花青苷，又名浓缩丹宁，是类黄酮家族的另一重要成员，常常在拟南芥发育阶段的种子中大量积累；如果将编码R2R3MYB蛋白的TT2(transparenttesta2)基因敲除，则会因种子内皮层黄色丹宁成分的减少而影响种子的颜色。功能获得实验揭示TT2可诱导无色花青苷还原(1eueoanthoeyanidinreduetase，LnR)的编码基因banyuls(BAN)的异位表达，LAR是催化原花青苷合成的第一个酶，不过，rr2的这一功能需要bHLH蛋白TT8的存在才能完成【1051。2003年，Mathews等将强启动子控制下的ANTI基因导入番茄和烟草，并超量表达，结果使受体植物呈现出一系列紫色突变表型。检测结果显示，查尔酮异构酶(CHS)和二氢黄酮醇还原酶㈣的表达量明显增加，受体植物中的花青苷大量累积【1061。近些年的研究表明，有些MYB转录因子对苯丙烷类生物合成有关的基因具有抑制作用，如：牵牛中的AmMYB308和AmMYB330，拟南芥中的AtMYB4以及从红草莓果实中分离得到的FaMYBl。这--觌tarl3转录因子的C．端都具有一个保守的基序pdLNLD／ELxaQ／s。这个基序与存在于AP2／ERFII型转录抑制因子和具有抑制功能的锌指蛋白的勘LR基序(ERF-associatedamphiphilicrepression)t}常相似，对AtMYB4的这一保守序列的缺失和突变结果分析表明，这个保守的c．端基序是转录抑制区的一部分。推测这类转录因子的抑制作用很可能是通过与其它MYB转录因子争夺DNA结合位点而实现的1107-109]。17 四川农业大学博士学位论文第一章3．立题依据真核生物的基因表达极为复杂，受到一系列的级联调控作用，包括染色质的修饰、基因转录和转录后调控、翻译及翻译后修饰等调控，其中，转录水平上的调控是涉及植物生长发育、逆境反应、信号转导和抗病性等一系列基因表达的最重要的调控方式。转录因子是在转录水平上与DNA发生相互作用的重要反式作用因子，它与基因启动子或增强子内的顺式元件相互作用，或通过转录因子之间及其基础转录复合物之间的直接或间接作用，修饰改变靶基因存在的染色质结构，调节或启动转录，目前，植物转录调控过程中转录因子的研究已成为当前分子生物学研究的热点领域。自从Paz-Ares首次报道了玉米的转录因子CJ基因的克隆以来【110】，已有数百种调控干旱、盐渍、激素、低温及生长发育等相关基因表达的转录因子被分离克隆出来，据推测拟南芥中至少有1553个转录因子基因，约占其基因总数的5．9％112,62,111,112】。MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用【75’¨3】；对MYB转录因子基因LHY和CCAl的研究结果显示，它们可能通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控【114】。MYB基因的分离克隆可以为我们提供这类转录因子在转录水平对植物某些生理过程的调控机制的相关信息。近年来，利用DNA微阵列、转座予标签、T-DNA激活标签及同源克隆等方法分离克隆出了大量MYB基因，对这些基因的修饰与表达【53t蛾1删f1悼106l【115小71，加深了人们对其生物学功能的认识。然而，MYB蛋白家族庞大、功能复杂多样，对MYB转录因子在植物生长发育及生理代谢中的调控机理的深入研究和解析，尚有赖于大量MYB转录因子基因及相关基因的克隆和功能分析。大豆．(GlycinemaxL．)富含蛋白质、脂肪、矿物质、维生素和其它生物学活性物质，是重要的油料作物和蛋白粉来源，此外，大豆中还含有丰富的大豆异黄酮，又名异黄碱素，研究发现，大豆异黄酮具有非常重要的生理功能和应用价值。类黄酮是植物体中一类重要的次生代谢物，广泛存在于各种植物类群中【盯】，黄酮类次生代谢物具有多种生物学功能，在植物基础生理代谢中发挥着极为重要的作用。此外，类黄酮还具有抗氧化、抗癌、降低胆固醇、抑制和预防冠心病、骨质疏松症以及其它老年性疾病的作用190-931，作为人类食物中的组成成分，对人体的健康也具有非常重要的影响；其中，仅存在于豆科等少数植物种类中的异黄酮，是许多重要的 四川农业大学博士学位论文第一苹植物抗毒素前体，更是极富医疗和保健价值。大豆是最重要的异黄酮来源，而大多数MYB转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作用。因此，从大豆中分离克隆MY8转录因子基因不仅有利于人们对黄酮类物质的生物合成、调控及其代谢网络的认识和解析，而且，可为大豆的耐逆性研究提供一定的理论基础。4．研究目标与研究内容4．1研究目标1)以大豆为研究材料，从中分离克隆出大约lO个肘馏基因同源片段；2)克隆3．5个肘聆基因全长DNA序列，分析其在不同组织中的表达情况；3)构建植物表达载体转化模式植物，进行相关的功能分析。4．2主要研究内容1)根据植物MYB转录因子基因DNA结合域保守区，设计简并引物，以大豆栽培品种中豆27、吉林3号、淮豆1号及张家口黑豆为研究材料，扩增MY8基因同源片段；2)以获得的肘阳基因的同源片段设计基因特异引物，通过RACE,-PCR扩增肘阳基因的3，．端和5i端cDNA序列，进而扩增出目的基因的全长cDNA序列；3)利用酵母表达系统检测目的基因的转录激活活性；4)利用绿色荧光蛋白(GFP)对目的基因进行亚细胞定位；5)Northern杂交检测目的基因在植物不同器官组织中的表达情况；6)RT-PCR检测目的基因在不同胁迫下的表达情况；7)构建植物表达载体，转化烟草，进行相关功能的检测与分析。19 四川农业大学博士学位论文第二章第二章大豆MYB转录因子基因的克隆及其特性分析摘要：MYB转录因子高度保守的DNA结合域使利用以PCR为基础的方法分离克隆MYB基因家族成员成为可能。本研究根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物，利用RT-PCR方法从富含异黄酮的大豆品种中豆27、吉林3号、淮豆l号及张家121黑豆中【118·11明分离得到了14个MYB基因的同源片段，从中选择了4个片段，通过RACE-PCR克隆得到了四个新的MYB基因GmMYBZl(DQ902862)、GmMYBZ2(DQ902861)、GmMYBJ6(DQ902863)和GmMYBJ7(DQ902864)，并对其进行了序列分析和蛋白的结构预测；RT-PCR对其在不同器官组织中以及在不同胁迫条件下的表达情况进行了检测和分析，结果表明，只在叶片中检测到了GmMYBJ6的表达，在茎和叶中分别检测到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表达，而GmMYBZ2在植物的根、茎、叶及未成熟种子中均有表达。以基因组DNA为模板对GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7进行了PCR扩增，扩增产物经序列分析表明，GmMYBZl不含内含子，GmMYBZ2含有1个内含子，而GmMYBJ6和GmMYBJ7分别含有2个内含子。胁迫应答检测结果显示，在紫外辐射、高盐及干旱(PEG)条件下，GmMYB,16的表达增加，而GmMYBZ2和GmMYBJ7的表达降低。1．前言MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用[75，113】：对MYB转录因子基因删】，和CCAl的研究结果显示，它们可能通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控‘n5】，另外，MYB转录因子还参与不同波长光介导的光敏色素的合成【120l，缺氧胁迫应答及作为端粒蛋白对染色质起保护作用等。近年来，利用DNA微阵列、转座子标签、T-DNA激活标签及同源克隆等方法分离克隆出了大量MYB基因，对这些基因的修饰与表达t99．1∞，1¨1峨11纠17’121]，加深了人们对其生物学功能的认识。然而，MYB蛋白家族庞大、功能复杂多样，对MYB转录因子在植物生长发育及生理代谢中的调控机理的深入研究和解析，尚有赖于大量MYB转录因子基因及相关基因的克隆和功能分析。MYB转录因子都具有高度保守的DNA结合域—州YB结构域。每个MYB结构域约含有50．53个氨基酸残基，其中，有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18一1920 四川农业大学博士学位论文第二苹i11个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋．转角．螺旋(HTH)的构型起着非常重要的作用。MYB蛋白借助此结构插入靶DNA分子大沟与目的DNA结合，研究表明，植物中的MYB结构域在R2和R3重复区高度保守，因此，可以根据此保守区设计简并引物，采用PCR的方法获得MYB转录因子基因片段【43'45,12¨，本研究通过RT-PCR方法获得了4个新的MYB基因，并对其进行了序列分析和结构预测，为下一步的研究奠定了基础。2材料和方法2．1材料2．1．1植物材料培养及取材供试大豆品种中豆27、吉林3号、淮豆1号和张家I：1黑豆由中国农业科学院作物品质资源所及北京国家大豆改良分中心孙君明博士共同提供。自然光照下，温室培养2周后开始取材，分别剪取根、茎、叶及末成熟种子，液氮冻存备用。TRNzol(TianO吼)：b量提取总RNA。2．1．2菌株大肠杆菌(EscherichiacoIO=DH50【农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)：LBA44042．1．3载体pMDl8-T克隆载体pcAMBIA2301aI(a呐pBIl212．1．4酶与试剂，本室保存购自TaKaRa生物公司本室保存RNA提取试剂TRNzol及DNA回收试剂盒购自北京天根科技有限公司；SupeCScriptmlllReverseTranscriptase及GeneRac0蹦kit购自Invitmgcn公司；pMDl8．T载体及限制性内切酶、Taq酶等常用酶类购白宝生物公司。2．1．5其它试剂蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异丙醇、乙醇、异戊醇、NaCI、MgCl2、磷酸二氢钠、水饱和酚、Tris饱和酚等均为国产分析纯试剂；5一溴-4一氯·3-吲哚-p—n21 半乳糖苷(x．aal)、已丙基．B．D．硫代半乳糖苷(mTG)、氨苄青霉素等购自北京鼎国生物公司；琼脂糖为Spain产品，焦碳酸二乙酯(DEPc)为美国Genview公司产品。2．1．6溶液1．TE(pH8．∞：lOmmol／LTris-HCI；lmmol／LEDTA(pH8．0)2．SolutionI：50葡萄糖；25mmolfLTris-HCl；lmmol／LEDTA(pH8．0)3．SolutionⅡ：0．2moFLNaOH；I％SDS4．SolutionIII(100m1)：5mol／L醋酸钾60．Oral：冰醋酸11．5ml；水28．5ml5．50XTAE(IL)：Tris242．Og；冰醋酸57m1：0．5mMEDTA100ml(pH8．0)6．1MTris．HCI(pH8．0，500m1)：Tris60．69；水400mh浓HCI21．0ml2．1．7培养基2．1．7．1LB液体培养基0L，pH7．4)：蛋白胨10．噜，酵母提取物5．09，NaCI10．og2．1．7．2LB固体培养基(1L，pH7．4)：蛋白胨10．09，酵母提取物5．Og，NaCl10．09，琼脂粉15．吨2．1．7．3B5培养基(1L，pH5．8)1．B5液体培养基(1L)：贮备液I50ml贮备液II5ml贮备液HI5ml贮备液IV5mlCa盐50ml铁盐5ml2．贮存液I(1L)]qH4N03KN03MgSO。·7H20KH2P0433000rag38000nag7400mg3400mg22 四川农业大学博士学位论文第二章3．贮存液II(1UKIH3803MnS04·4H20ZnSOa·7I-120Na2Mn04·2H20CuS04·5H20COCl2·6H204．贮存液m(1UFeS04·7H20Na2EDTA·2H205．贮存液rv(1U肌醇烟酸VB6VBl甘氨酸6．钙盐(1L)CaCh·2H20166mg1240mg4460mg1720mg50mg5nag5mg5560mg7460mg20000mg100mg400mg8800mg2．1．8主要仪器PCR扩增仪(TachneI"312)，一80"C超低温冰箱(sANYO)，高速冷冻离心机(I-Iettich,MIKRO200R)，高速台式离心机(Hettich,MIKRO120)，DNA／RNAcalculator(GeneQuant)，(Pharmaciabiotech)，电泳设备，凝胶成像系统(BioRAD)。2．2方法2．2．1大豆总鼢叮A的提取(TRNz01)所用器皿均按RNA提取的常规方法处理【l笠】鹩 1．剪取100mg温室生长两周的大豆叶片，液氮研磨后，置入1．5ml离心管中，加入lmlTRNzol(TianGen)试剂，涡旋振荡lmin，室温放置5-10rain；2．4"C，12000r／mm离心10min，去除沉淀；3．将上清液转入一新的离心管，加入等体积的酚／氯仿(1：1)，剧烈振荡30see，室温静置2．3min；4．4"0，12000r／min离心10rain；5．将上清液转入一新的离心管，加入等体积氯仿，剧烈振荡30see，室温静置2-3min：6．将上层水相移入另一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10-30rain：7．4"C，12000r／min离心10rain，沉淀RNA；8．弃上清，加入lml75％的乙醇清洗，4"0，7500r／min离心5mira重复一次；9．室温晾干3-5min；lO．加入50pl无RNase的灭菌双蒸水，溶解RNA；11．260rim下测OD值定量RNA浓度。2．2．2第一链eDNA的合成(按Invitrogen公司反转录试剂盒说明书进行)1．预变性：以大豆总RNA为模板，以Oligo—dT为引物(工作浓度为10pmol／I．t1)。反应体系如表2-1，混匀后，65。C变性5min，立即置于冰上l-2min；表2-1RNA预变性体系Table2．1ReactionmixtureofRNAdenaturationreaction成分用量TotalRNAOfigo-dTPr／mer(tOpmol／p1)dNTP$(10mMeach)DEPCI№m妇l10mg-lpg1．0lIl1．0ILIX13IIl2．反转录：向上述离心管中加入表2．2中所列成分后混匀，42"Clh：70"C下15min灭活反转录酶； 四川农业大学博士学位论文第二章表2．2反转录体系Table2·2Reactionillixtureofreversetranscriptionalreactionsystem成分用量5×BufferDTT(0．IM)RNaseOUT(IOmMeach)黜惴Thn5喇pt；娥啦00U／曲T0忸l4m1．0m7；d3．RNaseH消化：向反应液中加入lid(2U／ftl)的RNaseH，37"C20min，消化与cDNA结合的单链RNA，．20"(2冰箱保存反转录产物。2．2．3M路基因同源片段的克隆2．2．3．1引物的设计与合成利用DNAMAN软件对GENBANK中已公布的MYB类基因的氨基酸和核苷酸序列进行同源分析，然后，根据M髓基因DNA结合域保守区设计合成一对简并引物(表2．3)。表2-3简并PCR中使用的引物Tabk2—3TheprimersusedinthedegeneratePCR引物编号引物序列MYBPl5'-Cs(G／A)TG(T／C)GG(A／G／C)AA(G／A)AGCTG(C／T)AGACTfA／CXA／C)G-3’MYBP25'-T(T／C)TCA'ITG(T／G)C(A／T)GTTC(T／G)TCC(T／A)GG(T／C／A)A(A／G)-3‘QT5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)-3’2．2．3．2Rr-PCR根据植物中M瞪基因DNA结合域保守区设计一对简并引物s和AS，以叶片为材料提取总RNA进行RT-PCR，PCR条件为：94"C5rain；94"1245see，60"C45sec，72℃30see，30个循环；72℃10min。反应结束后用O．8％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。2．2．3．3．PCR产物的回收 四川I农业大学博士学位论文第二苹采用北京天根科技有限公司的PCR产物回收试剂盒，方法如下；l-电泳结束后用洁净的刀片在长紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，放入1．5ml的微量离心管中；2．加入适量的溶液B(300}．tl／100mg)；3．50"C水浴10rain，期间颠倒振荡三次，直至凝胶完全溶化；4．将凝胶溶液转入离心柱中，静置1-2min，12000r／min离心lmin：5．弃废液，在离心柱中加入700p1溶液c(用时用乙醇1：1稀释)，12000r／mm离心Imin)6．弃废液，在离心柱中加入5001．tl溶液C，12000r／min离心lmin，二次清洗；7．弃废液，12000r／min离心2min，甩干剩余废液；8．将离心柱置于新的离心管中，加入65"C预热的30．501．tl溶液D，混匀，静置2min，12000r／min离心lmin。9．回收DNA储存于-20"C。2．2．3．4目的片段与克隆载体的连接将回收的PCR产物连接至pMDl8．T载体上，连接反应体系如表2-4，16"C连接过夜。表2-4连接反应体系Tab|e2-4Composmonoftheligasereactionsystem成分用量回收的PCR产物(200-300ng／l‘1)pMDl8·T载ff。(50ned#)LigationMixTotal4-ll1．0Ill5．0IIllO‘Jl2．2．3．5大肠杆菌感受态的制备1．取大肠杆菌DH-5a单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃下200r／mm振荡培养过夜；2．取80111复苏的DH-5a菌，转入盛有8mlLB液体培养基的试管中，37"C下200r／mm振荡培养2—3h；3．当菌液OD600介于0．3-0．5之间时，置于冰浴中30mira4．将菌液分装入无菌的1．5ml离心管中，4000r／min，离心5min，重复收集菌体； 四川农业大学博士学位论文第二章5．弃去上层培养液，加入400ttlO．1Mcach溶液，轻轻吹打，重悬菌体，并冰浴25min；6．4000r／min，离心5rain，弃上清；7．加入0．2mlO．1MCaCl2溶液，重悬沉淀，．8032保存备用。2．2．3．6重组质粒的转化1．在灭菌的1．5ml离心管中加入200ttl新制备的DH．5cc感受态菌液及10ttl的连接产物，混匀后冰浴30rain；2．将离心管置于4232水浴中，处理90s；3．立即将离心管置于冰浴中5rain：4．向离心管中加入800111LB液体培养基，3732下200r／min恒温振荡培养45min；5．在含有Amp的LB平板上加入40．1X-gam(5一溴．4．氯-3一吲哚-13-D-半乳糖苷，209／L)，4山IPTG(i=,丙基硫代-B—D-半乳糖苷，2009／I．)，用无菌的玻璃涂布器将两种溶液的混合物均匀涂布于整个平板表面，室温放置至液体被完全吸收；6．取150．200p1转化后的DH-5cx菌液均匀涂布于培养基表面，完全吸收后，将平板倒置于3732恒温培养箱中，12．16h后，将平板置于432以使蓝斑充分显色；7．挑取阳性克隆(白色)，菌落PCR鉴定。2．2．3．7菌落PCR鉴定以含有Amp的LB平板上挑取的白色单菌落，转入ImLLB(Amp+)液体培养基中，3732，200r／min摇菌2h，分别吸取1“l菌液作为模板，进行菌落PCR鉴定，引物为S和AS，扩增条件为：94325min；943245sec，603245sec，723230sec，30个循环；72"C10min。反应结束后用O．8％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。2．2．3．8重组质粒的核苷酸序列测定将菌落PCR阳性的菌落转入含Amp的LB液体培养基，3732下200r／min过夜培养，制各成甘油菌，送中国农业科学院测序部测序。2．2．4大豆膨髓基因的3'cDNA的克隆2．2．4．1引物的设计与合成根据已获得的MYB基因的同源片段，设计4对巢式基因特异引物，上海生工合成，见表2．5。 四川农业大学博士学位论文第二章表2-53'RACE反应中使用的引物Table2—5Prirflcrsusedinthe3’RACBPCR引物编号引物序列3ZDl．GSPI3ZDl—GSP23ZD2．GSPl3ZD2mSP23JI石刷P13JL6．GSP23JL7．GSPl3JL7—GSP2QTQ1∞5’．ACCAGAGAAG从GAGGACACC^：rAA，3。5啪AA^：rOTrl3GGAAACAO^：rIXyrc-3’5WGGTAACAAGTGGTCTrrGATAGCl"-3。5¨门旧ATAGcl啪A^G^：丌D牝C啪AC-3’5『．TAGC^：r啪AAOCAGOTOG砷：-3’5’-1BGl℃CA=珀—m眦^：r(北AGCl-rCj3'5LA^：rrGCAGCCAAACl=^CCTOGAC-3’5’-AoCCA从C1：^CCTGGACG从CTG-3’5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGG-CATGACAGTG(T)-3。5蜘TGl℃AACGNrAcGClACGl：ⅢG．3’5≮GClACGlMCGGC舶ACAGTG．3‘2．2．4．2大豆总RNA的提取分别以大豆栽培品种中豆27和吉林3号的叶片为材料提取总RNA，提取方法同2．2．1。2．2．4．3第一链cDNA的合成方法同2．2．2。2．2．4．4巢式PCR扩增3’．端cDNA1．以QT引物反转录获得eDNA为模板，分别用基因特异引物3ZDI·GSPl、3ZD2·GSPl、3JL6-GSPl和3JL7-GSPl与通用引物Q1进行第一轮PCR，反应参数：94℃5rain；94"C45sec，60"C45sec，72"Clmin,30个循环；72"C10rain；4℃保存。2．将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，分别用基因特异引物3ZDl·GSP2、3ZD2-GSP2、3JL6-GSP2和3JL7-GSP2与通用引物Q2进行第二轮巢式PCR，反应参数：94"C5rain；94"C45sec，60"045sec，72℃lmin，30个循环；72℃10min；4"C保存。3．O．8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMDl8-T载体，转化大肠杆菌DH-50,，利用0c互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同2．2．3。2．2．5巢式PCR扩增5’端cDNA2．2．5．1引物的设计与合成 四川农业大学博士学位论文第二章根据已获得的3·．端cDNA序列设计4对巢式基因特异引物，上海生工合成，见表2·6。表2-65'RACE反应中使用的引物1’able2-6Primersusedinthe5’RACE．PCR引物编号引物序列5ZDl·GSPI5ZDl—GSP25ZD2．GSPl5ZD2—GSP25Ⅱ岳GSPl5JL6．GSP25JL7—GSPl5JL7—GSP2GeneRacer5。primerGeneRacerYNestedpl缸Id5『-CTTCGGTBCGTCCTGGT^脚GT．3’5．-G1℃CTGGT^A1℃GTCCAGCAATO-3’5。．AGTCAoGoCAGCGTCOC从(iA量3’5’-oGAACCr兀从C从CoCTI℃C(}3’5LTGcTGAAAGTGAC^=丌’G1TGr嘟■3’5LGl，r13T眦11．GTCGTGGCAOCA．3‘5LTGGACCACCTGCTTCCA^：I℃CIAG·3’5’．TTll娜侬T(挖^1℃AGAG～娜A．3’5’-CGACTGGAGCACGAoGACACTGA．3’5。-cWrGOACTGAAGGAGlA-3‘2．2．5．2第一链cDNA的合成(按照Invi订ogen公司GeneRACER试剂盒说明进行)1．去磷酸：在PCR管中加入下表所列成分混匀，离心，50"C条件下处理lhr后，离心，置于冰上1-2min。表2．7去磷酸化反应体系Table2-7Compositionof'hedephosphorylationreactionsystem成分用量TotalRNAfl-Sgg)lO×CIPBuffermqaseou940u／：)CIP(100／Jtl)Total71d1．0m1．0‘ll1．0．II10lll2．RNA纯化1)去磷酸化反应产物转入RNase-free的1．5ml离心管中，加入90ttlRNase-fl"ee的ddH20和100肛1酚：氯仿(1：1)，剧烈振荡30s；2)室温，12000r／min，5rain：3)将上清转入另一RNase-free的1．5ml离心管中，加入2ttl的贻贝塘原，10m的NaAc(3mol／L)，220ttl95％的乙醇，轻轻混匀；29 0UJIl农业大学博士学位论文第二章4)一70"C沉淀lOmin；5)4"C，12000r／min，20min，弃上清；6)加入5001．tl70％的乙醇清洗；7)4"C，12000r／min，2mjn：8)吸干乙醇，室温干燥2rain；9)7mRNase--fi'ee的ddH20溶解，转入PeR管中。3．去帽：在PCR管中加入下表所列成分混匀，离心，37"C条件下处理liar后，离心，置于冰上1-2min。表2-8去帽反应体系Table2-8Mixtureoflhedecappingreactionsystem成分用量dephosphorylatedRNAlO×’I．APBufferRNaseOut(40U／p1)TAP(0．5u，曲Total7lIl1．0lIl1．O山1．0IlllOIll4．RNA纯化方法同步骤2。5．RNA接头序列的连接1)将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，轻轻混匀，离心；2)65"(2，5min，冰浴2rain，离心：3)在PCR管中加入下表所列成分混匀，离心，37℃条件下处理lhr后，离心，置于冰上1-2rain。6．RNA纯化方法同步骤2。7．反转录方法同2．2．2。 四川农业大学博士学位论文第二章表2-9RNA片段连接反应体系Table2-9MixtureoftheRNAOligoreactionsystem成分用量DephosphorylateddecappedRNAandRNAOligo10×LigaseBufferRN铀e0哪mu／曲^rP(tommol／L)rAY(0．5U／曲Total7．0lIl1．0m1．oIIl1．0IIlnnI2．2．5．3巢式PCR扩增5’．端eDNA1．以QT引物反转录获得eDNA为模板，分别用基因特异引物5ZDl-GSPI、5ZD2．GSPl、5J1．石．GSPl和5JL7．GSPl与GeneRaeer5’primer进行第一轮PCR，反应参数：94"(25min；94℃45see，60"1245see，72"Olmin，30个循环；72"(210rain；4℃保存。2．将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，分别用基因特异引物3ZDl．GSP2、3ZD2．GSP2、3JL6-GSP2和3JL7．GSt'2与通用引物Q2进行第二轮巢式PCR，反应参数：94"(25min；941245see，60"1245see，72"(2lmin,30个循环；72"C10rain；4"C保存。3．O．8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMDl8-T载体，转化大肠杆菌DH-5ct，利用值互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同1．2．3。2．2．6MYB基因eDNA全长扩增2．2．6．1引物的设计与合成拼接已知的3’．端和5。．端eDNA序列，获得eDNA全长序列，据此，设计基因特异引物，扩增MYB基因的eDNA全长序列，所用引物见表2-10。2．2．6．2第一链eDNA的合成方法同2．2．2。3l 四川农业大学博士学位论文第二章表2．10cDNA全长序列扩增所使用的引物Table2-10Primersusedinthefull-lengthPCRamplificationofeDNA引物编号引物序列5’七^=兀TTCAGGr陀ccACA瑚AAAC·3’5’-ATGGAAACGAAGGACGACAGTGCT-3‘5q钆钉TGAG仉虹UGlmGGTCCccTrG-3‘5。-GA01：K啪GAAGGTCCCCTTGCT-3‘5qrI℃^：n陀TC’I℃ACl．rCTCTCCAACAA-3’5。．1℃TCTCACl_rcl℃TCCA^CAACACIAACl"-3’5'-CCAGGlAGGCC^：n姗AAGGG·3。5∞硝“}oGAAG∞CTCCATGTrGT-3’5LrrI卫X兀’GATOCCCCG-CTCCA-3。5‘·CCACGTTCC^：兀℃TTCAGTATCCT-3’2．2．6．3MYB基因eDNA全长序列的克隆及生物信息学分析1．以QT引物反转录获得eDNA为模板，利用基因特异引物ZDI·FliJL6-Fl和JL7-F1与通用引物Q1，利用基因特异引物ZD2．F1与ZD2-R1分别进行第一轮PCR，反应参数：94"C5min；94"C45see，60"C45sec，72"Clmin,30个循环；72"C10min；4"C保存2．将第一轮PCR产物稀释100倍作为模板，利用基因特异引物ZDI·P2、JL6-F2和JL7-F2与通用引物Q2，利用基因特异引物ZD2．F2和ZD2．R2进行第二轮巢式PCR，反应参数；94"C5min；94"C45see，60℃45see,72"C1曲，30个循环；72"C10rain；4"C保存。3．0．8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMDl8．T载体，转化大肠杆菌DH-50【，利用a互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同1．2．3。4．利用DNAMAN软件进行序列比对和分析：利用SMART服务器(http：／／coot．embl-heidelberg．de／SMART／)分析MYB基因的结构域；利用CPHmodels-2．0服务器分析预测姗蛋白的三维空间结构(http：／／genome．ebs．dm．dldserviecs／CPHmodcls-2．0Server-3D．htm)；利用ScanProsite服务器(http：／／www．expasy．org／egi-bin／prositc)分析大豆MYB基因的结构功能位点。2．2．7DNA序列的扩增及分析2．2．7．1引物的设计与合成根据已获得的GmMYBZl、锄肘阳z2、GmMYBJ6和GmMYBJ7四个基因的eDNA吼也肌也埘彪兀砣n磁料阱砒砒啦弛肼肼肼肼 四川农业大学博士学位论文第二章序列，分别在基因5’．端和3’．端设计基因特异引物，所用引物见表2．1l。表2．1lMYB基因的基因组扩增所使用的引物Table2-1lPrimersusedinthePCRamplificationofMYBgenesfr／minsoybeangenome引物编号引物序列G-n-zDl(F)On-ZglfR)Gn-zD2(F)on-zmot)Cna-JLa(DGn-JL6(R)Gn-儿7∞On—几7(R)5’．TⅣLTGGA从CGAAGGAC(认CAGTG-3’5’-ACACTCl．G1℃CCrrcC^：兀℃ACG-3’5L^：rlj313AAGGTCCoCTI佻■3’5’-TClAGAGA_rrrcl℃TCAcTrCTCTCCAA-3。5℃^=n3GGAAGGGCTCCAD了I]f1B-3’5姒OTAGAAAGAATGAGTGATcTr(KITTAA-3’5t-Acl℃CCACl．I℃AGA从CCAA代A．3’5『-TOT《rI)口rrTGAATGTGA^：rGGG-3’2．2．7．2大豆基因组DNA的提取1．取适量中豆27和吉林3号的叶片于离心管中，液氮研磨成粉末，再加入700ttl2×CTAB提取液，充分混匀；2．4℃，12000r／m，离心10min，吸取上清液转入新的离心管；3．加入等体积的酚／氯仿，混匀，静置5mill后于4"C、12000r／rain，离心10rain：4．将上清液转入另一离心管，加入等体积氯仿，混匀，4"0、12000r／min，离心10rain；5．将上清液转入另一离心管，加入等体积异丙醇，混匀，在冰上静置20～30min，沉淀DNA：6．挑出絮状DNA沉淀，70％乙醇中洗涤2次；7．无水乙醇洗涤1次；8．风干后，加适量TE缓冲液或无菌双蒸水溶解DNA，-20"C贮存备用。2．2．7．3PCR扩增以中豆27和吉林3号的基因组DNA为模板，以基因特异引物Gn-ZDl口)和CJn-ZDlfR)、Gn·zmff)和Gn-ZDI(R)、Gn-JL6ff)和Cm-J12ifR)及C,n-YL7ff)和C,n-JL7偎)分别进行PCR扩增；0．8％的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至pMDl8-T载体，转化大肠杆菌DH-5a，利用a互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序，方法同22．3。2．2．8大豆MYB基因在不同组织的表达模式分析2．2．8．1总RNA提取33 四川农业大学博士学位论文第二覃分别提取大豆栽培品种中豆27和吉林3号的根、茎、叶及未成熟种子的总RNA，提取方法同2．2．1。2．2．8．2甲醛变性胶电泳方法参照《分子克隆》的方法。1)用50mlDEPC处理过的水溶解0．69琼脂糖，冷却到55"C,2)加入2．5ml甲醛和6ml10XMOPSbuffer混匀，制成1．2％的变性胶；3)分别将401．tlRNA(10一15岫、6山的10XMOPSbuffer、101．tl的甲醛和40p．1的甲酰胺加入无RNA酶的0．5ml离心管中：4)55"(2温浴15min，置于冰上冷却后，稍离心，加入6斗l的上样缓冲液，混匀后加入变性胶的点样空中；5)以1XMOPSbuffer作为电泳液，在100V电压下电泳约40rain然后停止。2．2．8．3转膜1)将凝胶在紫外灯下切下无用部分，在凝胶左上角(加样孔一端为上)切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。用DEPC水冲洗，然后用转移液浸泡凝胶20rain。2)用长和宽均大于凝胶的一块玻璃板作为平台，将其放于托盘(盛有适量转移液“0．01MNaOH+3MNaCr’)上，上面放一张滤纸，两边浸入转移液中，当滤纸湿透后，用玻璃棒赶出所有的气泡。3)将凝胶从转移液中取出放在玻璃板的滤纸上，在胶的周围铺上塑料薄膜。4)用剪刀分别剪比凝胶大lmm左右的滤纸和尼龙膜各一张，尼龙膜先在DEPC水中浸湿，然后浸在10xSSC溶液中至少5min,滤纸在转移液中浸湿。5)先将尼龙膜放于胶上，用玻璃棒赶出气泡，后将滤纸盖在尼龙膜之上，用玻璃棒赶出气泡，然后用餐巾纸(30层，相同大小)盖在滤纸上方。后用另一块玻璃板将餐巾纸压紧，最后再在玻璃板上方放大约4009的重物(从下至上依次是：滤纸，凝胶，尼龙膜，滤纸，餐巾纸，玻璃板，重物)，转移1—1．5h。6)取出尼龙膜在紫外灯下检测(避免太长的紫外曝光时间)。然后放在6XSSC溶液中轻轻震荡清洗stain,取出来晾干后放于紫外交联仪中交联1．Smin(254nm)。刀将膜真空包装放于4'12保存。2．2．8．4探针标记1)用无RNA酶的水将探针DNA片段稀释至lOng／rtl；34 四川农业大学博士学位论文第二章2)吸取10111探针DNA片段至微型离心管中，沸水中处理5min；3)迅速置于冰上5rain，稍离心，加入下表所列成分混匀，离心；4)37"C条件下处理30min后，置于冰上待用。表2一12探针标记反应体系Table2-12Mixtureof山eprobelabelledreactionsystem成分用量变性的DNA片段碱性磷酸酶标记试剂交联缓冲液lOm2m109l2．2．8．5预杂交和杂交1)将碱性磷酸酶杂交缓冲液预热至55"(2；2)将处理好的膜置入预热的杂交液中，55"(2预杂交至少15rain；3)按5—10ng／ml，将标记好的探针加入杂交液中；4)55"C杂交过夜。2．2．8．6洗膜与结果检测1)将漂洗液I预热至5512；2)将膜小心转入漂洗液I中，55"C下漂洗10min；．3)将膜小心转入新的漂洗液I中，55"C下漂洗10min；4)将膜小心转入漂洗液Ⅱ中，室温下漂洗5min：5)将膜小心转入新的漂洗液Ⅱ中，室温下漂洗5rain；6)排干漂洗液，将膜置于洁净的玻璃板上(样品面朝上)；7)按照30-40pl／cm2的量，将CDP．Star检测试剂小心滴加于膜上，室温放置2-5rain；8)排干检测试剂，用保鲜膜将尼龙膜包好，样品面朝上，置入暗夹中；9)暗室中将一张X．光片覆于暗夹中尼龙膜上，关闭暗夹，室温下曝光约1br；10)曝光完毕，暗室中取出x．光片，D72显影液显影至适度，定影；ii)自来水漂洗干净后，照相记录。2．2．9MYB基因在不同胁迫下的应答2．2．9．I引物的设计与合成 四川农业大学博士学位论文第Y-苹以大豆泛素蛋白基因Subi．1(D16248)为内标基因，设计大豆泛素蛋白基因特异引物GmUBQ．F和GmUBQ．R；根据已得到的MYB基因cDNA序列，在基因的非保守区设计基因特异引物，所用引物见表2．13。表2．13MYB基因在非生物胁迫下的表达分析所使用的引物Table2—13PrimersusedinlheanalysisofMYBgenesunderabioticstresses引物编号引物序列ZDI·RT(F)ZDI-RT(R)ZD2-RT(F')ZD2-RT(R)JL6-RT(F)JL6-RT(R)JLT-RT(F)JL6-RT(R)GmUBI-FGmUBI．R5'-C1：^!几册AGAAAGGAGGCAG从G一3’3-÷通§}}§÷}GC§￡雌K啦积G}心5．一00GGOAG从CAGACA^=r0AAAn钆认-3’5'-CAAAccCAAACTGCAAACGAAAC．-3’5q■u^OCAACAACAATGTCACrITCAG-3‘5■C^TCAAGCACAAACTCAAGCAAAT-3。5‘CAGlACl℃CAAAGGAAGCCTCAAC．3’5。-TGCCTGTCCACCCAClAACAClA．3’5’-CTCTGACAGGG从GACCGl：^A(>3．5’-GAGACCGTGCATAGCAAGClA．3。2．2．9．2Gm们擂刁、GmMYBZ2、GmMYRl6及GmMYRl7对紫外辐射的应答盆栽播种出苗后，自然光照下，温室培养2周；对2周龄以上的幼苗进行UV-B辐射处理，辐射强度为0．2mW／cm2，20分钟／天，分别提取处理3天、7天和15天的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以大豆泛素蛋白基因为内标基因，利用基因特异引物ZD2一RT(F)和ZD2一RT(R)、JL6-RT(F)和JL6一RT(R)及JL7-RT(F)和JL7-RT(R)进行RT-PCR扩增，检测GmMYBZ2、GmMYBJ6及GmMYBJ7在不同紫外辐射处理时间下的表达情况。2．2．9．3G肼们yBZ，、G舰M旧刀、GmMYBJ6及GmMYBJ7对高盐的应答大豆种子经10％的次氯酸钠灭菌处理5-10分钟，B5培养基播种出苗后，温室培养2周，然后，将苗转入含有300ram的NaCl的B5培养基中进行高盐胁迫处理：分别提取处理3d、7d和15d的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以大豆泛素蛋白基因为内标基因，利用基因特异引物ZDl．RTfF)和Zm-RTff)、ZD2-RT07)和ZD2-RT(R)、JL6-RT(F)和JL6-RT(R)及JL7·RTfF)和JLT-RT(R)进行R1二PcR扩增，检测GJmf阳Z2、GmMYBJ6及G坍M限，7三个基因的表达变化。2．2．9．4o以n露zJ、GmMYBZ2、Gm肘删6及G聊肘yB刀对干旱的应答大豆种子经10％的次氯酸钠灭菌处理5-10rnin，播种于B5培养基，出苗后，温36 四川农业大学博士学位论文第二章室培养2周，然后，将苗转入含有10％的PEG8000的B5培养基中进行高盐胁迫处理：分别提取处理3d、7d和15d的叶片总RNA，反转录获得的cDNA作为PCR扩增模板，以大豆泛素蛋白基因为内标基因，利用基因的特异引物ZD2-RT(F)和ZD2-RT(R)、JL6-RT(F)和JL6-RT(R)及JL7-RT(F)和JL7-RT(R)进行RT-PCR扩增，检测GmMYBZ2、GmMYBJ6及GmMYBJ7三个基因的表达情况。3结果与分析3．1MYB基因同源片段的获得以叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板，通过简并PCR扩增出约170bp的目标带(图2·1)，与预期大小一致。将回收的PCR产物连接至pMDl8·T载体上，转化大肠杆菌DH-5ct，利用a互补及菌落PCR筛选出20个阳性克隆，铡序后得到14条不同的168bp的序列(表2-14)。序列检索结果显示，与大豆、玉米的、水稻及拟南芥的MYB基因核苷酸序列具有较高的一致性，初步判断这14个片段为大豆MYB基因保守区。3．2M功’基因cDNA3’序列和5’序列的获得经序列比对，从已获得的14个MYB基因同源片段中，挑选出4个用以设计基因特异引物；利用基因特异引物3ZDl-GSPl和3ZDl．GSP2、3ZD2一GSPl和3ZD2．GSP2、3JL6．GSPI和3JL6．GSP2、3JL7．GSPl和3JL7．GSP2及3嗵用引物Q1、Q2进行3aCA_CE扩增，电泳检测，分别得到1条约500bp和3条约700bp的扩增产物(图2-2)，测序结果表明，这4个片段分别为514bp、678bp、692bp和696bp，且5．端序列与原同源片段部分重叠，判断为目标MYB基因的3’端序列。利用特异引物5ZDl．GSPl和5ZDl-GSP2、5ZD2-GSPl和5ZD2-GSP2、5JL6．GSPl和5JL6．GSP2、5JL7．GSPI和5JL7一GSP2及GeneRacer5'Primer和5qqestexlPrimer进行5a己ACE扩增，电泳检测分别得到l条约400bp、3条500bp的扩增产物(图2-3)，测序结果表明，这4个片段分别为385bp、452bp、5]0bp和495bp，且3’端序列与原同源片段部分重叠，判断为目标MYB基因的5’端序列。3．3肘聆基因cDNA全长序列的获得利用基因全长特异引物ZDl-F1和ZDl．F'2、JL6-F1和JL6．F2、JL7-F1和JL7．F2 四川农业大学博士学位论文第二章分别与3嗵用引物Q1、Q2，巢式PCR获得l条约900bp、1条约1Kb和1条约1．3KB的扩增产物；利用基因全长特异引物ZD2-F1、ZD2-F2和ZD2-R1、ZD2-R2，进行全长eDNA扩增，获得l条约1kb的扩增产物(图2-4)。测序结果表明，这4个全长序列分别为807bp、993bp、1371bp和970bp，序列比对结果显示，与多种植物MYB家族的基因有较高相似性，推断为新的MYB基因，分别命名为CrmMYBZl(DQ902862)、GmMYBZ2(DQ902861)、GmMYRl6(DQ902863)和GmMYBJT(DQ902864)。图2-1简并PER扩增结果CK负对照；1．ZD；2．JL；3．Im；4．ZYKF咄．2-1AmplificationofdegeneratePeRClCNegativecon响k1．ZD；2．IL；3．HD：4．ZJK表2一14简并PCR获得的MYB基因同源片段Table2-14FmgraentsofMYBgenesobtainedviaPCRamplification 四川农业大学博士学位论文第二章3．4MYB基因cDNA全长序列分析3A．1MYB基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测GmMYBZl序列全长807bp，开放阅读框528bp，编码175个氨基酸，推测其分子量为20．321Kda，等电点为8A1。SMART软件对GmMYBZl编码的蛋白功能分析表明，该蛋白具有两个MYB结构域，分别由51个氨基酸和49个氨基酸组成，为典型的R2R3MYB转录因子。但在其C．端无明显的转录激活域，推测此蛋白没有转录激活活性，或具有较弱的转录激活功能(图2．5)。GmMYBZ2序列全长970bp，开放阅读框744bp，编码247个氨基酸，推测其分子量为27．518Kda，等电点为9．07。该蛋白具有两个MYB结构域，分别由51个氨基酸和49个氨基酸组成，在C-．端存在一个酸性活化区域；SubnuclearCompartmentsPredictionSystem预测该蛋白定位于细胞核，判断为典型的R2R3MYB转录因子。但在其C-端还具有一个与转录激活抑制有关的氨基酸基序和一个锌指结构，推测具有一定的转录抑制功能，或具有较弱的转录激活功能(图2．6)。GmMYBJ6序列全长993bp，开放阅读框786bp，编码261个氨基酸，推测其分子量为29,．084Kda，等电点为5．97。该蛋白具有两个MYB结构域，分别由52个氨基酸和49个氨基酸组成，在C．端存在一个酸性活化区域；SubnuclearCompartmentsPredictionSystem预测该蛋白定位于细胞核，判断为典型的R2R3MYB转录因子(图2·71。GmMYBJ7序列全长1371bp，开放阅读框969bp，编码322个氨基酸，推测其分子量为35．640Kda，等电点为6．60。该蛋白具有两个MYB结构域，分别由52个氨基酸和49个氨基酸组成，在C．端存在一个酸性活化区域；SubnuelearCompartmentsPredictionSystem预测该蛋白定位于细胞核，判断为典型的R2R3MYB转录因子(图2-8)。3．4．2Gm]ⅥYBzl、GmMYBZ2、Gm_MYBJ6和GmMYBJ7蛋白的三维空间结构预测CHPmodels-2．．0服务Oattp：／／genome．ebs．dtu．dk／services／CPHmodels-2．0serv哪对CanMYBZl、CanMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7进行三维空间结构预测(如图2-9，A，B，C，D)，结果显示，GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和Gl心《YBJ7的空问 四川农业大学博士学位论文第--荤结构中分别具有6个甜螺旋，一些D．折叠和无规卷曲，在其MYB结构域区域构成两个螺旋一转角一螺旋(HTI-I)结构，为参与DNA识别及结合部位；C-端具有2个两亲性的a．螺旋，推测与转录激活功能有关。由此证明，GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白可能为典型的R2R3MYB转录因子。3．4．3G珑^fl召Z，、Gm^f】曰z2、G聊M17&珩和G珊^4阳：厂7的内含子分析以中豆27和吉林3号的基因组DNA位模板，对GInMYBzl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7进行PCR扩增，分别得到1条约700bp、1条约900bp和2条约1．5Kb的扩增产物(图2-lO)；经回收测序表明，这4条带分别为660bp、876bp、1523bp和1505bp。序列分析显示，GmMYBZl没有内含子，CanMYBZ2含有一个内含子，而GmMYBJ6和CJmMYBJ7分别含有2个内含子(图2．1l，图2-12，图2-13)。3．4．4G删MYBzl、GmMYBz2、GInMYBJ6和GmMYBJ7蛋白与其它MYB类蛋白的同源性比对及系统进化树分析MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，根据所含MYB结构域的数目，植物中的MYB类转录因子可分为单一MYB结构域蛋白、2个重复MYB结构域蛋白和3个重复MYB结构域蛋白三个亚类。利用DNAMAN对GmMYBZl、GnlMYBz2、CrmMYBJ6和GmMYBJ7与其它已经克隆的MYB转录因子进行系统进化树分析，结构表明，GmMYBZl与拟南芥的rr2和PAPl、玉米的PL和c1及牵牛的An2分在一组，CmaMYBJ6和CmlMYBJ7与拟南芥的AtMYB68、大豆的GmMYB71和GmMYB78及高粱的P-typR2R3MYB分在一组，而GmMYBZ2与拟南芥的AtMYB4和草莓的FaMYBl分在一组；拟南芥的AtCCAI、AtLHY和AtEPRl等单一MYB结构域蛋白单独分为一组(图2-14)。由此看出，CanMYBZl、GmMYBZ2、CmlMYBJ6和GmMYBJ7四个转录因子蛋白均为R2R3MYB转录因子。序列比对结果显示，C_anMYBZl的氨基酸序列与拟南芥的TT2一致性为32．95％，MYB保守区—致性为56％；与玉米的PL一致性为29．52％,MYB保守区一致性达56．9％。GmMYBZ2的氨基酸序列与大豆的MYB54一致性达到92．91％，MYB保守区一致性达96．08％：与棉花的GHMYB9一致性达到66．04％，MYB保守区一致性达95．17％。CrmMYBJ6的氨基酸序列与大豆的MYB71一致性为29．95％，MYB保守区一致性达81．51％；与拟南芥的AtMYB68一致性为33．69％，MYB保守区一致性达80．67％。GmMYBJ7的氨基酸序列与大豆的GmMYB78一致性达到61．03％，MYB保守区一致40 四川农业大学博士学位论文第二章性达97．4l％；与高粱的P-1ypR2R3MYB一致性为31．72％，MYB保守区一致性达87．07％。^CnnMYBZIkCrmMYB7__2；C．1,2GmMYRl63,4ConMYR]7F嘻2-2Productsofthe3'RACE．-PCRamplificationreaction^GmMYBZlB．GmMYBZ2；C1,2GmMYBJ63,4GmMYBJ7图2-35'RACE-PeR扩增结果▲GmMYBZlB．GmMYBZ2：C．1,2GmMYBJ63,4GmMYB刀FiE．2-3Productsofthe5'RACE-PCRamplificationreaction▲GmMYBZl&GmMYBZ2；C1,2GmMYKl63,4ConMYBY741 圈2-4MYB基因全长cDNA扩增^GInMYBZlB．GI心n’B毖C．Gln^删6D．GmMYl}J7F嘻“Produc协thePCKamplificationoffull-|engthofMYBgenes～GmMYBZlB．GmMYBZ2C．0mMYBJ6D．Gl[nl讧YB"图2-5GmMYBZ]基因全长cDNA序列及推测的氨基酸序列阴影部分氨基酸序列代表植物MYB蛋白中高度保守的R2和R3DNA结合区域：黑体字母表示MYB结构域中保守的色氨酸(w)残基；虚线部分氨基酸代表可能的转录激活区Fig．撕Nucleotide锄ddeducedLwKinoacid∞删alo％ofGmMYBZITheshaded删Ⅻrepresent血econservedR2andK3DNA-bindingdomainofMYBprct,ein．TheboldlettersindicatetheconservedtIyptophannsiduesinthe～IYBdomain．42 四川农业大学博士学位论文第二章图2-6GmMYBZ2基因全长cDNA序列及推测的氨基酸序列阴影部分氨基酸序列代表植物MYB蛋白中高度保守的R2和R3DNA结合区域i黑体字母表示MYB结构域中保守的色氨酸(VO残基：虚线部分氨基酸代表可能的转录激活区；方框内部分为植物MYB蛋白c_端中参与转录抑制的氨基酸基序；波浪线部分为可能的锌指结构域Fig．2-6NucleotidemddeducedamilloacidsequenCeSofGmMYBZlTheshadedrqiⅫrepresentthecouservedR2andR3DNA-bindingdomainofMYBprotem．Theboldlettersindicatetheconserved口yptoph虬residuesintheMYBdomain．Theconservedmotif缸theC4enninal1"09ionwhichisinvolvedintherepressionofU1mscriptionisboxed．Wavylineindicatethe鹎gi∞pot∞mmyformingazincnn鲈domain43 图2-TC-mMYBJ6基因全长eDNA序列及推测的氮基酸序列阴影部分氨基酸序列代表植物MYB蛋白中高度保守的R2和R3DNA结合区域；黑体字母表示MYB结构域中保守的色氨酸(w)残基；虚线部分氨基酸代表可能的转录激活区■地．2-7Nucleotideanddeduced8Ⅱninoacid$e钟ellCesofG帆时瑚晒Theshadedre#onsrepresenttheconservedR2andR3DNA-bindingdomainofMYBprotein．Theboldletter'sindicatetheconservednyII“'ph∞residues缸theMYBdomain． 四川农业大学博士学位论文第二章Iiiii■——■——————■■■——■■■■■———■■■■■■■■■—■■●■■■——————■■—■■■■■■■■————■■■■■■■■■||皇兰量!曼量—■1612112i哇1181612q1813011013611214211414811615q1181601Z0166l2217212哇1781261B4128190i30196i32110213哇1108111411201126113211381CC^CGTTCC^TTCTTC^GTATCCTT‘rGT^GTTTGA^CCTTCCTC^CACTCCC^CTTCAG▲UCCA^TC^从GAGAGAGAGAGAGAGAGATGGGTAGAGCTCCTTGTTGTGACA▲C,@CAAA戛QR^PcCDK^NTGT从^GA^且GGACCATGGTCACCAG^▲I；^AGATGAAACGCTAAAGGATTACAT^G▲I∞^冀～蔗嚣GP-sPE蓦D毫TLKDT工zQ^CATGGCACTGG且G03^ATTGGA"ITGCGCTTCCTCAAAAAGTTGGTTT^^^AAGATGTGG曩“To￡N-I▲LPQKVGLKRcGTAAOAGCTGT且GACTAAGGTGGCTr从TTATCTTAGACCCAACATCAAGC^TGGTCAATT匿JCRLR■LNTLR，N工鬟茸GQ膏CTCTGATGCAGAAG^T土^^^T^^TCTGCAGCCTC。rrCGCTAGCATTGGAAGCAGGTGGTC爱一．驻置EDK工羞csLrAsIG暑R■鬟C^T▲ATAGCATCTCAGTTGCCAGGGAGGACTGACAATGATATA^且^从CT^CTGGAACAC9苫玉▲s口IIpGRTDHD工KNY-H擘CAXC,CTCAAGAAGAAAATGATGGCCATGAATCCTTCAGTACTCCAAAGGAAGCCTC▲．^C^夏&冀嚣嚣置曼▲置NPsVL0R耳PQ▲^TT^CCCTT订^TCCATCCTTCU▲0TTC▲GC▲TC▲TC^TTCAG^GACAGCAACAAC^T善王Lk一曼一三一已一垒一皂一最一曼一皂一最一己一巳JI_』I-jL且一三CTCATACTACCACCCTCACGGTTCCTrrrCCt^CTCATCATCAAGTCTTGTGAGTGGT从一爱_．XjL里一三一J一旦一呈一!一呈一!一呈一盖～昱一玉一至一Z一曼一生．舅C^▲C’rCTTCTGCT^^TGCTG■_rTCCTTGTTTCAAC-CAC▲AGAGAGTTTC且TGG▲CCCCjLI一毡一巨一置一曼一坦一曼一皂一皂一k一￡一垒一曼一g一曼一是一巳—巳—也—巳—匿GTGCCA^TTC^AAGATAGCAC_CATCTTTGTGTCTC珏AGGTG^AGCCACAGCC^TGGCC^C＆QFKDs嚣IFVsGQEATA五^TGGCC^CTAGTIT艽AGCTCTTCTGATC,GGAGCTGCUC“CCAGATAAGCCATGTCATGGA戛Zscs募怠DGscN甄QIs珏V置zGCCTGC^G^GTT_roGTG▲TGC▲AGTTTTGTTGGTGGC,C,CC从T^^TCACA3nCTAC^GToG夏戛EFGDASrVGgAN甄E工YsGC,GAGGAAGATGAT从T^^TACTCAG▲^GTTG^TGATGTTCTCCAATGCTGGTGGTAGTGT曩夏D昆N甄TQKLE募FsN▲GgsVTAGTGGGTGGACAGC,C^AAC▲▲从TC,GATTATTGTGC,GRJLC▲^且^TCC^TTGG▲TTATC珏爱QVTGKQNGLk可EQNPLDYGTCT。rG▲∞上^^。rr▲从C▲15CTC且TT▲Gc▲CT且^T¨CAGTTGCXACAACTTTTTGTTTl5二^＆芸￡IRQLISTN甄scN飘FLFDTGACAAGAAGACACAAGAAAGAGTC且CGTACT▲CTGATCGATGATGATTTCT‘rcAGACTT驻K墨TQzRVT’且TG^CTTGTTGGACTC从TTTGTTTGTGCTTTTGTGGGATGGGTT_rT_rAGTTTT^GTTTTT^CTTTTT^GT^TTG^▲TAGAXTTGAACCACTTTCTTTGTTTG从^GTAC^TTT^从G‘rrTTCTTTTTGCAGTTACT’rrGCCGA∞TAACCCTACCC▲T。rC^C且’rTCU▲CC▲TAC^CATCCCCT^^GGAAGATAA^G^^从GGAGGAACGAGGAACCTTTG^T^TACTTAACAAGAGTTCCCT^TTTGTAATTCTrTTATCTTCC^从C^TC^TC^T^^^G^AGCTCGCAC,C^GC^GTCC．^CT^^▲^▲^^▲^^^^^^▲^^^▲▲^^J一图2-8Gr，lIl4YSJ7核苷酸序列及推测的氨基酸序列阴影部分氨基酸序列代表植物MYB蛋白中高度保守的R2和It3DNA结合区域；黑体字母表示M1rB结构域中保守的色氨酸(w)残基；虚线部分氨基酸代表可能的转录激活区Fig．柚Nuclemidcanddeducedioacid∞叩lal∞ofGr,删TR／7TheshadedrcgomreprcscntthcconservedR2andR3DNA-bindingdonminofMYBprotein．TheboldletWrsindicam血cco．semd奶审to灿msidmsintheMYBdomain．The出出cdr铭iollindicatespI删"mmscriptionalactivationdomain．45 四川农业大学博士学位论文第圈2-9GmMYBZI(A)、G1n^删Bz2(B)、C,mMYaJC5(C)和GI吐fnlJ7(D)蛋白的三维空间结构预测红色：∞螺旋；蓝色：B-折叠；白色：无规卷曲Fig．2-9Predictedtertiary出wnRofGmMYBZI(A)，CnnMYBZ2(B)，GmMYBJ6(C)andCnnMYBJ70yR。d：讪cl岖Blue：p-s口柚d；Whi圭c：randomcoil圈2-10GmMYBZI，GmMYBZ2，GmMY砌67钉GmM]rBJ7的基因组PCR扩增^．GmMYBZIB．1jGmMYBZ22．GmMYBJ63．GmMY&玎Fig．2-10PCRamp酬oaofGmMYBZI，GmMYBZ2，㈣6andGmMYBJ7in80，．bⅢgeaomc丸GmM}'BZIK1．国棚功z22GmMYBJ6王GmM]'BJ7 四川农业大学博士学位论文第二章1▲TGGG^^GGTCCCCTTOCTGTG^G^^^GCTC^C^C^“C^nGGTGC^TGG^CT^^^G^^61GAAG／tTG^C^GI～．CTC：AT／',TCTT^TATTCG^GCTCACGGCG^^GGCTGCTGGCGTTC^CTC12lCC：CJI．从GCCC,CCGGTC竹CTCCGGTC3CGGC从从GCTCI,CCGTCTCCGGTGG^TC^,ILCT^C181CTCCC-CTCCG1．CCTT“A^G,ItGGT^,ItCTTT^CCG^^G^A6^^G^CG^GCTCATC^TC^^^2qlCTCC^C^GTCTCCTCGGT^^CAAGZA矗口C：^Z百Z商士鼍CC五量AcTCCTCGTr甬aTTTC^CC丑30l∞巴础口蛆℃搬T伍凹曩℃A瑚拄U蛹TCmTCTCTT蜀lTcTZ雕比!置A册五a丑蠢C^^搬3I占1甬^^C^丑C^，-Ci丑r-／'O'l"l,lffl"TG，T归TT口T口6夏’T!℃^∞TG-GTCTTTG^TAC；CTGG／t^G^TTG42iCCGGC-G^G^^CA6^C^^TG^^^T^,ILILG且^CT量T_rG0^^T^CGCAC^T^^G^AGG直^GCTTq81TTG^^CA6^GGnTCG^CCCTGC^ACTC^T^C-C．rCC^CTC▲^CGAA6CTC,C从CTGCTGC▲5qiItCTGTT／I．C从CT▲^T^T^TCTn’TGGC^^^C^且GJIJ．C从CldtG^6▲C^^GTTCG^GT^^C150lGG^^GCFrTGTr“螂_rrC(：／LTCTT∞^ACoCTGcCCTG^cTTG^^CCT。婚^GTT工ACC66l▲TT▲GTCCTCC’rcGCCUC丘GC^^c^6^CTC^G从G^^TCTTTGrn℃GTTTGCAGr兀-o72lC,G．rTTGC^C^JI．C且GC^^AG^TTCcCAC,CTCiC^^CGr九℃C▲▲CG_CTGTC^CTG．TC工^C▲▲C7Bl▲CC^CTCCTTCTTCTC,CTC．，CTC．托To：TGCTC,C竹^TG^rrTCTTGGGC且TG^从^CC^GC84lGGTGTTTo∞mGC^CCCGCrrGo^“TG▲▲▲TG^图2-11OmMYBZ．2在基因组中的核苷酸序列(黑色字母区域代表GmMYBZ2中的内舍子)№2-11Nueleotides∞lucncesofCrmMYBZ2fromgenomefnleregionofboldlettersindicatetheintrominGrnMYBT_2)i—I、06G^^∞GCTCCATGl’DG’rG▲C^^上JCC从TGTG^^^▲G^OGGCC．1’rGfd'TCTCC’rG^T61G▲^6工TGCC▲CCCTC从^▲▲CT^CCrrG^G^_I^C^TGGC^C^GGTGGT^^CTGG^T^C,CT12：1CTCCCC^^^^从GC^O口l竹■^TT，C，T，鹭I^TTZ配nX孵C^C眦CTCTaaD凹陀TC灯18ij^TZ蠢矗Z搬Z碰口回暖TT，lIca宽■aCZ矗口臼臼^麓碰U蛹丙Z再^TTCCTCTTTT!旧蚴TcC艋2蕾1T蜀臼G鱼oGTTr月奢c=口曙2hZ蠢Z碰口蛆黛Z曩臻Z蠢!口童臼誓ll茁口丘口蛹冉Gr船，l口CCTT日靠B30工^C!T旧TTb口CaT日臼昆口呛Ga^TCo臼口^MC^oCC，CZ玎日C再Z酣n口∞UIa口口Z■矗DOCT，‘1a茸盘E舶oUIZ^卫DCCTC!CCCJZ酗a舅口X；aC^Z矗日C＆U-诅aCC州T归6通C囊—!目口口耻蹦虻●2la^两岛曙2，船Z口曩嚣Z配B矗A^CT∞0目翻：^CCTZ帖阳窒心^Z光唧雹lC鱼TZ础ZA册●81j臣霄ZAT口凸口r^^^麓E西再T日j屺蝠望啦GZAj正嗣^aC^CCCZ矗饿础f2目G矗豫TZ留5●1aU蛹西曩日哪^^a臼＆V确^口^a舶夤蚴I黛G两臼菌口蛋Z船a型∞口晡丙T!TC，CCC翻册种1CZ曩两臻^侣曩TC而盈C^^蠢TZA月Z■TT唧G■卫曩AA而A百盯^^^^Z^T目C且五C，CTCTC玎661CTT妇蠢—TZ曩oCE口％融酗灯臼酗Z口嚼口矗●夏。，CC蜀cjU¨lTTGZ^^a舶舅惯■TZ融玎凹陋堂B721f日Z酣即暇气强●9GCClTA．ILC．,CGTTGTGGG工^G,ILC,CTGTCGTCT▲AG▲TGGCT从^CT^TCT'781CJtC,C,CCTC^T▲rr^^OCTT0G^GFrrTC■CTG,lIJtC．^GG^^G^C^^且ATT^"reTC,C^CCC：T84lTT^TG^C^cC^TCGGJO．GC^6aaU峨CAT互归曩窖册TTTTZ髓丑虹A尘日眦锄Tf，O王乜■盈Z酣n昆随aZ翟日口B酗船CTTTT口CA尘T五T蜀驵曩曰CZAZ配瞄妇蟹，日曩GZ—再T坦曰强舶，‘1丘￡E日M瑚灯C搬TGGTCCTTTmGC^GCTC土^CrrCCCGoG^G^上C^G^C▲^．rG^TG102lTG^^土▲^tCItCTGG^^C^CC从GCT^^直G▲^^^^GTTCTTo；c^o铀．^^C^C^^晶T^GT^1081C。rGCTC,CCACG^C从0CA且C从C从TGTC^CTTTC^GC从T^CT量GTT^TTCTG^丁CnO1141TT^工矗▲CCCTTGTCrrGmTC^TC▲从^^CTG^^CTCAGCTG^T▲工TTGG1。rTG^C。mCTt201CCT▲C从TG'T1一rrGG“1_rGG从C^^^C^CC从TTCC^GTTCCrrrTCC,It^TGTCTC^GG1261▲^盯▲G^GGCl_rn。▲丘rrA．TA．CTC．,C1GGGAGT▲T▲^GmT▲GTGI：ACC^CClLCCCTCTI1321ItC,G从GTTTCMtTC．把．1_rTCC^^TGC^G^C^^。rc^T^CGCT^TGGT'rTC播TT^TGACC,IkTC,138lC从G∞G^^G▲TG．^TCC▲UTtrGCrT弓^GTTTGrGCrrG^TG^TG■TCTGCTG从TC▲1弓：1．ot4lG^TT_rG百1。TCTCj∞^C▲U^OCTGC▲GCC^^G订GC|TCCItC(：上TCTC,GCT从圈2-12GmMYBJ6在基因组中的核苷酸序列(WA色字母区域代表GmMY刚6中的内含子)Fl玉2-1：2NucleotidoseqllcncesofCnnMIIBJ6from掣札伽e‘1l”i％,ionofboldlettersindientetheintrominGmMYB,16) 四川I农业大学博士学位论文第二章^TGGI；TAG^GCTCCtTGTrGTG虬^^I撤▲土■rGT^从G^^▲G6^CC^T6C玳^CC^G●_▲G^^G^TG从^CGCT^且AGG^rr^C^T且G^GC▲^C^TGGC^CT6G^GGG从TTGG^TTC,CGC1-rCCTC▲^^▲^G1。rGGT^^a蛩口C^蹦Z^^Z酗叠K翻茁职^墨驷％翻TB酲G雕玫，坫理C醪^!Z巨C^C，玎!C丑置aC珊Za蕾毋曲V强豫TC再Z耻雕X蚰御C珊TCTCTZ—CcTc，ZE口口瓢cT，T蛀毋cTT蜀口6窆T!C卫囝I，PTG鱼盘力曙研TT月，Cac弛TTT从^^AG^丁GTGGT从G^GCTOT▲G^CT从GGTGGCTT土土TT^TCTT^G^CCC且^C▲TC^^GC^T∞TC上^TTCTCTG^TGC^GA^GAT^^^^T^^TCTGC^GCCTCTTCC,CT^GC^TTGG^^GCAG●；，吼Coc=口K渭f!℃jCTZ阻明口J蹦TZ配●jC^CC，TTC^CfTT矗∞C西CTC^B酗H丑C搬，嘎FC丑品蠢Ⅻ!TCCCZ^^^Cj匣B蕊U蛹CC口Z舶，蝎丙Z珊TTCC—^T，I∞I^口^^^C—埘a饿TTT搬，TCTTTC^盟TTTTT日锄AZ丑岛曩再蜀衄旧CA而盘甥K凋^置ACC口—Z雕HmZ配n，埋E，1钉^CTTTZh钟a西田CT日C酊C甬G黜，T19CA，口CCA而再T!T甬G雕n舅％配雹I曩臼∞n船CZU蜀盘口攫翟^鼢CZ■盘口嵋临圩TCTZ雕四M口日a舶■皇蛆强珊，C—C嘲例Z榔TGGTCC胁^T^GC上JCTC^arrGCC^GG6脚^CTG^C从TG^T^T^^从^^CT^CTGG且ACjCC^^GCTC^^G^▲GAA且ATG^T∞CC▲TG^^TCCTTC^GT^CTCCn^0G▲▲C,CCTC^量C^A^TT^CCCTtTT^。I℃C删CTTCA^^FrK^l；C^TC^TC上tTC^l弛G^C▲GC从C^^C^TCTC^T工CTACC^CCCTC^CC-GrrCCTrrTCCt▲CTCj—CATC^^GTCl”IbTG^GTGGT从C^^C1℃TTCtGCTnTGCTG▲rrCCTTGl。rrC^j钟置C^^G^G▲GTTTC^TGGACCCC从GTGCC从1W^^孟GAT^GCJGC^TCTrrGTGTCTGG^C,GTG^^GCC^C^C圮CATOGCC▲CG(圮C^CT^G?兀’GCAGCTCl。rCTGATGGG^GCTGC^^C从CC^C疆T从GCC土TGTC^TGG^GCCTGC且G^6TTTGGTG^TGC^^GT兀TGTTGGTC,C,GC．,CC^^T且^TC^C盯CT^C▲I钉GGGG^cG^^GATG^T^AT从T^C1℃^G^^GT。rG^TG^TGl’rCTCC▲^TGCTGGTGGT^GTGrr^GTGGGTGG置C^GGC^▲^C^丘▲^TGGm^TTGTGGG^^cA^^^TCCATTGOm^TGGTCT。rG^GG▲“TT从^C^6CTC^TT^GI：^CT^^T^^C^GrrGC▲^C▲^CTTTrrGTTTG^TG^CnG土^G^C^C^^G从^G^GTC▲CGT^CT^CTG^圈2-13CnnMYR／7在基因组中的核苷酸序列(黑色字母区域代表GmMFRl7中的内舍子)Fig．2-13Nucleotideseq岬c∞ofGmMYBJ7fromgellOmO(TheregionofboldlemmlindicatetheintronsinGmMYBJT)3．5组织特异性表达分析分别提取大豆栽培品种中豆27和吉林3号的根、茎、叶及未成熟种子的总RNA，提取方法同1．2．1。利用Northern杂交对囟删，、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7四个基因在不同组织中的表达情况进行了检测，结果只在叶片中检测到了GmMYBJ6的表达，在茎和叶中检测到了GmMYBZI和GmMYBJ7的表达；而GmMYBZ2在根、茎、叶及未成熟种子中均有表达(图2．15)。3．6在非生物胁迫下的表达分析分别对中豆27和吉林3号2周龄幼苗进行紫外辐射、高盐和干旱(PEG)等胁迫处理，在不同处理时间，分别提取其总RNA，反转录获得cDNA。半定量RT-PCR检测结果显示，GmMYBZI在紫外辐射下表达量稍有降低，在高盐和干旱处理下，表达变化不明显；随着胁迫处理时间的增长，GmMYBZ2和GmMYBJ7的表达量有所下降，48i1li1王11lilZ8哇06281n亿∞烈如¨配甜酣种“他阳酗暑：％∞加u"托”” 四川农业大学博士学位论文第二章而GmMYBJ6的表达有增加的趋势(图2-16)。由此看出，GmMYBZ2、GmMYBJ7和GmMYBJ6对非生物胁迫具有明显的应答。0．0SU图2-14MYB转录因子的系统进化树分析图中依次为：z．maytJL’玉米(AAB67720)；z．mays．．Ct(CAA36456)；112，拟南芥(NP_198405)：PAPI，拟南芥(NP_176057)；An2，牵牛(AAF66727)；AtMYB68，拟南芥(NP．_201380)；P-type-R2R3MYB，高鬃(EAY9t994)；GmMY'B71，大豆(ABH02912)：C．naMYB78，大豆(ABH02914)；A删【YB4，拟南芥(NPl95574)；FaMYBI，草莓(AAK84064)；GHMYB9，棉花(AAKl9619)；GmMYB54，大豆(ABH02822)；AtCCAI，拟南芥(Np$50460)；A'tMLHY,拟南芥(HP_171614)：AtEPRI，拟南芥(1帅_i73269)Fj备2-14PhylogeneticWeeanalysisofMYB触ocfi硼∞蠡Ic幻幅．ThesesequencesshownmZeamaysPL(AAB67720)；Zea．mays．．．C!(cAA36456)；ArabidopststhalianaTT2(NP_198405)；ArabMops括thalianaPAPI(NP_176057)；Petunk：integrifoliaAn2(AAF66727)；Arabidops／stha／／anaAtldY晰80咿．zot3so)；SorghumbicolorP-type-R2R3MYB(EAY91994)；Gbdmm“C_nnMYB71(ABH02912)；GtycimmmCmlMYB78(ABH02914)；ArabidopMsthalianaAtMYB4(NP_195574)；Fragaria，waFaMYBI(AAK84064)；GauypiumhmnawnGHMYB9(AAKl9619)；GlyciMm∞GmMYB54(ABH02822)；Arabidops缸thalianaAtCCAI(NPS50460)；Arobidopsistholim∞AtMLHY(NP_171614)；Arabidops／stha／／anaAtEPRl(NP_173269) 四川农业大学博士学位论文第二章I置舅皇曼曼曼曼曼曼曼舅曼蔓量—■置—毫曼自皇曼曼■—■|墨曼曼皇皇舅皇皇曼曼曼晕置■置曼曼曼量舅■曼曼■■——■曹量量舅●■—量量皇■—量皇量暑曼置—|圈2-15GmMYBZI、GmMYBZ2，C-mMYBJ6和G．mMYB．17在大豆不同部位袭达的Northern分析▲GJ，lII删矗打RGI，lJIf阳刃D．GI，ljlfl丑所BGmMYB37CF．IRNA＆根，s：茎，L：叶。IS：未成熟种子rig．2-15ExpressionofGmMYBZI，GmMYBZ,GmMYBJ6andC-mMYRl7ins∞．be锄byNorthexnblotA．C-mMYBZIAG，，lIIn丑盈no砌棚础F_,．GmMYR／7C,F．rRNA＆Ro砖S：Stem,L：Le狮。IS：Immatureseed图2-16^．GmMYBZI、GmMYBZ2，GmMYBJ6和GmMYBJ7在非生物胁迫下表达分析^．GmMYBzlB．GmMYBz2c。GmmBJ6U．GmMYBJ7Fig．2-16ExtnessionanalysisofGmMYBZ,GmMYBJ6andC-mMYBJ7insoybeantreatedbyabioticd!％scs九G舰村玎iZJB．G批W刀iZ?C．G孵肘阳澎ILGmMYBJ74．讨论4．1利用同源克隆的方法分离克隆大豆MYB基因MYB转录因子是最大的植物转录因子家族之一，它们高度保守的DNA结合域使得利用PCR方法分离克隆MYB基因家族成员成为可能，近年来，采用该策略已有许多MYB基因先后被克隆出来[43，45．12”。本研究根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物，利用RT-PCR及RACE-PCR的方法从大豆品种中豆27、吉林3号中分离得到了4个新的MYB基因GmMYBZI、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7。序列分析和结构预测表明，这4个MYB基因均含有2个MYB结构域，为典型的R2R3MYB转录因子基因。实践证明，同源克隆是一种行之有效的，简便、快捷、经济的分离克隆MYB转录因子基因的方法。50 四川农业大学博士学位论文第二章4．2MYB基因的系统进化树分析根据所含MYB结构域的数目，植物中的MYB类转录因子可分为单一MYB结构域蛋白、2个重复MYB结构域蛋白和3个重复MYB结构域蛋白三个亚类。2001年，Stracke等依据c．末端的不同，通过系统进化树分析，将拟南芥的MYB家族分成22个亚群(图1-1)t'74]，亚群的系统分析不仅揭示了不同成员之间的亲缘关系，也为某些未知功能的MYB基因的研究提供了一些线索。GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7与其它转录因子蛋白的比较表明，GmMYBZl属于第6亚群，G-mMYBZ2属于第4亚群，而GmMYBJ6和GmMYBJ7均属于14亚群。研究表明，在MYB转录因子的c．端一般存在一个转录激活域，它们以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或丝氨酸和苏氨酸为特征，此结构域是激活目标基因转录所必须的。但在GmMYBZl的c．端并未发现有明显的转录激活域。不过，形成同源或异源二聚体也是MYB类转录因子发挥其生理功能的重要方式。如玉米中的Cl、矮牵牛中的An2及拟南芥中的r12，都依赖于特定的bHLH蛋白的相互作用而发挥转录调节功能‘105,110,123】。与其它植物MYB转录因子的同源性比对可以看出GmMYBZl与拟南芥的TT2具有较高的同源性，同属第6亚群。因此，GmMYBZl蛋白的功能是否也需要bHLH蛋白或其它蛋白因子的协同作用，值得深入研究。近些年的研究表明，有些MYB转录因子参与基因的转录沉默，如：拟南芥中的AtMYB4、牵牛中的AmMYB308、AmMYB330以及从红草莓果实中分离得到的FaMYBl。这一类MYB转录因子的c-末端都具有一个保守的基序pdLNLD／ELXiG／S和一个锌指结构域。对AtMYB4的这一保守序列的缺失和突变结果分析表明，这个保守的c-末端基序是转录抑制区的一部分。推测这类转录因子的抑制作用很可能是通过与其它MYB转录因子竞争DNA结合位点而实现的【l弘1叫。序列分析表明，GmMYBZ2的C．端也存在一个pdLNLD／ELXiG／S氨基酸基序和一个锌指结构域，而且，GmMYBZ2与拟南芥的AtMYB4和红草莓的FaMYBl具有较高的同源性，与AtMYB4同属第4亚群，因此推测，GmMYBZ2可能与AtMYB4和FaMYBI相似，即通过与其它MYB蛋白竞争DNA结合位点而对靶基因的转录进行微调。GmMYBJ6和GmMYBJ7与拟南芥的AtMYB36同源性较高，均属于14亚群，在其c-端具有明显的转录激活域，推测这两个转录因子蛋白应该具有转录激活功能，其生物学功能有待进一步深入研究。5l 四川农业大学博士学位论文第二章4．3MYB转录因子的组织特异性表达研究发现，不同的M绍家族基因具有不同的时空表达的特性，如拟南芥的爿￡^彻，3和AtMYB65基因在多种器官组织中都有表达【124)，玉米中的cJ和P，对花青素合成具有调控作用，但是Cj只在糊粉层和花器官中表达，而户J却只在营养组织中表达(Zhan岛2000)。牵牛的一以基因其编码的蛋白质氨基酸序列与玉米的cJ和尸瑾因编码序列有非常高的一致性，均属MYB类转录因子家族，研究表明，它可在花冠和花粉管中表达，而花药中无此基因表达【伪】。此外，在相同的器官组织中也会同时表达多个M船基因，它们之间相互作用共同调控靶基因的转录水平，如金鱼草中的J4蒯唧彤∞和，董删唧彤和，其靶基因的最终转录效率取决于这两个转录因子的相对数量的多少、DNA结合能力的大小以及转录激活功能的强弱【1031。Northern检测结果表明，GmMYBZ2在大豆的根、茎、叶和未成熟种子中均有表达，在茎和叶片中检测到了GmMYBZl和GmMYBJ7的表达，而只在叶片中检测到了GmMYBJ6的表达。由此看来，同一个转录因子基因可以在不同的器官组织中表达，而不同的转录因子也可以在相同的器官组织中同时表达，相互作用、相互协调共同调控靶基因的转录。4．4o们删、GJ棚n缎2、GmMYBJ6和GJ，l?l删的内含子分析内含：子(intron)为真核细胞基因DNA中的间插序列，在高等植物中，大约800／o-85％的基因含有内含子，这些序列被转录成RNA，但随即被剪辑除去而不被翻译，因此，被人成为“垃圾DNA”0unkDNA)。但是，随着分子生物学技术的发展，人们发现内含予在基因表达调控中具有相当重要的作用。当马铃薯的蔗糖合成酶基因sus4的5'-UTR中的内含予被去除后，不但影响了该基因在马铃薯中的表达水平，而且，也明显改变了该基因在马铃薯中的表达模式【125，．26]。此外，在玉米乙醇脱氢酶基因adtd和拟南芥Eel-／基因中发现，内含子还能够增强基因的表达水平【127，12羽。Salgueiro等人的研究表明【129]，玉米泛素基因的第一个内含子和第一个外显子能够启动Gus基因的瞬时表达；进一步的研究发现，在玉米泛素基因的第一个内含子中存在着转录因子结合位点TATA盒样结构和CAT盒样结构，而在玉米adhl基因的第一个内含子中也存在TATA、CAT基序和E盒，如果这两种内含子中的TATA或CAT基序缺失，则不能启动Gus基因的表达。由此看来，转录因子能够与这些基序结合，进而启动了6铀基因的表达，此外，推测这些基序也可能作为一种增强予增强基因的表达。分别以大豆中豆27和吉林3号基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得了 四川农业大学博士学位论文第二苹Gnl]MYBzl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7四个基因在基因组中的拷贝，测序结果分析显示，GmMYBZ2在263．395位有一个132bp的内含子；GmMYBJ6在137—731位和862．974位各有一个595bp和112bp的内含子；GmMYBJ7在141—287位和418．723位分别含有一个147bp和305bp的内含子。这四个基因中内含子对其表达及调控作用的影响有待进一步研究。4．5GJ棚脚、o砌研E纺、GmMYBJ6和白，lIIn强，7对非生物胁迫的应答MYB转录因子基因是最大的植物转录因子基因家族之一，它们不仅广泛地参与植物生长发育及各项生理代谢的调节175，¨31，而且还能够对干旱、盐渍、紫外辐射等非生物胁迫产生应答，激活并调控植物体中相关胁迫基因的表达[68，”o。13”。半定量RT-PCR检测表明，GmMYBZ2和GmMYBJ7随着紫外辐射、干旱、高盐处理时间的增长，其表达量呈现下降趋势，而GmMYBJ6则表达量增加，据此推测，GmMYBZ2和Gm^程8，7可能对植物胁迫应答基因的表达存在负调控作用，而GmMYBJ6的表达则可能提高植物对非生物胁迫的耐受能力。 四川农业大学博士学位论文第三章第三章大豆GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7转录因子转录激活功能的验证摘要：构建四个酵母效应质粒pBridge-GmMYBZl、pBddge—GmMYBZ2、pBddge·GmMYBJ6和pBridge-GmMYBJ7，转入酵母菌株AHl09中，并分别在缺少色氨酸的SD培养基和缺少色氨酸、组氨酸的SD培养基上筛选阳性转化子，同时进行Whallnall滤纸显色鉴定和t3．半乳糖苷酶活性检测。实验结果表明，GmMYBZ2、CanMYBJ6和GmMYBJ7均具有转录激活功能，B．半乳糖苷酶活性分别为10．35U、28．48U和24．3IU，Whatman滤纸显色反应均能呈现出明显的蓝色；而GmMYBZI酵母转化株的B-半乳糖苷酶活性仅为3．59U，Whatman滤纸显色反应未能呈现出明显的蓝色。l刖吾酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来n34，n51，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究[135-13s】，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子【”9】。随着酵母单杂交系统的不断发展和完善，该方法近年来已被广泛用于克隆和鉴定各种动、植物的转录因子。研究表明，大多数的转录因子都具有转录激活功能，通过DNA结合域与目标启动子中的顺式作用元件结合并激活下游靶基因。本研究分离克隆得到的四个M瞪基因，经序列分析和比对，它们都具有两个MYB结合域，为典型的R2R3MYB转录因子，但它们是否具有转录激活活性及其转录激活活性的强弱如何，有待实验证实。为此，我们设计构建了四个酵母效应质粒pBddge-GmMYBZl、pBridge—GmMYBZ2、pBndge-G肌肘脚6和pBridge-GmMYBJ7，对这四个转录因子进行了转录激活功能的验证。2材料和方法2．1菌株与质粒 四川农业大学博士学位论文第三章表3-1实验中使用的菌株与质粒Table3-1Strainsandplasmidsusedinthisstudy2．2酵母培养基表3-2酵母培养基Table3-2Medumusedforyeastsuaimcultivation各组份溶解后，定容至1L，固体培养基加入2％的琼脂粉，SD培养基还需加入10X的氨基酸贮存液100ml，121"(2灭菌30分钟。2．2．1X-gal贮存液配方用100％的二甲基酰胺配成20mg／L自{J母液，-20"C保存备用。2．2．210×氨基酸贮存液配方 四川农业大学博士学位论文第三章表3-3lOx氨基酸贮存液配方1曲k3．3SolutionformulationsforfOxamino∽idstocksolution2．3酵母表达系统中使用的溶液及缓冲液2．3．1鲱鱼精DNA(10mg／L)超声波打断处理后，-20"C保存备用，用前沸水水浴20分钟，迅速置于冰上。2．3．210×TEbuffer0．1mol／L瞄s．HCl10mmol／LEDl．A调pH至7．5，灭菌备用2．3．3l×TDLiAc10mmol／LTris—HCIpn8．0lmmol／LEDl=A0．1mol／LLiAe2．3．4PEG／LiAc(10m1)PBG40008mlof50％PEGTEbufferLiAClmlofl0×TElmlof10xLAc2．3．5B-半乳糖苷酶活性检测试剂(1L)1．Z-BufferNa2HP04·71-12016．19NaH2P04·H205．509KCIO．759MgS04·71-1200．2469调pH至7．0，灭菌后室温贮存2．Z·Buffer／X-galsolution56 四川农业大学博士学位论文第三章Z．Buffer100ml13．巯基乙醇0．27mlX-gal贮存液1．67ml3．ONPG(邻硝基苯p-D·半乳糖苷)实验前2d'时将ONPG溶于适量的Z-Buffer，使其终浓度达至lJ4mg／ml。2．4酵母表达2．4．1引物的设计与合成设计合成引物ZDl-Y∞和ZDl-Y(R)、ZD2-Y(F)和ZD2-Y(R)、JL6-Y∞和JL6一Y∞、JL7-Y(F)和JL7一Y∞，序列见表3-4。2．4．2在酵母中表达的效应质粒的构建利用引物ZDl-Y∞和ZDl．Y∞、ZD2-Y(F)和ZD2一Y㈣、JL6一Y∽和JL6-V(R)、JL7-Y(F)和JL7-Y(R)从连接有全长GmMYBZl、GmMYBZ2，G锄^∥876和GmMYBJ7eDNA的pMDl8-俄体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和pBridge载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶将扩增片段分别克隆在Matchmaker酵母系统中paridge载体的E∞m和＆仉位点，构建与BD(BindingDomain)翻译融合的效应质粒pBridge—GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2、pBridge—GmMYBJ6和pBridge-GmMYBJ7。2．4．3效应质粒的转化及菌落PCR鉴定方法同2．2．3．6和2．2．3．72．4．4效应质粒的小量提取(碱法)1．菌落PCR阳性的菌液转接入约5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37"C恒温振摇，培养过夜；2．取1．5ml培养物转入微量离心管中，4℃，12000r／rain离心30sec，倒掉培养液，尽可能清除残余液(可重复2-3次)；3．弃培养液，使细菌尽可能干燥；4．将细菌沉淀重悬于2001al冰预冷的溶液I中，剧烈振荡：5．加入400m新配置的溶液Ⅱ，快速颠倒离心管数次，混匀后，将离心管置于冰上3．5min：6．加入300Ixl冰预冷的溶液m，后温和振荡10sec，混匀后，置于冰上3-5mill；57 7。4"C，12000rlmin离心5min，将上清转至另一离心管中；8．加入等体积的酚／氯仿，振荡混匀，4"C，12000r／min离心5min，将上清转至另一离心管中；9．加入等体积的氯仿，振荡混匀，4"C，12000r／min离心5min，将上清转至另一离心管中：lO．加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，置于冰上沉淀DNA；11．4℃，12000r／min离心15min．12．小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出；13．70％乙醇洗涤DNA沉淀；14．风干后，溶于20．50I_tlTE缓冲液或无菌双蒸水中；15．加入适量无DNA酶的RNase(20lxg／m1)，37℃处理30min：16．琼脂糖凝胶电泳检测后，-20"C贮存备用。表3-4酵母表达中使用的引物Table3-4Primersusedintheyeastexpressionsysteminthisstudy引物编号引物序列ZDI-Y(F)ZDI-Y(R)ZIY2-Y(F)Zm-Y(P．)JL6-YODJI．J5-Y('R)JL7-Y(F)JL7-Y(R)弘CrcGA^=rIC^：r瑚脚A从cGAAGGAC-3’5。-CCACTC(认oTGTCCACCTTATTACTTCA-3‘，．ACAGA^：rrcAGTATGC站AAGGTCCC-3‘5'-C,-CA(n℃(认CTCl℃ACTTCTCTCCA^，3’5～蛆怕A^=兀℃僦ATGCⅪAAGGGCW-31，CACcTcGAGrnMCTFTATTITCTGT-3’5’．讹GA^：n℃GAGATGC玲TAGAGCTC-3‘5t．(瓢眦GACGTCCAACAAGTCATAA-3’2．4．5效应质粒的酶切鉴定用经凝胶电泳检测的质粒进行EcoRI和Sa／I双酶切反应，酶切反应体系如表3—52．4．6酵母感受态细胞的制备及转化1．挑取直径2．3mm的单菌落接种于lmlYPD液体培养基中，剧烈振荡充分打散菌块：5l 四川农业大学博士学位论文第三苹2．将菌液转移至50mlYPD液体培养基中，30"C，250r／min摇菌培养16．18h，至稳定期(ODe0>1．51；3．吸取10ml过夜培养的菌液，转入100mlⅥ，D培养基；4．30℃，250r／min摇菌培养3时，至OD600=0．5；5．将酵母菌液转入50ml离心管，室温下，2500r／rain离心5分钟；6．弃上清，加入25．50ml的TE重悬细胞，将菌液合并于一管，室温下，2500r／min离，L,5min：7．将菌泥重悬于1．5ml新配制的1×TE／LiAc，30"C温浴30rain：8．在无菌的1．5ml离心管中分别加A0．1呜质粒DNA、O．1mg的鲱鱼精DNA，离心混匀；9．在每管中加入0．1ml的酵母感受态细胞，并振荡混匀；10．加入0．6ml新配制的PEG／LiAc溶液，振荡混匀lOsec，30℃，200r／min摇菌培养30rain：11．加入70m二甲基亚砜，颠倒混匀，42"C水浴热激15rain；12．冰上冷却1-2min，14000r／min离,L,5sec；13．弃上清，将细胞重悬于0．5mll×TE中；14．吸取100p1细胞悬液，均匀涂布q‘SD／-T印和SD／-His／-Trp平板上；15．30"(2，倒置培养2-4d。表3-5酶切反应体系Table3-5Reactionillixtureoftheres扛ictionenzymereactionsystem成分Components用量Dosage(“1)重组质粒10xnBufferEcoRISalIdd如0Total2．4．7B一半乳糖苷酶活性滤纸分析1．将一张无菌滤纸浸泡在一个盛有2．5—5mlZ·Buffer／X．gal溶液的平皿中；59521U加 四川农业大学博士学位论文第三章2．用镊子将另一张无菌滤纸铺在新鲜的酵母菌落平板上，用镊子轻擦滤纸，使菌落粘附在滤纸上；3．不对称的在滤纸上打孔作为定位标记：4．用镊子轻轻夹起滤纸，使有菌的一面朝上，小心浸入液氮，处理10see；5．当滤纸完全冻结后，用镊子轻轻夹起滤纸置于洁净的培养皿中，室温下解冻：6．重复步骤4和5，2．3次；7．让有菌落的一面朝上，轻轻置于预先在z-Buff既／X·gal中浸泡过的滤纸上，避免两层滤纸之间产生气泡；8．30"C下放置30rain．8h，定期观察显色情况。2．4．813-半乳糖苷酶活性(13一Galaetosidaseactivity)测定1．在5ml适当的液体SD培养基中接种单酵母菌落，培养过夜；2．振荡过夜培养菌液lmin，以打散细胞，吸取2ml菌液，转至8mlYPD液体培养基中：3．30"(2，250r／min摇床培养3．5h，在对数生长期(OD600=0．5．0．8)收集细胞，记录OD600值：4．分别取1．5ml培养液转移至三个1．5ml的离心管中，14000r／min离,D30see，弃上清，每管加入1．5ml的Z．Buffer，振荡悬浮；5．离心，弃上清，将沉淀重悬于0．3ml不Bu腑中，使浓缩因子为1．5／0．3=5．0；6．吸取0．1ml细胞悬液，转移至一个新的离心管中，浸入液氮冷冻处理lmin，然后，置于37"(2水浴lmin；反复冻融2次；在一个空白离心管中加7,．100pAZ．Buffer作为对照；7．在每个离心管中加入O．3ml的Z-Buffer／13．巯基乙醇，然后，再加入1601u1新配制的ONPG(4mg／m1)，置于37"(2水浴中，立即开始计时；8．呈现黄色时，加入0．4mllmoFL的Na2C03，记录反应时间，14000r／min离心lOmin，去掉细胞碎片；9．小心吸取上清并转移至比色杯中，测OD4加值；10．根据计算公式：B·半乳糖苷酶活性单位=1000XOD420](tXVXOD600)其中：t=反应时间(min)，V-----0．1X浓缩因子60 四川农业大学博士学位论文第三章3结果与分析3．1在酵母中融合表达的重组质粒的构建3．1．1重组质粒pBD—GmMYBZl、pBD—GmMYBZ2、pBD—GmMYBJ6和pBD．GmMYBJ7的构建根据GmMYBZl、GmMYBZl、GmMYBZl和GmMYBZl的基因的酶切图谱和pBridge质粒图谱的多克隆位点，设计了带有酶切位点EcoRI和SalI的引物ZDI-Y(F)和ZDl一Y(R)、ZD2-Y(F)和ZD2-Y(R)、JL6-Vff3和JL6-Y∞、JL7-Y(F)和JL7-Y∞，从连接有全长GmMYBZl、GmMYBZ2、GmM','BJ6需nGmMYKl7cDNA的pMDl8．喊体上扩增出完整的开放阅读框。将扩增片段克隆在Matchmaker酵母系统中pBridge载体的EcoRI和SalI位点，构建与BD(BindingDomain)翻译融合的效应质粒pBridge-GmMYBZl、pBridge-UmMYBZ2、paridge—GmMYBJ6和dpBridge-GmMYBJ7，转化大肠杆菌DH-5a，筛选阳性克隆。重组质粒的构建流程见图3．1。圈3-l重组质粒pBD-CnnM髓Zl构建流程图晦3-1CollstruetionoftherecombinaatplamlidpBD-GmMYBZl61 四川农业大学博士学位论文第三章图3-2重组质粒pBD-CnnMYBZ2构建流程图F嘻3-2Constructionoftherecombin∞tplasmidpBD—GmMYBZ2图3．3重组质粒pBD-GmMYBJ6构建流程圈啦3-3ConstructionoftherecombinantplasmidpBD-GmMYRl6 四川农业大学博士学位论文第三章图3-4重组质粒pBD-GmMYBJ7构建流程图№3-4Constmctionoft．herecombinantplasmidpBD-GmMYBJ73．1．2重组质粒的菌落PCR鉴定在四个重组质粒的转化LU(Amp+)平板上，分别挑取3个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果均为阳性，见图3-5。圉3-5重组质粒菌落PCR扩增结果▲lj韬pBD-GmMYBZI4，s,6pBD-GmMYBZ2B．pBD．GmMYR厝C．pBD-ConMYK／7F嘻3．-5"filecolonyPCRmnplificationoftherecombinantplasmidsA．I,2。3pBD-GmMYBZI4,5，6pBD-CnnMYBZ2B．pBD-GmMYBJ6CpBD-GmMYBJ763 3．1．3重组质粒的酶切鉴定．将PCR检测的阳性菌落转入LB(A血p+)液体培养基，37℃摇菌过夜，碱法小量提取重组质粒，EcoRI和Sall双酶切鉴定，pBridge-GmMYBZI、pBridge-GmMYBZ2、pBridge-GmMYBJ6和pBridge．GmMYBJ'／四个重组质粒均切出目标基因，结果见图3．6。圈3-6重组质粒的酶切结果～1．pBD-OmMYBZI的EcoRI单酶切2，3，pBD．GmMYBZIEcolⅡ和＆m双酶切4。pBD-GmMTBZ2的EcoRI单酶切5、6’pBD-GmMYBZ2EcoRI和跏双酶切R1．pBD-GmMYBJ6的EcoRI单酶切2，pBD-GmMYBJ6EcoRl和Sail双酶切3．pBD．．GmMYBJ7的EcoRl单酶切4，pBD．GmMYBJTEcoRI和SalI双酶切rig．3-6Thedigestionof恤erecombinantplasmids▲1，pad-GmMYBZldi删byEcoRI2、3，pBD-GmMYBZIdi删by删∞d斓4．pBD—GmMYBZ2digestedbyEcoRI5、6。pBD-GmMYBZ2digestedbyEcoRIandSa／lR1．pBD-GmMYBJ6digestedbyEcoRl2，pBD-GmMYBJ6digestedbyEcoRI∞d8a／I3，pBD．C,IMYB,：7digestedbyEcoRI4，pBD-GmMYBJ7digestedbyEcoRImidSalI3．1．4重组质粒的测序分析对菌落PCR和酶切鉴定阳性的重组质粒进行测序分析，然后，利用DANMAN软件分析。结果表明，paridge中GAI基因的DNA结合域与目的基因GmMYBZl、GmMYBZ2、GmMYBJ6、GmMYBJ7的融合表达正确，未发生移码(图3．7，3-8，3-9，3-10)。从而保证重组质粒pBddge-GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2、pBridge。GmMYBJ6和pBfidge-GmMYBJ7能够在酵母中正确表达。 四川农业大学博士学位论文第三章——一GALDNA-bindingdomain～一／-一一曲删'B幻TTGACTGTATCGCCG⋯⋯⋯⋯ATG(；AAACGAAGGACGAC⋯⋯⋯GACAGGTAGLTVSPMETKDR’圈3-7重组质粒pBD-GmMYBZI中融合蛋白表达的序列分析Fig．3-7Sequencemnlysisforthee*pressienoffusedproteininthccombinantplasmidpBD-GmMYBZl——GALDNA-bindingdomain——／——囟谢塌器}_———————————一TTGACTGTATCGCCG⋯⋯⋯ATGGGAAGGTCCCCTTGC⋯⋯⋯ATGAAATGALTVSPMGRSPCMK+图3-8重组质粒pBI)-GmAFIBZ2中融合蛋白表达的序列分析聊|蛋¨Sequenceanalysisfor血eexprcssienoffusedproteininthecombin自．tplasmidpBD-GmMYBZ2一一GALDNA-bindingdomain——／——踟蝴丑，争——TTGACTGTATCGCCG⋯⋯⋯⋯ATGGGAAGGGCTCCATGT⋯⋯⋯TCTGGCTAALTVSPMGRAPCSG+图3-9重组质粒pBD-GmMYBJ6中融合蛋白表达的序列分析盹．3-9S·!qllenceanalysisforIheexpl％siolloffusedproteininthecombinerpl∞midpBD-GmMYBZl——GALDNA—bindingdomain一／——一㈣伊——一——TTGACTGTATCGCCG⋯⋯．⋯．．ATGGGTAGAGCTCCTTGT⋯．⋯．．TACTACTGALTVSPMGRAPCY+圈3-10重组质粒pBD-GmMYBJ6中融合蛋白表达的序列分析№3-10SequenceanalysisfortheexpressienoffusedprmminlherecombinmltplasmidpBD'-GmMYBZI3．2重组质粒的酵母转化将构建好的重组质粒pBridge—GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2、pBridge-GmMYBJ6和pBridge—GmMYSJ7熟激转化酵母菌株AHl09，然后，均匀涂布于SD／-Trp和SD／-His／-Trp平板上；30"C，倒置培养2-4d。含有重组质粒pBridge—GmMYBZl、pBridge—GmMYBZ2、pBridge．GmMYBJ6和pBridge-GmMYBJ7的酵母菌株均能在SD／-Trp单缺陷培养基上生长，这说明，重组质粒己成功转入酵母AHl09中(图3-11)；而含有重组质粒pBridge—GmMYBZI的菌株则不能在SD／-His／-Trp双缺陷培养基上正常生长(图3-12A)，因此，推测GmMYBZl蛋白不具有转录激活功能或具有极微弱的 I四)rl农业大学博士学位论文第三荦转录激活活性；含有重组质粒pBridge—GmMYBZ2、pBridge-GmMYBJ6和pBridge—GmMYBJ7的酵母菌株均能在SD／一His／-Trp平板上正常生长，而含有pBridge空质粒的阴性对照菌株未能在SD／-His／-Trp平板上生长(图3．12B，D，F)；同时，B·半乳糖苷酶活性的滤纸检测均呈现出蓝色反应，说明GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均具有转录激活功能，并激活了下游的His和LacZ基因。3．3转化酵母菌株的B．半乳糖苷酶活性检测以ONPG为底物，对含有重组质粒pBridge-GmMYBZl、pBridge—GmMYBZ2、pBridge-GmMYBd6和pBridge．GmMYB．17的酵母菌株进行B-半乳糖苷酶活性检测，结果表明，含有质粒pBridge-GmMYBZl、pBridge-GmMYBZ2，pBridge·GmMYBJ6、pBridge-GmMYBJ7的酵母菌株13-半乳糖苷酶活性分别为3．59U、10．35U、28．48U和24．3lU(表3．6)。圈5-11含有重组质粒的酵母菌株在SO／-'I却上的生长情况～pBddge-CrmMYBZlRpBridge-GmMYBZ2c．pBridge-amMYK／6np蛋lfidge．GJ，ljIf功刃Fj蛋3-11．Cm)wthofyearconlainingrecombinantplasmids011SD／·哪▲pBddge,-UmMYBZI；B．pBridge-GmMYBZ2；CpBridge-GmMYBJ6；D．pBridge-GmMYR／7 四川农业大学博士学位论文第三章圈3-12GmMYBZIandG，柚册z2蛋白在酵母系统中的转录激活功能分析A：含pBf诅鳓^彻zf的酵母菌株在SD／-Trp／-His上的生长情况B：含pBfidge-GmMYBZ2的酵母菌株在SD／-Tqo／-His上的生长情况C：含pBridge．GmMYBZ2的酵母菌株滤纸显色情况D：含pBridge．-GmMYBJ6的酵母菌株在SD／-Tzp／-His上的生长情况E：含pBridge-GmMYBJ6的酵母菌株滤纸显色情况F：吉pBridge-G，，l^租B矽的酵母菌株在SD／-Trp／-His上的生长情况G：含pBfidge-GmMYBJ7的酵母菌株滤纸显色情况lrtg．3-12TIⅫ∞iptiomlactivationassayoftheGmMYBZIandGmMYBZ2proteinbyyeastexpressionsystemA：Yeast∞呲ai口iDgpBndge-C-mS秤BZlgrowsolltheplateofSD／-Trp／-HisB：Yeast“删面丑ingpBridge-GmMYBZ2fftows∞theplateofSD／-TqA／-HisC：Colony-liftfilterassayofyeastcontusingthepBridge-GmMYBZ2D：YeastcontainingpBridge：-GmMYBJ69rowsol3theplateofSD／-Tm／-HisE：Colo．-liftfdtcrassayofyeasto啊比缸ningthepBridge-GmMYBJ6F．Yeast∞曲dnil唱pBridge-GmMYBJ79rowsOlltheplateofSD／-Trp／-HisG：Colony-liftIlI俯assayofyeast“m曲血血gthepBridge-GmMYBJ7 表3_6CmaMYBZI、C,mMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白在酵母中的B．半乳糖苷酶活性检测Table3-6I№idaseacdvityassayofCnnMYBZI，Gnl~IYBZ2，GmMYBJ6andGmMYBJ7proU缸inyeast4讨论绝大部分植物R2R32MYB蛋白具有转录激活功能域。Kranz等根据植物中R2R32MYB蛋白的C-端氨基酸序列把这此-__．R2R32MYB蛋白分组，发现各亚组的保守序列中有的富含酸性氨基酸，有的富含Ser／Thr，有的富含Pro和Gin，有的同时具备上述几个特征[681。这提示R2R32MYB转录因子大都具有转录激活功能。陈俊等从水稻未成熟种子中克隆了5个R2R32MYB基因，它们编码的蛋白质C．端均具有上述转录激活功能域特征，并利用酵母单杂交系统证实了其中两个蛋白具有转录激活功能【12”。酵母表达分析表明，本研究所克隆的4个M冶基因中，GmMYBZ2、GmMYBJ6、和G坍枷缓，7分别具有不同强弱的转录激活活性，这与前面的结构分析的预测结果基本一致。而含有pBridge-GmMYBZl的酵母菌株不能在SD／-Trp／-His双缺陷培养基上正常生长，Whatman滤纸检测中未能呈现明显的蓝色，B．半乳糖苷酶活性仅为3．59U，表明其转录激活活性极其微弱。序列同源性比对结果显示，CanMYBZl与拟南芥的TZ具有较高的同源性，同属R2R3MYB转录因予中的第6亚群，而rr2的转录激活功能需要bHLH蛋白TT8的参与【l”】，因此，推测GmMYBZl蛋白的功能可能同样需要bHLH蛋白或其它蛋白因予的协同作用。研究发现，玉米的Cl、P1分别需要与bHLH蛋白R和B的相互作用，才能激活靶基因；而拟南芥表皮毛和根毛的特化同样也需要MⅥ≥蛋白与bHLH蛋白及WD40类蛋白的相互作用is2,∞】；在矮牵牛花中花青苷生物合成途径的研究中，Quattroc圮hio等也发现了MYB类转录因子AN2与WD40类蛋白ANll和bHLE类蛋白JAFl3的互作现象【123】。这进一步表明，植物MYB类转录因子存在着与其它转录因子组合调控的现象，同时揭示组合调控可能是MYB类转录因子参与转录调节的一种重要机制。 四川农业大学博士学位论文第四章第四章GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7转录因子的亚细胞定位摘要：构建绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)融合表达载体p163一GFP—GmMYBZ2、p163．GFP-GmMYBJ6和p163-GFP—GmMYBd7，以空载体p163-GFP为对照，基因枪法转化洋葱表皮细胞，激光扫描共聚焦显微镜观察OmMYBZ2、CmlMYBJ6和G-mMYBJ7蛋白的亚细胞定位情况，结果表明，CanMYBZ2、CmuMYBJ6和CmuMYBJ7蛋白均定位于细胞核中。1前言绿色荧光蛋白(gre％fluorescentprotein，GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。1962年，Shimomura等首先从多管水母口叼甜D，缸v泐nr神中分离出一种由单一多肽链构成的20kD的水母蛋白∞quo血)【1删。1992年Prasher等克隆了G即基因的eDNA，并对GFP的一级结构进行了分析n4”，1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河n42】。近年来，随着GFP在各种异源细胞中表达的研究，GFP已经发展成为现代生物学研究的一个精确工具。MYB转录因子只有进入细胞核，与目标启动子中的顺时作用元件结合后，才能激活下游靶基因，进而调控相关的生理代谢。为了研究所获得的C_mLMYBZ2、G-mMYBJ6和GmMYBJ7三个MYB转录因子是否定位于细胞核，我们设计构建了与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒，基因枪法转化洋葱表皮细胞，对GmMYBZ2、CanMYBJ6和GmMYBJ7的皿细胞定位进行了研究。2材料与方法2．1材料2．1．1实验材料洋葱 2．1．2载体与菌株pGFP-163pMDl8-T克隆载体大肠杆菌(Escherichiacoli)：DH5a2．1．3培养基1．MS固体培养基(1L)：贮备液I贮备液II贮备液Ⅲ贮备液Ⅳ蔗糖琼脂粉2．贮存液I(1L)NH4N03KN03CaCh·2H20MgS04·71120KH21'吼3．贮存液IIOUKIH3803MnS0‘·41120ZnS04·71t20CuS仉·5H20CoCl2·6啦O中国农业科学院品质所王天宇实验室提供1jd‰本室保存50m15ml3098933000rag38000mg8800nag7400nag3400nag166nag1240nag4460mg1720mg50nag5rag5mg70 四川农业大学博士学位论文第四苹4．贮存液III(1UFeS04-7H205560ragNa2EDTA·2H207460mg5．贮存液IV(1L)肌醇20000nag烟酸100nagVB6100mgVBI100mg甘氨酸400mg2．2方法2．2．1引物设计与合成设计合成分别含有酶切位点Sa／I和BamHI的引物GFP-ZD2(F)、GFP-ZD2(R)、GFP-P_．6(F)、GFP-P．．6(R)及含有酶切位点Hindm和BamHI的引物GFP-JL7(F)和GFP．JL7(R)，序列见表4．1。表4-1噩细胞定位所用引物Table4—1Theprilnel'susedinsubcallularlocalization引物编号引物序列GFP-ZD2(F)GFP-ZD2(R)GFP-JI．,(R'F)GFP-P_,6(R)GFP4LT(F)GFP-JL7(R)5LCACGTcGACAGl：雕rI珂3GAAGGl℃C·3．50^1℃GGATcCTrrC^TrroC从GCG-3。50TQAGTCGAC^：rmTOOGAAGGGCT．3。5LGrGG^1℃C1：^：]rGCCAG^：r(托限GGA-3’5LGAGAAoCTrI瑚^：n3GGl粥AOCl℃-3’5’．CGl∞^：I℃CTGCGlAGl：^CG’rGACT-3’2．2．2GFP融合表达载体的构建利用引物GFP-ZD2(F)和GFP-ZD2(R)、GFP-JL6(F)和GFP-JL6a时、GFP-JL7(10和GFP．JL7(R)从连接有全长GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7eDNA的pMDl8-T载体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和p163-GFP载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶将GmMYBZ2、GmMYBJ6分别克隆在p163-GFP载体的Sall7l 四川农业大学博士学位论文第四苹和BamH]位点，将GmMYBJ7克隆在p163．GFP载体的HindIII和BamHI位点，构建与GFP翻译融合的表达载体p163．GFP．GmMYBZ2、p163一GFP—GmMYBJ6和p163-GFP-GmMYBJ7。2．2．3重组质粒的转化及菌落PCR鉴定方法同2．2．3．6和2．2．3．72．2．4重组质粒的小量提取(碱法)及酶切鉴定方法同第三章的2．4．4和2．4．52．2．5基因枪法转化洋葱表皮细胞1．材料准备将洋葱内表皮(第五层)切成O．5cruX0．5cm小块，撕下后背面朝上，摆放于MS培养基，预培养4h。2．金粉悬液制备1)称取20mg(40枪)1．Opmol／L金粉，放入1．5ml离心管中，加入500pl无水乙醇，涡旋振荡lmin，10000r／min离心lmin，弃上清，重复3次；2)加入500pl灭菌的双蒸水，涡旋振荡1rain，10000r／min离心lmin，弃上清，重复2次；3)加入400pl灭菌的双蒸水，涡旋振荡悬浮金粉，在涡旋振荡器慢速不停机的情况下，将金粉平均分配到lO个0．5ml离心管中，每管40pl，4"C保存；2．基因枪微粒子弹制备1)DNA，金粉(直径为1．0um)，亚精胺，CaCh按下表混合：质粒DNA4119金粉悬液C50mg／m1)6山O．1mol／L亚精胺4pl2．5mol／Lcach6m2)混合振荡混匀3rain；3)冰上静置15rain；4)12000rim离心lOsec(指转速达到12000后lOsec)：5)弃上清，加入140pl无水乙醇粗振荡后(打散金粉)，12000r／m离心lOsec收72 四川农业大学博士学位论文第四苹集金粉沉淀；6)加入209l无水乙醇悬浮沉淀，待用。3．转化1)打开超净台，用75％7,醇擦拭超净台内部和基因枪的表面及内部；2)打开紫外灯，灭菌30min；3)按前述步骤准备微弹；4)将易裂片、微弹载体、阻拦网置于75％乙醇中灭菌处理5．0min，然后置于滤纸上自然风干；5)打开气瓶，调节压力至2000psi；6)将微弹均匀涂于微弹载体上，10I_tl／枪；7)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中；射击参数为：Gapdistance：20mm；微弹载体飞行距离(Macroprojectileflightdistance)：10mm；微弹飞行距离(Particleflightdistance)：7cm；压力：1350psi；真空度：25inchesHg．；8)把培养皿放在托盘上，使洋葱表皮集中在托盘中间的圆圈内，将托盘插入倒数第二档；9)打开基因枪的电源；10)打开真空泵；11)关闭基因枪的门，按下抽真空键(Vat)，当真空表读数达到25inchesHg．时，使键置于“保持”饵old)档；12)按下射击键(Fire)直到射击结束：13)按下放气键，使真空表读数归零；．14)打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封1：3膜封好；15)重复上述步骤，2枪／fm，直至完成转化。4．培养条件25"(2暗培养24—36h5．LeicaTCSSP2激光扫描共聚焦显微镜观察实验结果。73 四川农业大学博士学位论文第四苹I3结果与分析3．1与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒的构建3．1．1重组质粒p163-GFP—GmMYBZ2、p163一GFP-GmMYBJ6和p163-GFP-GmMYBJ7的构建根据GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7的基因的酶切图谱和p163一GFP质粒图谱的多克隆位点，设计了带有相应酶切位点的引物GFP-ZD2(F)和GFP-ZD2(R)、GFP·儿6∞和GFP·几60}Q及GFP-JL7(F)和GFP-JL7(R)从连接有全长GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7eDNA的pMDl8．T载体上，分别扩增出完整的开放阅读框。扩增产物经双酶切后，连接至p163．GFP载体相应的位点，构建与GFP翻译融合的表达载体p163-GFP-GmMYBZ2、p163-GFP．GmMYtLl6和p163·GFP-GmMYBJ7。重组质粒的构建流程(见图4．1，4．2，4．3)。3．1．2重组质粒的菌落PCR鉴定在三个重组质粒的转化LB(Amp+)平板上，分别挑取4个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果p163·GFP—G研枷限，俩个为阳性，p163一GFP-G研肘yB刀四个均为阳性，见图3．5。图4．1重组质粒pi63．-GFP-CnnMYBZ2构建流程图F咄．4-1Comaruetionoftherecombhaamplasmidpl63-GFP．-GmMYBZ274 四川农业大学博士学位论文第四章圈4-2重组质粒p163-GFP-C-mMYBJ6构建流程图晦4-2Comtructionoftherecombinantplasmidpl63-GFP--GmMYBJ6圈¨重组质粒p163-GFP-C-mMYB刀构建流程图珊．4-3Censmtctionoftherecombinantplasmidpl63-GFP--C,mMYB刀75 四川农业大学博士学位论文第四章图4．4重组质粒菌落PCR扩增结果^p163-GFP-C-m．¨q'BJ7Rp163-GFP-GmMYBZ2Cp163-GFP—GmMlq姒6飓4-4ThecolonyPCRamplificationofrecombinantplasmkh^p163一GFP-C-mMYBJ7Rp163-GFP-GmMYBZ2Cp163．GFP．GmMYBJ6圈4-5重组质粒的酶切结果丸p163．GFP-GmMYBZ21,$alll单切2．Sail和Baml孤取切B．p163．GFP．Gm朋蝴l盘柚单切2。Sa／／和Barz讲I双切C．p163．GFP．Gm^f陋，71,Hindill单切2。HindllI和BamHI双切rig．4-5ThedigestionofthecanbimmtplasmidsA．p163-GFP-GmMYBZ2i,Thedigestionby’Sa／／l2，Thedigestionby’SailandBamHIB．p163-GFP-GmMyBJ61,ThedigestionbySalll2,ThedigestionbySellandBam／-／IC．p163-GFP．．GmMYBJ61,ThedigestionbyH／nd[1I2，ThedigestionbyHindlllcadBamttI 四川农业大学博士学位论文第四章GmMYBz2／一——GFP————ATGGGAAGG．．⋯．CGCTTGGAAATGAAA⋯⋯ATGGTAGATCTGACTMGRLEMKMVDLT圈4．6重组质粒pBD-GmMYBZ2中融合蛋白表达的序列分析Fig．4-6se单I∞∞analysisforthea中ressi∞offu．∞dixotcmiathecombinamplasmidpBD-GmMYBZ2G删B36／————GFP⋯ATGGGAAGG⋯⋯GGTCCATCTGGC⋯⋯ATGGTAGATCTGACTMGRGPSGMVDLT圈4．7重组质粒pBI卜GmMYKl6中融合蛋白表达的序列分析■i量4-7scqII赫∞蛳lysisforthca甲佗ssionoff捌p硎ninthecombinantplasmidpl63-GFP-C,mM]'BJ6／-—一Gn。————一——ATGGGTAGA⋯⋯AGAGTCACGTACTAC⋯⋯ATGGTAGATCTGACTMGRVTYMVDLT圈4毒重组质粒p163-GFP-GmMYBJ7中融合蛋白表达的序列分析Irlg．44se哪lalccanalysisfortl地a事蝇咖offiIsedpl岫inthecombinamplasmidpl63-GFP-C,mMYE／7翻4-9GmMYBZ2，GmMYBJ6和GmMYBJ7亚细胞定位^对照(p163-GFP)kC．nMYBZ2CGmMYBJ6D．C,mMYBJ7Fig．4-9ThcsIlh∞ⅡIl口localizationofC．nMYBZ2、C,mMYBJ6aldC,mMYBJ7A．Con自ol(p163-GFPlRC,mMYBZ2CC,mMYBJ6D．C,mMYBJ7 四川农业大学博士学位论文第四章3．2重组质粒在洋葱表皮细胞中的瞬时表达通过基因枪法，将构建好的重组质粒p163．GFP．GmMYBZ2、p163．GFP．GmMYBJ6和p163-GFP．G枷口蛾入洋葱表皮细胞，25"C，暗培养24-36h后，激光扫描共聚焦显微镜观察。结果显示，在转化空载体p163．GFP的洋葱表皮细胞中，绿色荧光分布在整个细胞中：在转化重组质粒p163一GFP．GmMYBZ2和p163．GFP．GmMYBd6的洋葱表皮细胞中，细胞核部位均观察到有绿色荧光；而转化重组质粒p163．GFP．GmMYBJ7的洋葱表皮细胞中，在细胞核和细胞膜上均观察到有绿色荧光，见图4．9。因此，GmMYBZ2和GmMYBJ6定位于细胞核，而CrmMYBJ7除定位于细胞核之外，还可能定位于细胞膜上。4．讨论绿色荧光蛋白是来源于发光水母的一种独特的蛋白质，自1992年P哪shcr等人分离克隆出GFP的cDNA以来【14”，绿色荧光蛋白基因作为一种新型的标记基因，已日益引起人们的兴趣和关注。近年来，对其结构、发光机制等理化性质的研究也取得了较大的进展【⋯，GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅助因子参与‘1删。无论在活体细胞还是在完整的转基因胚胎、动物或植物中，都能有效地监测基因转移的效率。此外，还具有荧光稳定f145，1461、无毒掣1471、通用性、易于构建载体以及可以进行细胞定时定位观察等特点【14川。迄今为止，GFP已在大肠杆菌、酵母、果蝇、鼠及植物等多种异源细胞中表达。随着对GFP的基础理论研究的深入和新型突变体的不断出现，荧光蛋白将会在分子生物学领域发挥出更大的作用。真核基因的表达随细胞内外环境的改变而在不同层次上受到精确调控，如染色体DNA水平、转录水平及转录后水平的调控等。而转录水平的调控发生在基因表达的初期阶段，是很多基因表达调控的主要方式。转录因子是转录水平调控靶基因表达的一种重要的反式作用因子，它通过与靶基因调控区的顺式作用元件相互作用，或调节基因表达的强度，或应答激素刺激和外界环境胁迫，或控制靶基因的时空特异性表达f1，62，1491。然而，转录因子首先要在核定位信号的引导下或在其它蛋白的协助下进入细胞核中，方能发挥其调控功能。本研究利用基因枪法将重组质粒p163．GFP．GmMYBZ2、p163一GFP—o础嬲，6和p163-GFP-Gm^4阳憔入洋葱表皮细胞进行瞬时表达，结果在转化细胞的细胞核中均检测到了绿色荧光，说明GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7蛋白均能定位于细胞核；此外，发现在p163-GFP-GmMYBJ7的转化细胞中，细胞膜上7R 四川农业大学博士学位论文第四章也有较弱的荧光，推测可能与CnnMYBJ7的其它生物学功能有关。 四川农业大学博士学位论文第五章第五章GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7在烟草中的表达及其相关功能分析摘要：构建植物表达载体pCAMBIA2301．GmMYBZ2、pCAMBIA2301-GmMYBJ6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7，利用农杆菌介导法转化烟草NC89；通过IOn抗性、Gus染色及RT-PCR筛选鉴定阳性苗；RT-PCR检测结果显示，GmMYBJ6可提高类黄酮代谢途径中的苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、肉桂酸-4．羟化酶(C4功、4·香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、黄酮醇合成酶(FLS)等关键酶的表达，而GmMYBZ2和GmMYBJ7则具有抑制作用；总黄酮检测表明，在GmMYBJ6表达的烟草中，总黄酮含量增加，对紫外辐射、高盐及干旱的抗性增强，而GmMYBZ2和GmMYBJ7表达的烟草中，总黄酮含量降低，对紫外辐射、盐渍及干旱的抗性明显下降；同时发现，GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7还与受体植物叶片等器官的形态建成有关。1．刖菁将目的基因转入受体植物，通过过量表达或抑制表达是研究目的基因功能最直接、最有效的手段之～。烟草作为分子生物学和基因工程研究的模式植物，生长速度快，再生能力强，占用空间小，经济方便；而且农杆菌介导的遗传转化体系也较为完善和成熟，为基因工程的研究和应用提供了理想的研究材料。因此，本研究选择烟草为受体植物，构建植物表达载：弱kpCAMBIA2301-GmMYBZ2、pCAMBIA2301一GmMYBJ6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7，通过农杆菌LBA4404介导，将目的基因导入其中，对3个目的基因对类黄酮代谢的调控以及耐逆性等功能进行了初步的研究，为进一步研究和解析MYB转录因子的功能提供了一定的理论基础。2．材料与方法2．1材料2．1．1植物材料烟草NC89，由本实验室保存。 四川农业大学博士学位论文第五章2．1．2菌株及载体大肠杆菌饵coli)：DH5ct农杆菌C49robacteriumtumefaciens)菌株LBA4404pUC—STNpUC-ST4ApBR322pCMBIA2301pMDI8一T克隆载体本室保存TaKaRa本室保存1bKaRa2．1．3实验中所用试剂与药品各种限制性内切酶、rTaq酶、ExTaq酶购自Takara公司，T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs，Taq酶购自北京普博欣生物技术公司；SUPERSCRIPTTMⅢReverseTranseriptase购自lnvih'ogen公司；TRNzol总RNA提取试剂购自北京天根科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根科技有限公司；EasyPureMiniPlasmidPurificationKit购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。2．1．4培养基1．LB细菌培养基：胰蛋白胨酵母提取物NaCllOg59lOg用NaOH调pH至7．0，灭菌待用，固体培养基加1．5％琼脂配成。2．YEB培养基：胰蛋白胨酵母提取物蔗糖MgS04用NaOH调pH至7．5，59lg590．59灭菌待用，固体培养基加1．5％琼脂配成·暑l 四门l农业大学博士学位论文第五苹3．MS培养基：配方同第四章2．34．MS选择培养基：MS基本培养基中加入6-BA(3．0rag／L)，NAA(0．2mg／L)，头孢拉定(500rag／L)及卡那霉素000mg／L)5．MS生根培养基：MS基本培养基中加入头孢拉定(500rag／L)及卡那霉素(U00mg／L)2．2方法2．2．1引物设计与合成设计合成含有酶切位点劢口I和SacI的引物pUCSTN-JL6(F)和pUCSTN—JL6(R)及含有酶切位点XbaI和印"I的引物pUCST4A-ZD2(F)和pUCST4A-ZD2(R)及pUCST4A·JL7(F)和pUCST4A-JL7(R)，序列见表5·1。表5-1构建植物表达载体所用引物Table5-1PrimersusedinconsU'nctionofplantexpressionvectors引物编号引物序列pUCST4A-ZD2伊)pUCST4A-ZD20DpUCSTN4L6(F)pUCSTN·JL6(R)pUCST4A4L7(F)pUCST4AdL7(R)5L^C^：rClAGAAGlⅪGGGAAGGTCCC-3‘5‘-(KTGGl=ACCTCTCACTTCTCTCC从-3’5q啊TCIAG从CC^：r11瑚AAGGG-CT-3。5'-CACGAGCTCTITACCTTTATITrCTGT-3’5吼G1℃TAG从CC^=r(瑚1AGAOCTC■3’5LAGAGGlACCGTCC从C从GTCATAAGTC-3’2．2．2植物表达载体的构建2．2．2．I表达载体pCAMBIA2301一GmMYBZ2、pCAMBtA2301·GmMYBJ6和pCAMBIA2301一GmMYBJ7的构建利用引物pUCSTN-JI．石(F)和pUCSTN-JL6㈣、pUCST4A-ZD2(F)和pUCST4A—ZD2(R)及pUCST4A-JL7(F)和pUCST4A-JL7(R)从连接有全长GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7cDNA的pMDl8．T载体上扩增出完整的开放阅读框。扩增产物和载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收后，T4连接酶将GmMYBJ6连接于中间载体pUCSTN 四川农业大学博士学位论文第五章的劢口I和SacI位点，SphI和＆D尺I双酶切切下完整表达框，并连接至中间载体pBR322的SphI和＆积I位点，然后，用勋n和EcoRI双酶切，切下完整表达框，连接至pCAMBIA2301的Sa／I和EcoRI位点，构建植物表达载体pCAMBIA2301一GmMYBJ6；将GmMYBZ2和GmMYBJ7连接于中间载体pUCST4A的XbaI和KpnI位点，然后，用HindIII和＆积I双酶切切下完整表达框，连接至pCAMBIA2301的胁H棚I和＆积I位点，构建植物表达载体pCAMatAE3m-GmMYBZ2和pCAMBIA2301-GmMYBJ7。2．2．2．2重组质粒转化大肠杆菌DH50c及菌落PCR鉴定方法同第二章的2．2．3．6和2．2．3．72．2．2．3重组质粒的小量提取及酶切鉴定方法同第三章的2．4．4和2．4．52．2．3烟草的遗传转化2．2．3．1农杆菌感受态细胞的制备及转化1．挑取单菌落LBA4404接种于5nllⅦB液体培养基(含50m|乒RiD中，28"C200r／min振荡培养过夜：2．取2ml菌液转入100mlYEB液体培养基(含50mg／L黜D中继续培养至OD鲫m0．5o3．转入50ml无菌离心管中，冰浴30rain，4℃，5000r／rain离心5min，弃上清；4．加入10ml预冷的50mmol／LCa02重悬菌体；5．4"12，5000r／min离心5rain，弃上清；6．加入1／10体积预冷的50mmol／LCaCl2重悬菌体；7．分装于无菌1．5ml离心管中，200111／管，4"C保存备用；8．取lstg提取纯化的重组质粒DNA，加入2001Ⅱ1感受态细胞中，混匀；9．冰浴10rain，转入液氮冷冻5rain，迅速置于37"C水浴，热激5min；lO．加入500ILlIYEB液体培养基，28"(2，200r／rain振荡培养2-3h；11．5000r／rain离心2min，弃上清：12．剩余菌液用移液器反复抽吸悬浮，然后均匀涂布于YEB平板(含50mg／LRif,100mg／LIOn)表面，28"C培养2-3d。2．2．3．2含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定挑取YEB平板上的单菌落，接种于5mlYEB液体培养基(含50mg／LRif,100mg／L 四川农业大学博士学位论文第五章Kan)中，28"(2培养1-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。2．2．3．3烟草的遗传转化1．将含有植物表达载体的农杆菌菌液均匀涂于YEB平板(含50mg／LRif,]00mg／LKan)，lml／板，28"(2培养过夜；2．用枪头轻轻刮取菌体，并转入MS液体培养基中，使悬浮液01)600约为0．5；3．取无菌苗的叶片，切去边缘和主要叶脉，切成0．5cm大小的方块；4．将切好的外植体在农杆菌菌液(OD600=0．5)中浸泡5一lOmin：5．用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入表面铺有一层滤纸的MS固体基本培养基，28"C，暗培养3d；6．将材料转到含有Kan(100me／L)的分化培养基中25℃培养(光周期为16h光照／Sh黑暗)至抗性芽分化。2．2．4转基因烟草的筛选2．2．4．1Kaa抗性苗的筛选待抗性芽生长至2．3锄高时，切下小芽转入生根培养基中，培养基中Kan浓度降至50mg／L以利于诱导生根。待幼苗生根后，将其转入新的生根培养基中，此时将Kaa的浓度提高至200mg／L，用以降低转化植株的假阳性率，从而减少后续筛选的工作量。2．2．4．2转基因烟草的GUS染色检测1．Gus染色液的配制O．1mol／L磷酸缓冲液(Na3P04)PH7．05mmol／LK3tr《CN)6】5mmol／LK4[Fe(CN)6】．31-1200．5mmol／LEDTA甲酵Triton-x．100X—Gluc(5mg／501a1)(DMSO溶解)7501tl101ttllOp．120pl200pl11．tl10p．12．直接染色法挑选已生根的抗性苗，将叶片剪成小块浸泡入Gus染液中，37"(2恒温箱中染色过夜；将叶片转入75％乙醇脱色2．3次，至阴性对照材料呈现白色。Niekon34 四川农业大学博士学位论文第五章SMEl000体式显微镜观察记录染色结果。2．2．4．3转基因烟草的RT-PCR检测选择Gus染色阳性的转化株，剪取叶片，TRNzol提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。方法参照第二章的2．2．1和2．2．8．42．2．5GmMYBz2、GmMYBJ6和GmMYBJ7对烟草类黄酮代谢的影响2．2．5．1引物设计与合成根据已发表的烟草中类黄酮代谢途径关键酶的序列，分别设计苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、肉桂酸．4．羟化酶(C4均、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3哪、黄酮醇合成酶口Ls)等酶的基因特异弓l物，见表5-2。表5-2转基因烟草中类黄酮合成途径关键酶表达分析所使用的引物Table5-2Prinlafsusedinthetranscriptionalexpressionanalysisofsomekeygenesintheflavonoidmetabolismpathwayintransgenictobacco引物编号引物序列nU，Fn咻4C【，F4C腿CAH．PC4H-RCHS．FCHS-RCm-FCm．RF3H—FP3H-RF脚FL姝N-Act(F)N-Act(R)50IBCCAAOCImGACTrGAGOCA兀：3‘譬n÷L§￡÷LG}忑～GGAAGAQQ嫩嫩KCo警5’-TTbCTIW^=rrI了G1吼^=rCGlA-3。5’-CCTllAGGT^^：rCCAGl℃G1CCC．3。5t．AGCAGAAGGG^GAA^TC从CGA-3’5’-TGrll啪1AGCCAccAAGC^J：3。5’-GGCAGCCoCGGl℃^：rⅣL1：^G-3’5LGCAACACTGTGGAG从CAACAGTC’p3‘5、刚rATcGl℃ACAGGl℃CCr兀BA0-3‘5℃ATGTrI啪CA^：r殚L1BG^：rrcC；3’5’-C,CGACl℃GTG^：啪TGGCA-3’5’-AcTrCrrGAGOCOAGCCAACTC-3。髫．1G^GG矾G气^Cc^cAAG^oG^Gad50GTcCTrrGl℃ACTGTrGTCCD啪．3’5’-GCTGl-rnrFCClAGl：^：rrGT嘲TC．3‘5■U钮ACCTGrrGTAcGGCCAClle卜3l2．2．5．2转基因烟草中类黄酮代谢的相关酶的表达分析分别以GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7等三个基因的转化阳性苗的总RNA，反转录获得的eDNA作为PCR扩增模板；预实验确定RT-PCR循环数，以保证目的基因与内标基因的扩增均在指数期。利用烟草Actin基因(ABl58612)特异引物N-Act00和N-Act(R)，PCR调整所有eDNA至浓度一致；分别以PAL、CAH、4CL、85 四川农业大学博士学位论文第五覃CHS、CHI、F3H、FLS等酶的基因特异引物进行RT-PCR扩增，检测其在转基因烟草中的表达情况。2．2．5．3转基因烟草中总黄酮含量分析1．吸收曲线的建立1)标准溶液配置：精密称取干燥至恒重的芦丁标准品5mg于一容量瓶中。精密吸取2．5ml甲醇于烧杯中，水浴微热使溶解，蒸馏水定容至10ml。2)标准曲线测定：分别精密吸取标准品溶液0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2ml于比色管中，加入5％NaN02溶液lml，摇匀，放置6min。再加入5％的AlCl3溶液lml，摇匀，再放置6min。加入4％的NaOH溶液5ml，用蒸馏水定容至10ml，放置15min，在波长510rim处测定吸收度，建立线性回归方程。2．样品检测1)样品的提取：植物材料在液氮中充分研磨，称取约O．19(每一样品3个重复)按照O．19鲜重／lml甲醇的比例加入预冷的色谱纯甲醇，密闭、避光、超声波处理15min，8000r／min离心10rain，吸取上清液，经0．45pro微孔膜过滤，收集滤液至lmlHPLC专用小瓶中密闭，4℃保存。2)样品的测定：吸取O．5ml样品转入15ml比色管中，加入5％NaN02溶液lml，摇匀，放置6rain；再加入5％的AlCl3溶液lml，摇匀，再放置6min；加入4％的NaOH溶液5ml，用蒸馏水定容至10ml，放置15rain，然后，在波长510rim处测定吸收值。2．2．6转基因烟草的耐胁迫分析2．2．6．1转基因烟草的耐紫外辐射分析分别选取GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的转化阳性苗，以及转入pCAMBIA2301空质粒的烟草苗，经温室炼苗后，植入营养土中，培养7-10d，待烟草苗恢复正常生长后，进行UV-B辐射，30rnin／d，连续处理5．7d，观察烟草转化苗的变化，拍照记录实验结果。．2．2．6．2转基因烟草的耐盐性分析分别选取GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的转化阳性苗，以及转入pCAMBIA2301空质粒的烟草苗，将其转入含有300mmol／LNaCI的MS液体培养基中，温室25"C培养(光周期为16h光照／8h黑暗)，观察烟草转化苗的变化，并拍照记 四川农业大学博士学位论文第]匠苹录实验结果。2．2．6．3转基因烟草的耐旱性分析分别选取GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的转化阳性苗，以及转入pCAMBIA2301空质粒的烟草苗，将其转入含有10％PEGS000的MS液体培养基中，温室25"0培养(光周期为16h光照／8h黑暗)，观察烟草转化苗的变化，拍照记录实验结果。3．实验结果与分析3．1植物表达载体的构建3．1．1表达载体pCAMBIA2301一GmMYBZ2、pCAMBIA2301一Gm肘删6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7的构建利用引物pUCSTN棚L6aF)和pOCSrnq-JL6(R)、pUCST4A-ZD2(F)和pUCST4A-z02(a)及pUCST4A-JL7(F)和pUCST4A-JL7(R)从连接有全长GmMYBZ2，GmMYBJ6和GmMYBJ7eDNA的pMDl8-T载体上扩增出完整的开放阅读框。分别将GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7连接至pUCSTN和pUCST4A相应的酶切位点，测序检测正确后，分别将GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYIU7切下，并连接于pCAMBIA2301相应的多克隆位点，构建植物表达载体pCAMBIA2301·GmMYBZ2、pCAMBIA2301-GmMYBJ6和pCAMBIA2301．GmMYBJ7，构建过程见图5-1、图5-2及图5-3。3．1．2重组质粒的菌落PCR鉴定在三个重组质粒的转化LB(Kan+)平板上，分别挑取两个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果均为阳性，见图5-4。3．1．3重组质粒的酶切鉴定将PcR检测的阳性菌落转入LB(Kan+)液体培养基，37"0摇菌过夜，碱法小量提取重组质粒，进行酶切鉴定。pCAMBIA2301-GmMYBZ2、pCAMBIA2301-GmMYBJ6、pCAMBIA2301-GmMYBJ7=_．个重组质粒均被切出目标带，酶切结果正确，见图5—5。3．2含有表达载体的农杆菌PCR检测将重组质粒pCAMBIA2301-GmMYBZ2、pCAMBIA2301一GmMYBJ6．pCAMBIA2301一GmMYBJ7分别转化农杆菌LBA4404，以转化后的农杆菌的菌液作模板，未转化的农87 四川农业大学博士学位论文第五章杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。检测结果表明，上述三个重组质粒已成功转入农杆菌中，见图5-6。图5．1表达载体pCAMBIA230I．．GmMYBJ6的构建流程圈Fig．5-1Constructionoflheexpf∞si∞vectorpCAMBIA2301-CnnMYBJ688 四川农业大学博士学位论文第五章图5-2表达载体pCAMBIA230I-GmMYR]7的构建流程图Fig．5-2CowemctionoftheexpressionvectorpCAMBIA2301-CrmMYB07 圈5．3表达载体pCAMBLA2301-GmMYBZ2的构建流程图F．唔5-3Constructionof血eexpressionvectorpCAMBIA2301-CnnMYBZ2圈量_4重组质枝蔼落PCR扩增结果^pCAMBIA2301．GmMYBZ2B．pCAMBIA2301-CnnMYBJ6cpCAMBIA230I．．GmMYBJ7CK大肠杆菌DH-5d(阴性对照)啦“mcolonyPCRamplificationofrecombinantplasmidsA．pCAMBLA230I-GmMYBZ2B．pCAMBLA2301-GmMYRl6C．CAMBIA2301-CnnMYB,／7CILE，coliDH-5ct∞negativecon血ol 四川农业大学博士学位论文第五章ApCAMBIA2301-GmMYBZ2B．p(、A姗IA230l·o，lIIn-巳胚C．“：AmIA230l-Gm肘q'Bz'／丸pCAMBIA2301-GmMYBZ2B．pC／LMBL4,2301-Gm珊酊6C．pCAMBL^2301．GmMYKl7byXballsad勋口I图5-5重组质粒的酶切结果1，硒lI单酶切2，XbalI和rpnl取酶切1，Sall单酶切2，SalI和EcoRI双酶切3，PstI单酶切t,Hindm单酶切2。HindHI和gcoRl双酶切3。Xba／I和r4mI双酶切豫5-5Digestionanalysisoftherecombinantplasmidsl,Thedigestionby晦w12,ThedigestionbyXbalend劬I1,ThedigestionbySalI2,1"Vaedigeai∞by8allandEcoRI3，ThedigestionbyPsiI1,ThedigestionbyHindHl2，Thedi蜊ionbyHindIll∞dEcoRl3,Thedigestion图5-6舍有表达载体的农杆菌LB^4404的菌落PcII▲pCAMBIA2301-GmMYBZ2B．pCAMaIA230t-GmMYBJ6CpcAMBIA2301-GmMYBJ7pc墨连接有目的基因的pMDl8·T(阳性对照)nCIL农杆菌LBA4404(阴性对照)Fig．“PCRamplificationofAgrobacterimnLBA4404∞majningexpressionv∞tofs^I，cAMBIA2301-GmMYBZ．2矗pCAMBIA2301删6C．pCAMaXA230t-GmMYR／7pckPCRamplificationofthevectorofpMDl8·Tcontainingtargetgenes∞positivecontrolnCK．PCRamplificationofAgrob础tiumLBA4404越l峥tivecomrol9l 四川农业大学博士学位论文第五覃3．3转基因烟草的筛选和鉴定3．3．1转基因烟草的Gus检测选择已经生根的Kaa抗性苗，剪取其叶片，利用Gus染色，对阳性苗进行初步筛选。结果表明，检测pCAMBIA2301．GmMYBZ2转化的Kan抗性苗56株，Gus检测28株为阳性，阳性率50％；检测pCAMBIA2301．GmMYBJ6转化的Kan抗性苗79株，Gus检测3l株为阳性，阳性率39．2％；检测pCAMBIA2301-GmMYBJ7转化的Kan抗性苗58株，Gus检测28为阳性，阳性率48．2％，见图5．8。3．3．2转基因烟草的RT-PCR检测选取Gus检测的阳性株为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果表明，28株pCAMBIA2301一GmMYBZ2转化的Gus阳性苗中，26株检测为阳性，阳性率92．9％；31株pCAMBIA2301-GmMY3"6转化的Ous阳性苗中，29株检测为阳性，阳性率93．5％；28株pCAMBIA2301一GmMYBZ2转化的Gus阳性苗中，27株检测为阳性，阳性率96．4％，见圈5-8。3．4转基因烟草中类黄酮含量及其代谢相关酶的变化3．4．1转基因烟草中类黄酮代谢相关酶的表达分析以转化pCAMBIA2301空载体的转化烟草为对照，烟草Actin基因(ABl58612)为内标基因：半定量RT-PCR检测苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)、肉桂酸．4一羟化酶(c4哟、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CUD、黄酮醇合成酶(FLS)等基因的表达情况。检测结果表明，在pc舢曲IA230l《mM旧z2的转化烟草中，PAL、CAH、4CL、CHS及FLS的表达量下降；在pCAMBIA2301-GmMYBJ7的转化烟草中，PAL、CAH、4CL、CHS及F3H的表达量下降；在pCAMBIA2301·GmMYBJ6的转化烟草中，4CL、CHS、CHI、F3H及FLS的表达量增加(图5．9)。推测GmMYBZ2和GmMYBJ7可能对黄酮醇代谢途径和花青苷代谢途径具有抑制作用，从而导致受体植物中的黄酮含量降低；而GmMYBJ6则可能促进黄酮醇类的生物合成。3．4．2转基因烟草中总黄酮检测以芦丁作标准品测定不同浓度梯度在510nm处的吸收值，经数据统计建立标准吸 四川农业大学博士学位论文第五章收曲线和回归方程(表5．2)：以转化pCAMBtA2301空载体的转基因烟草为对照，分别对GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的烟草转化苗进行总黄酮检测。每个基因随机抽取3株，每株样品检测重复3次。结果显示，对照组总黄酮含量为O．0184mg／ml，GmMYBZ2和GmMYBJ7的转化烟草中，总黄酮含量分别为O．0122mg／ml和0．0132mg／ml，低于对照组含量；GmMYBJ6的转化烟草中，总黄酮含量为0．0267mg／ml，高于对照组(图5．11)。由此可以看出，GmMYBZ2和GmMYBJ7在烟草中的表达，对类黄酮的生物合成具有抑制作用，而GmMYBJ6在烟草中的表达，则可以促进类黄酮的生物合成，此结果与转基因烟草中类黄酮代谢相关酶表达分析的实验结果一致。3．5转基因烟草对非生物胁迫的耐受分析3．5．1转基因烟草的耐紫外辐射分析以pCAMBIA2301空质粒的烟草转化苗作对照，分别抽取3株GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的阳性转化苗，进行耐UV-B辐射分析，30min／d，连续处理5d后发现，GmMYBZ2和GmMYBJ7两个基因的烟草转化苗及pCAMBIA2301空质粒的烟草转化苗均开始萎嫣，且叶片颜色变暗，而GmMYBJ6的烟草转化苗则对紫外辐射则表现出一定的抗性(图5-12)。3．5．2转基因烟草的耐盐性分析以pCAMaIA2301空质粒的烟草转化苗作对照，分别抽取3株GmMYBZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的阳性转化苗，将其转入含有300mmol／LNaCl的MS培养基中，连续处理3d后，GmMYBZ2基因转化苗的叶片开始皱缩、且部分变黄：5d后，GmMYBJ7、pCAMBIA2301转化苗的叶片相继出现皱缩、变黄等现象，GmMYBJ6基因的转化苗叶片也出现了明显的皱缩，但稍好于对照(图5-13)。3．5．3转基因烟草的耐旱性分析以pCAMBIA2301空质粒的烟草转化苗作对照，分别抽取3株GmMYBZ2、C_rmMYBJ6和GmMYBJ7三个基因的阳性转化苗，将其转入含有10％PEG的MS培养基中，连续处理36h后，GmMYBZ2、G锄^f强矽和pCAMBIA2301的烟草转化苗的叶片相继出现叶缘卷曲、叶片下垂等现象，而GmMYBJ6的转化苗生长较好，表现出一定的耐旱性(图5-13)。 圈5．7烟草转化苗在选择培养基上生长的情况A．pCAMBLA2301(阴性对照)B．GmMTBZ2C．G，酷拧A坩D．GJ柚删7矾g．5．7Transgcnictobacco掣owing∞鲥ectionMsmedia^pcAMBIA2301∞anaiveconuolB．GmMTBZ2C—GmMY剐6D-GmMFBJ7图5毒转基因烟草的Gus检测结果A．pcAMBIA2301(阴性对照)B．GmMFBZ2CGmMY酗6D．GmMFS]6Fig．SSG吣棚lysisof岫sg面ctobaccoApcAMBIA230[ma∞gativeeomrolBG№脚z2CCnn删6DCnnMNK，7留5．9转基因烟草的RT-PCR检测丸GmMYBZ2B．o|zIlfm府C．CrmMF酗6ckpCAMBIA2301(阴性对照)n备S-9RT·PCRmal”isofthetransgcmct。bacco丸GJ栅z2B．CnnMY础6C．Grr,MYⅣ7双灿rtBIA230tnegativecontrol 四川农业大学博士学位论文第五章圈5-10GmMYBZ2，C-mMYBJ6及GmMYBJ7在烟草中的表达对类黄酮代谢相关基因在转录水平的影响丸GmMYBZ2B．GmM}'BJ6CGmMYBJ7PAL，苯丙氨酸氨基裂解酶；CAH．肉桂酸4羟化酶；412L'4．香豆酰CoA连接酶：CHS，查尔酮合成酶Cm，查尔酮异构酶：F3H，黄烷酮-3．羟化酶；FLS，黄酮醇合成酶Fig．5-10EffectoftheexpressionofGmMI'BZ2,GmMYBJ6andGmMYIU7∞traasaiptio血expressionofmkeygenesintheflavonoidmetabolismpathway访trmsgcnictobacco屯G柚秆Bz2R囟n删巧CGJ，lil删队L'Phenylalmtineammonialyase；CAH，cinaamate-4-hydroxyla∞；4(2L’4-comnm'oyl-CoAligase；CHS，alal∞∞Synthase；CHI,clmlcon*isou；F3Htlavmlone3-hy出oxylase；FLS，flavonolsynthase；表5—2标准溶液在510hm处的吸光度Thble5·2TheAbsorban∞ofthestandardsolutionatthewavelengthof510nm根据上表得线性回归方程：#．--13．621C--0．0315，I--O．9993o．03o．0250．020．0150．010．005O：。’i。i2。I．10111312ABCD图5-11转基因烟草的总黄酮检测A．pCAMBIA2301(对照)B．CrmMYBZ2CGmMYB．16魂．5．-11Thetotalflavonoidsassayoftramgenictobacco丸pCAMBIA2301∞aoDntrolB．GmMYBZ2CGmMYBJ695■扣暖枉瓤 4．讨论图5-12转基因烟草的耐紫外辐射分析▲pCAMBIA2301RG删BZ2CGa幽ffBJ7D．GaddFKl6E昏5．12A|la】口sjsoftramgmictobaa：ounderUV-BradiationA．pCAMBIA2301(cmU-01)B．GmMTBZ2cGmMYBJ7D·GmMYK／6圈5-13转基因烟草的耐盐性分析A．pCAMBIA2301nOmMYBZ2CGnddYRl7D．GmAHBJ6Fig．5-13AnalysisofIrmmgcnictobaccoⅡe砒eddy300mMNaCIA．pCAMBIA2301(contr01)kGmMYBZ2CGmMYBJ7D．GmbffKl6圈5-14转基因烟草的耐旱性分析A．pCAMBIA2301＆GmMI'BZ2C．GmMYRl7D·GmMYRl6矾g．5-14AnalysisoftrⅢgemctobaccotremeddy10％PEGA．pCAMBIA2301(contr01)B．CanM珊Z2CoIljl聊D．CnniO砌64．1MYB转录因子参与植物类黄酮代谢的调控研究表明，MYB类转录因子广泛参与植物中黄酮类物质生物合成的调节‘150，151l。在玉米籽粒中，MYB转录因子C1与HLH蛋白R协同作用共同调节着花青素生物合 四川农业大学博士学位论文第五苹成。Grotewold等【152】将转录因子Cl和R在离体培养的未分化的玉米细胞中超表达，成功地诱导了花青苷的生物合成和积累【叫。而玉米转录因子cl、R及查尔酮合成酶基因在水稻中的协同超表达也同样激活了花青素生物合成途径，并增强了对真菌的抗性【螂】。Borevitz等应用T-DNA激活标签技术在拟南芥中鉴定出一种MYB类转录因子(productionofanthocyaninpigment1-Dominant，PAPI-D)，它的超表达能激活许多参与花青素生物合成途径的基因表达，使植物体中紫色素的含量明显增加【104]。基因敲除和功能互补实验表明，拟南芥中的IT2是原花青苷合成途径中的关键调控因子【losl。牵牛中的ANTl与TT2具有非常高的一致性，同时，也具有与r12相似的功鲥1061。然而，不同的转录因子往往只调控类黄酮代谢途径中的某条支路。玉米中的MYB基因CI和川只调控CHS之后的花青苷合成途径，而对PAL等上游途径中的基因没有调控作用‘153小5】；而基因，则可调控3．脱氧类黄酮代谢途径【156】；转基因番茄中PAPI-D的过量表达可以使，■三、CHS,D职及GST(glutathioneS-transferase)等基因的表达量增加f157】；拟南芥中MYB转录因子rr2与HLH蛋白TT8协同作用可调控浓缩单宁合成途径中的二氢黄酮醇还原酶①}Ⅱ妁、无色花青素还原酶(1eucoanthocyanidinreductase，LAP,)等基因的表达[105·15叼。AtMYB4蛋白则能够抑制芥子酸酯合成途径中的肉桂酸-4．羟化酶C4H、4香豆酰辅酶A连接酶4CL及查尔酮合成酶CHS等基因的表达，从而降低芥子酸酯的合成‘”q。总黄酮检测结果显示，GmMYBZ2和GmMYBd7的烟草转化苗中，总黄酮含量低于转空载体的烟草转化苗，而GmMYBJ6的烟草转化茁中，与对照相比，总黄酮含量升高，说明GmMYBZ2和GmMYBJ7对类黄酮合成具有一定的抑制作用，而GmMYBJ6则可促进类黄酮的生物合成，此结果与半定量RT-PCR{佥iI[g结果一致。拟南芥的AtMYB4和红草莓的FaMYBI对类黄酮的代谢均具有抑制作用【108一091，研究发现，在其氨基酸序列的c．端都存在一个pdLNLD／ELXiG／S氨基酸基序和一个锌指结构域，而GmMYBZ2的c．端也存在一个相同的氨基酸基序和一个锌指结构域，具有较高的同源性，并同属MYB转录因子家族的第4亚群；总黄酮含量检测结果揭示，GmMYBZ2与AtMYB4和FaMYBl具有相似的功能。然而，GmMYBJ7对类黄酮的合成也同样具有抑制作用，但在其氨基酸序列中并不具有上述基序，此结果进一步证实了MYB转录因子家族结构与功能的多样性和复杂性，其对类黄酮代谢的调控机理以及其它生物学功能有待深入研究。 四川农业大学博士学位论文第五章4．2MYB转录因子参与植物的胁迫应答植物次生代谢物是植物在长期进化中对生态环境适应的结果。许多植物在受到生物或非生物胁迫时，会产生并积累大量小分子的次生代谢物，用以增强自身的抵抗力。类黄酮是植物体中一类重要的次生代谢物，种类繁多、分布广泛，具有多种生物学功能。黄酮类次生代谢物不仅在植物基础生理代谢中发挥着极为重要的作用，而且还具有保护植物体免受紫外辐射伤害、抵御微生物病虫害等功能嘲1。研究结果表明，GmMYBJ6：庄_烟草中的表达，增强了烟草对紫外辐射的抵御能力，推测转基因烟草中总黄酮含量的增加，可能是其紫外辐射抗性增强的原因之一。前人的研究显示，IvlYB转录因子还可参与植物渗透胁迫应答基因的表达调控。在干旱、脱水等胁迫条件下，ABA可诱导拟南芥的rd22和AtADHl基因的表达，序列分析表明，在rd22和AtADHl基因的启动子区分别存在着MYB和MYC转录因子的识别位点；进一步的研究显示，AtMYB2和(或MtMYC2在转基因植物中的过量表达，可以使rd22和AtADHl对ABA的敏感性增强，而rd22和AtADHI的表达量增加最终可使转基因植物对渗透胁迫的抗性增加【130l。此外，AtMYB2还可以结合启动子的GT-基序，从而调控在缺氧条件TAtADHl的表达【13”。Kranz利用反i匈Northem证明，在苗期受光诱导表达的AtMYBl02t1媚，也可应答植物的脱水胁迫删，进一步的研究表明，高盐、渗透胁迫及机械损伤均可使4tMYBl02的表达升高【侧。半定量RT-PCR检测表明，经高盐和干旱处理后，大豆中的Gm肘阳厮表达量增加；而GmMY&16在烟草中的表达，也使转基因烟草表现出了对高盐和干旱(PEG)抗性。然而，对高盐、干旱等渗透胁迫的应答是否也依赖于ABA诱导途径，有待进一步研究。4．3姗转录因子参与植物器官的形态建成研究结果显示，与pCAMmA2301的转化烟草相比，GmMYKl6、GmMYBdTglGmMYBZ2=_．个基因的烟草转化株，其叶片、花冠等器官都发生了较为明显的变化，因此推测，这三个转录因子对植物叶片、花冠等器官的形态建成可能具有一定的影响。前人的研究也证实，植物中许多lvlYB转录因子不仅参与植物的生理代谢，同时对植物器官的发育及形态建成也具有一定的调控作用。2001年，Shin利用ddRT-PCR的方法，从拟南芥中分离克隆出MYB转录因子基因AtMYB21t蛔，研究证明，该基因与AmMYB305andAmMYB340，同属第19亚群，而且主要在花器官中表达【1，‰⋯．而 四川农业大学博士学位论文第五苹AtMYB21在受体植物中的过量表达，可使幼苗致死，少量存活的转化株也较为矮小，而且呈现出叶片狭长、花瓣变窄、心皮畸形等表型变化：进一步的研究表明，AtMYB21过量表达最终导致受体植物的完全不育。Sabine等利用转座子标签插入失活证实，拟南芥的AtMYB26属于植物MYB转录因子基因家族中的第22亚群，研究表明，此基因只在花序中特异性表达；进一步研究显示，当AtMYB26基因被转座予插入失活后，可使花药内层细胞的细胞壁发育失常而不能正常开裂，从而导致雄性不育嗍。Schmitz等利用图位克隆的方法，从番茄中克隆出了编码R2R3MYB蛋白的Blind基因嗍，研究证明，Blind-与GRAS家族的Lstm．1嘲和亮氨酸拉链家族的RE∥”，1删两个转录因子基因均具有调控植物侧生分生组织发育和分化的功能，然而，对研、厶及皿嘞能缺失的研究表明，这三个转录因子基因所调控的代谢途径各不相同。由此看来，植物体中诸多的转录因子及调控蛋白各自调控着整个代谢网络的不同的途径和支路，它们之间相互作用、相互制约、相互协调，共同完成对植物生长、发育及生理代谢的调节。 四川农业大学博士学位论文结论与创新点1．论文工作取得的确定结果1)本研究利用RT-PCR及RACE-PCR的方法从大豆品种中豆27、吉林3号中分离得到了4个新的MYB转录因子基因GmMYBZl、G埘肘17BZ2、GmMYBJ6和GmMYBJ7。序列分析和结构预测表明，这4个基因均为典型的R2RJMYB转录因子基因，并分属于MYB家族的第4、6和14亚群。2)GmMYBZl开放阅读框528bp，编码175个氨基酸，具有2个MYB结构域，为R2R3MYB转录因子基因，但其转录激活活性极弱；实验结果显示，只在茎和叶中检测到了GmMYBZl的表达，而GmMYBZI对高盐、干旱等非生物胁迫没有明显的应答；推测CmaMYBZl与同亚组的rr2、PAPI、Pit．、C1及牵牛的An2相似，可能需要bHLH蛋白或其它蛋白因子的存在才能发挥其功能。3)GmMYBZ2开放阅读框744bp，编码247个氨基酸，具有2个MYB结构域，并定位于细胞核中，转录激活活性明显；GmMYBZ2在根、茎、叶及未成熟种子中均有表达，为组成型表达的基因；GmMYBZ2的表达可抑制类黄酮代谢途径中的PAL、C4H,4CL、CHS、FLS等基因的表达，从而使黄酮醇支路受到抑制，最终导致植物体中类黄酮的合成量下降；此结果与含有转录抑制基序pdLNLD／ELXiG／S的FaMYBl、AtMYB4等MYB蛋白的报道一致。此外，GmMYBZ2的表达可使受体植物对紫外、高盐、干旱等胁迫的耐受能力明显下降。4)GmMYBJ7开放阅读框702bp，编码233个氨基酸，具有2个MYB结构域，定位于细胞核，转录激活活性较高；实验结果显示，只在茎和叶中检测到了GmMYBJ7的表达，而GmMYBJ7的表达可抑制类黄酮代谢途径中的PAL、C4H,4CL、CHS、F3H,FLS等基因的表达，从而使黄酮醇代谢支路及花青苷代谢支路均受到抑制，最终导致植物体中类黄酮的合成量下降；但它并不具有CanMYBZ2所具有的pdLNLD／ELXiG／S转录抑制基序，因此，其作用机制可能不同于GmMYBZ2。此外，GmMYBJ7的表达可使受体植物对紫外、高盐、干旱等胁迫的耐受能力明显下降。l∞ 四川农业大学博士学位论文结论与创新点5)GmMYBJ6开放阅读框786bp，编码261个氨基酸，具有2个MYB结构域，定位于细胞核中，转录激活活性较高：GmMYBJ6只在叶片中特异性表达，它的表达对类黄酮代谢途径上游的PAL和C4H的表达没有明显的影响，但是，却明显增强了4CL及其代谢下游基因CHS、CHI、乃王LFLS的表达，从而导致受体植物总黄酮含量的增加，因此推断，GmMYBJ6的表达促进了黄酮醇及花青苷等代谢途径的生物合成。此外，GmMYBJ6的表达在一定程度上提高了受体植物对紫外辐射和干旱的耐受能力。这很可能与植物体中类黄酮含量的增加有关。2．本研究的创新点1)利用同源克隆的方法从大豆栽培品种中豆27和吉林3号中，成功克隆出4个新的R2R3MYB转录因子基因，对其转录激活功能、亚细胞定位、组织特异性表达及胁迫应答等生物学特性进行了研究，并提交GenBank注册。研究结果进一步证明，同源克隆是一种行之有效的、简便、快捷、经济的分离克隆MYB转录因子基因的方法。2)MYB转录因子广泛参与植物类黄酮的代谢调控，近年来，大量的MYB基因被相继分离克隆出来，但对其在类黄酮代谢中的调控作用的研究则相对滞后。我们通过烟草转化，对GmMYBZ2、GmMYBJ6及GmMYBJ7三个基因在受体植物类黄酮代谢调控中的作用进行了研究和探讨，为类黄酮代谢网络的进一步研究和解析提供了一定的理论依据。3)前人的研究表明，MYB转录因子广泛参与各种环境因子的应答。我们分别对GmMYBZ2、GmMYBJ6及GmMYBJ7三个基因在紫外辐射、高盐及干旱等非生物胁迫下的应答进行了初步的探讨，为进一步研究NIYB转录因子对植物胁迫耐受的影响提供了一定的理论基础。10l 四川农业大学博士学位论文参考文献●I|皇曼量■皇曼量量皇量曼曼曼量舅鼻量曼曼皇皇堂曼笪皇曼曼曼曼曼墨墨舅皇皇曼量|量曼量置奠■曼量置——E_●——量曼量蔓邕皇量曼曼曼曼拿曼皇鲁一参考文献【l】1LatchmanDS．Transcriptionfactor：anoverview,ht．J．Biochem,CellBiol，1997，29(12)：1305—1312【2】SchwechheimerC，BevanM．TheregulationofWamcdptionfactoractivityinplant．TrendinPlantScience，1998，3(10)：278-283．【3】3Riechman几，HeardJ，MartinG，eta1．ArabidopsfsTranscriptionFactors：GenomeWideComparativeAnalysisEukaryotes，Science，2000，290：2105-2110【4】Sainz,M，BGoif,S．A．andChandlerV．L．Extensivemutagenesisofatranscriptionalactivationdomainidentifiessinglehydophobicandacidicaminoacidsimportantforactivationinvivo，M01．CellBiol，1997，17：115—122【5】JohnsonPF,StemeckE，WilliamsSC：ActivationdomainsoftranscriptionalregulatorypI讲eins．JNutrBiochem，1993，4：386-398【6】AttardiLD，TjianR：Drosophilatissue—specifictranscriptionfactorNTF一1containsanovelisoleueine-richactivationmotif．GenesDev,1993，7：1341—1353．【7】EstruchJJ，CrosslandL，GolfSA：Plantactivatingsequences：positivelychargedpeptidesalefunctionalastranscriptionalactivationdomains．NucleicAcidsRes，1994，22：3983-3989【8】Dcheshl('SmithLQTERppermanJM,eta1．TwinautonomousbipartitenuclearloclizationsignalsdirectnuclealimportofGT-2，PlantJ，1995，8：25-36【9】VaragonaMJ，SchmidtRJ，RalkhelNV．Nuclearlocationsignal(s)requiredfornucleartargetingofthemaizeregulatoryProteinOpaque-2．PlantCell，1992，4：1213—1227【10】SakumaYLiu0，DubouzetJQeta1．DNA-bindingspecificityoftheERF／AP2domsinofAeabidopsisDREBs，transcriptionfactorsinvolvedindehydration-andcold-induciblegeneexpression．BiochemBiophysRosCommun,2002，290：998-1009【11】NakanoT，SuzukiK，FujimuraT．andShinshiT．Ganome—wideanalysisoftheERFgenefamilyinArabidopsisandfice．PlantPhysiology,2006．140：4ll—432【12】Ohme。Takagl，M，andShinshiH，Ethylene—inducibleDNAbindingproteinsthatin．metwithanethylene-responsiveelement,PlantCell，1995，7：173—182【13】ChakravarthyS，TuoriRP,D’AscenzoMD。eta1．ThetomatotranscriptionfactorPti4102 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四川农业大学博士学位论文致谢本论文从选题、实验设计、课题实施到论文撰写都是在四川农业大学杨婉身教授、中国农业科学院生物技术研究所唐益雄研究员和吴燕民研究员精心指导下完成的。三年来，杨老师在我韵学习、工作和生活上给予了无微不至的指导和关怀，导师的教诲和帮助，学生将永远铭记在心!邵继荣老师在学习和工作等方面也给予了极大的关心和帮助，并与杨老师一起为我提供了在中国农业科学院学习提高的机会。本论文的全部实验都是在中国农业科学院生物技术研究所完成的，唐益雄研究员、吴燕民研究员对实验给予了直接、全面的指导。唐益雄研究员渊博的学识、缜密的科研思维、正直热-『青的为人以及广博的胸襟，是我终生学习的楷模：吴燕民研究员对科研认真敬业的工作作风、敏锐的学术思想及卓越的领导能力给我留下了深刻的印象。在此对他们的辛勤工作和无私奉献致以最诚挚的谢意，并真诚地祝愿老师们：健康快乐、吉祥如意!中国农业科学院生物技术研究所的裴新梧研究员、尤驰大姐；中国农业科院作物科学研究所博士后郭函子老师、马丽青老师和李爱丽老师给予了极大的帮助和启迪，在此表示衷心的感谢!感谢中国农业科院作物与种质资源研究所的老师们及北京国家大豆改良分中心孙君明博士为实验提供了大豆实验材料!感谢中国农业科院作物科学研究所博士生王翔、肖朝文，硕士生赵峰、王宏规、张进等同学；中国农业科院作物品质研究所博士生张中保、贾小平，硕士生毛毅辉等同学；中国农业科院作物改良中心博士生王金明同学；中国农业科学院生物技术研究所田健同学、i01实验室、318实验室、509实验室全体同学在实验和生活上给予的大力帮助与支持!衷心感谢中国农业科学院生物技术研究所211实验室的全体老师、师弟、师妹们共同营造了一个团结和谐、积极向上的科研氛围，在生活、学习和工作上给予了极大的帮助和关照，感谢他们陪伴我度过了近两年的难忘时光!在此衷心的祝福他们：事业一帆风顺，生活永远幸福如意I感谢所有关心、帮助和支持我的朋友们i最后，深深地感谢一直关心、理解和支持我的父母和亲人们1117杨文杰于中国农业科学院2007-4-28 四川农业大学博士学位论文攻读学位期间发表文章1．《表达7个高分子量谷蛋白业基的小麦新种质的创制、鉴定及分子细胞学分析》，遗传学报，2005，32(11)：1184．11902．《大豆两个^f功转录因子基因的克隆与表达分析》中国农业科学(已接收)3．《(IdentificationofGmMYBJ6encodingaR2R3MYBtranscriptionfactorthatexpressesspecificallyinsoybeanleavesandregulatestheflavonoidsmetabolism))(BeingsubmittedtoPlantPhysiolBiochem)4．{CloningandcharacterizationofaUV·BinducibleMYBgenefromGlycinemax))(BeingsubmittedtoPlanta)5．{MolecularcloningoftwocDNAsencodingnovelMybhomologuesfromsoybean))(Inpreparation)118 大豆MYB转录因子基因的克隆及其表达研究作者：杨文杰学位授予单位：四川农业大学本文读者也读过(2条)1.李娟水稻和拟南芥MADS和MYB转录因子密码子用法及系统进化分析[学位论文]20052.王希庆.陈柏君.印莉萍植物中的MYB转录因子[期刊论文]-生物技术通报2003(2)本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1191516.aspx
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