检测禽网状内皮组织增生症病毒的间接免疫荧光试验建立及应用

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1、检测禽网状内皮组织增生症病毒的间接免疫荧光试验建立及应用EstablishmentofanIndirectImmunofluorescenceAssayforDetectionofAvianReticuloendotheliosisVirus研究生：李莉莉学科：预防兽医学导师：吴艳涛教授扬州大学兽医学院2014年6月李莉莉：检测禽网状内皮组织增生症病毒的问接免疫荧光试验建立及应用三检测禽网状内皮组织增生症病毒的间接免疫荧光试验建立及应用研究生：李莉莉导师：吴艳涛教授摘要禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendot

2、lleliosisvirus，REV)感染可引起禽类的肿瘤、生长障碍和免疫抑制，导致禽类生产性能的降低以及疫苗免疫的失败，对养殖业的危害巨大。I也V既可以水平传播，又能垂直传播，还能污染弱毒疫苗造成大范围的扩散。因此，有必要建立检测弱毒疫苗和临床样品中IIV的方法。本研究采用PCR方法扩增编码REV群特异性抗原p30的基因，分别克隆到大肠杆菌表达载体pGEX．6P．1和pET-32a(+)。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导分别获得49kD和43．4kD的重组蛋白GST．p30与His．p30，经高亲和力

3、的GST树脂和NI．NTA树脂纯化，以纯化的重组蛋白GST．p30免疫BALB／c小鼠制备脾细胞，与SP2／0骨髓瘤细胞融合；以纯化的重组蛋白His．p30作为ELISA检测抗原筛选阳性克隆，经3．4次亚克隆，共获得8株可稳定分泌针对p30抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A10、2G1、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2。经鉴定这8株单抗的ELISA效价可达1：6，400～1：204，800；单抗4D9和4G2的亚类为IgG3，其余6株单抗的亚类均为IgGl；Western．blotting结

4、果显示单抗2G1、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2可与重组蛋白His．p30特异性反应；而单抗1AIO、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2则可与感染REV的DFl细胞产生特异性荧光。选取特异性和灵敏度都较高的单抗4D9进行纯化，并以此建立了检测REV的间接免疫荧光(IFA)试验。通过对IFA反应条件的优化，该IFA方法可有效检测出DFl细胞中感染的REV,与禽白血病病毒和马立克氏病病毒则不产生交叉反应；对REV的最小检出量为1TCID50，即lTCID50的REV感染DFl细胞4天后

5、即可检出；而12．5TCIDso的REV感染DFl细胞24h后即可检出；与PCR方法检测结果的符合率可达100％。利用所建立的IFA方法对2011-2014年间江苏、山东、安徽、河北和北京等地送检的弱毒疫苗和临床样品进行检测。从120份弱毒疫苗样品中检出1株REV，而从300份临床扬州大学硕士学位论文样品中检到2株REV。对分离的3株REV进行gp90基因遗传进化分析，发现均为I型的毒株，与标准株REV．A、REV．T以及HA9901的亲缘关系都很近，均在同一分支内。关键词：禽网状内皮组织增生症病毒；单克隆抗体；间接免疫

6、荧光试验李莉莉：检测禽网状内皮组织增生症病毒的间接免疫荧光试验建立及应用三EstablishmentofanIndirectImmunofluorescenceAssayforDetectionofAvianReticuloendotheliosisVirusM。S．Candidate：LiliLiAdvisors：‰】细ol他AbstractReticuloendotheliosis(RE)isasetofpathologicalsyndromecharacterizedbythehyperplasiaofreticu

7、larcellsinchickens，turkeys，ducks，geeseandotherpoultries，whichiscausedbyREV．Itisagreatdamagetothepoultryindustrybecauseitcannotonlyleadtopoorweightgainandfeedefficiencybutalsoresultinreducedeggproductionandeggquality．ItCanalsoleadtotumorsofpoultries．REVcanspreadby

8、verticalandhorizontaltransmission．ItCancauseawiderangeofdiffusionbyvaccinecontamination．TheinfectionofREViscommoninChina．Itisnecessarytoestablishamethodtoaccur