铜绿假单胞菌代谢产物抗肿瘤活性研究

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1、硕士学位论文铜绿假单胞菌代谢产物抗肿瘤活性研究作者：吴燕杰指导教师：杨树林教授南京理工大学2014年3月M．D．DissertationStudiesonantitumoractivitiesofmetabolitesproducedbyPseudomonasaeruginosaWuYanyieSupervisedbyPr嘶№ngShu／／nNanjingUniversityofScience&TechnologyMarch，2014声明本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布过的研究

2、成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明确的说明。学位论文使用授权声明南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。研究生签名：墨堡垒协J争年3月涉日硕士论文铜绿假单胞菌代谢产物抗肿瘤活性研究摘要铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种常见的革兰氏阴性菌，其次级代谢产物在环境、工业、医药等行业有良好

3、的应用前景。如鼠李糖脂作为一种用途广泛的生物表面活性剂，兼具加快伤口愈合、防治藻类、抑制微生物生长等生物活性；绿脓菌素是一种小分子吩嗪类蓝色色素，具有较强的氧化还原活性，可扩散并渗透进入细胞膜，过量产生氧自由基导致细胞死亡。本研究对模拟空间环境条件诱变得到的高产鼠李糖脂突变菌株PaeruginosaM14808进行发酵，分离、纯化其次级代谢产物并表征鼠李糖脂的化学结构，研究鼠李糖脂及绿脓菌素的抗肿瘤活性，并探讨其作用机制。主要研究结果如下：1．结构表征结果表明，从发酵液中分离、纯化得到的鼠李糖脂主要为双鼠李糖脂Rh2CloClo。该物质对人乳腺癌细胞MCF．7增殖的抑

4、制作用明显，可增强衰老相关B．半乳糖苷酶活性。AO／EB染色、DNAladder、caspase．3活性及p53、bax、bcl．2、casepase．3、caspase一9、Fas基因表达水平的检测结果表明，双鼠李糖脂促使MCF．7细胞坏死。2．对种子液进行分离、纯化，得到绿脓菌素。绿脓菌素能够抑制人非小细胞肺癌细胞A549及人肝癌细胞HepG2的生长，且呈剂量依赖关系。AO／EB染色、DNAladder及单细胞凝胶电泳检测提示绿脓菌素可诱导肿瘤细胞发生凋亡。进一步研究表明绿脓菌素能诱导A549和HepG2细胞内ROS水平升高，caspase．3活性增强，抗氧化物质

5、含量随之改变。HepG2细胞内p53、caspase．9、bax及PIG3mRNA表达水平显著升高，bcl．2／bax比值降低。抗氧化剂N．乙酰基．L．半胱氨酸(NAC)预处理后，A549和HepG2细胞的生存能力显著增强，氧化应激相关指标及各基因表达水平均有所改善。实验结果表明：绿脓菌素诱导A549和HepG2细胞产生氧化应激，并进而引起HepG2细胞内p53基因和线粒体途径介导的细胞凋亡。关键词：铜绿假单胞菌，双鼠李糖脂，-绿NNN，抗肿瘤活性，氧化应激，细胞凋亡AbstractPsP“domonasaeruginosaisacommongram-negative

6、bacterium·ThisbacteriumcanproducesecondarymetaboliteswhichshowgoodapplicationfutureInenvironment，medlclnea11dindustⅣ．Asakindofbiosurfactantwithextensiveuse，rhamnolipidstillshowobviousbi0109icalactivities，suchasspeedingwoundheaiing，inhibitingalgagrowth，antibactenalactivity,andSOon．Pyocya

7、ninisabluephenazinepigment嘶t11strongredoxactivity．PyocyanincaIleasilypenetratemembranes，produceexcessfreeradicalandresultmcelldeath．Inthisdissertation，thehighrhamnolipidproducingstrainPseudomonasae厂u97玎os口M14808mutatedbysimulatedspaceconditionwasusedforfermentation·Secondarymet