鲤鱼汤对阿霉素肾病大鼠肾组织tgf-β1smad7信号通路表达的影响

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鲤鱼汤对阿霉素肾病大鼠肾组织TGF-131／Smad7信号通路表达的影响摘要目的：观察鲤鱼汤对阿霉素肾病(adriamycin--inducednephropathy，ArN)模型鼠肾组织转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)TGF一131／Smad7(similarmothersagainstdecapentaplegichomolog7)信号通路的干预作用，探讨其拮抗肾纤维化的分子机制。方法：雄性Wistar大鼠50只，随机分为空白对照组(KB组)、肾病模型组(SB组)、鲤鱼高剂量组(LG组)、鲤鱼低剂量组(LD组)、厄贝沙坦组(EB组)，每组10只。阿霉素6．2mg．k91尾静脉单次注射制备阿霉素肾病模型。2周后每日经口灌胃9mL．kg-1给予大鼠干预制剂：LG组：鲤鱼汤45g．kg～；LD组：鲤鱼汤22．5g．kg～；EB组：厄贝沙坦50mg．kg-1；KB组及SB组予以同等剂量的饮用水干预。常规检测体重、12h尿量(urinevolume，Uv)及尿蛋白排泄量(12h—urineproteinexcretion12h—Upro)(1次／周)。第9周末杀取终末标本，检测血生化指标；肾组织于光镜、电镜下观察病理变化；免疫组化方法检测肾组织转化生长因子131(TGF．131)、Smad7、成纤维细胞特异性蛋白．1(fibroblast—specificprotein1，FSP一1)、I型胶原(collagenI，Col-I)的表达。结果：与KB组相比，SB组大鼠12h-Upro、血尿素氮(blooldUreanitrogen，BUN)、血肌酐(serumcreatinine，Scr)、肾组织TGF。13l、FSPl、C01．I、肾小球硬化指数(glomerulosclerosisindex，GSI)及间质损伤指数(Tubulointerstitiuminjuryindex，TII)均显著升高(P<0．05)，血清总蛋白(totalprotein，TP)、白蛋白(serumalbumin，Alb)及肾组织Smad7显著降低(P<0．05)；与SB组相比，LG组大鼠尿蛋白浓度(12hurineproteinconcentration，12h-Upc)、Scr、肾组织TGF一131、FSPI、Col—I、GSI及TII均显著降低(P<0．05)，BUN降低但差异未达统计学意义；12hUv、血清TP、Alb及肾组织Smad7均显著升高(P<0．05)。上述指标，LG组、LD组、 EB组之间差异未达统计学意义。结论：鲤鱼汤升高血Alb，增加尿量消除水肿；通过上调肾组织Smad7的表达，负性调节TGF一131／Smad信号通路，抑制上皮细胞转分化(EpithelialtomesenchymaltransitionEMT)及细胞外基质沉积(extracellularmatrix，ECM)，减轻肾间质纤维化，保护肾脏。硕士研究生：宁华英指导教师：刘剑英教授沈卫教授关键词：鲤鱼汤(CCD)；阿霉素肾病(AIN)；TGF一13l／Smad信号通路；细胞外基质沉积(ECM)；上皮细胞间充质转分化(EMT) Ⅱ叮FLUENCEoFC】J=i阿跚ⅣDSC么Rj!，DDECoCTIONoNTGF．131／SMLU)7SIGNALINGPATHⅥ(AYoFADRIAMYCINNEPHRoPATHYRATSAbstractobiective：ToinvestigatethepotentialmolecularmechanismsofCypriunsCarpioDecoction(CCD)forantagonizingrenalfibrosisbyobservingitsinterventioneffectontransforminggrowthfactor(TGF)-131／Smad7signalingpathwayinratswithadriamycin-inducednephropathy(AIN)Methods：Fi衄maleWistarratswererandomlydividedintofivegroupsconsistingof10ratseachgroupasfollowing：normalcontrolgroup(groupKB)，A1Ncontrolgroup(groupSB)，；thehighdoseofCCDtreatedgroup(groupLG45g．kg-i．d-1)；thelowdoseofCCDtreatedgroup(groupLD，22．5g．kg-1．d-1)；theErbesartantreatedgroup(groupEB，50mg．kg-1．d-1)．AINmodelwasinducedbyasingledoseof6．2mg．k91adriamycinthroughthetailveinoftherats(n==40)atday0．AfterADRinjection2weeks，animalswerevehicle-treatedwiththeabovedoserespectivelyoncedailyviagastrictube，whileratsingroupKBandgroupSBwereadministeredwithanequivalentvolumeofdistilledwaterinthesamewayfor7weeks．Ratbodyweight，12hurinevolume(12h-Uv)and12hurineproteinexcretion(12h·Upro)wereroutinemonitoredonceeachweek．Allratsweresacrificedattheendofthe9thweekaftermedication．Theserumwasisolatedtoexaminebloodbiochemicalindicesandthekidneyswereharvestedtoobservepathologicalchangesunderlightandelectronmicroscopes．ExpressionofSmad7，transforminggrowthfactor13I(TGF-131)，fibroblast-specificprotein1(FSP1)andcollagenI(Col—I)weredetectedbyimmunohistochemicalstaining．Result：ComparedwithgroupKB，ingroupSB，thelevelof12h—Upro，BUN，Scr，GSI，TII，theproteinexpressionofTGF一131，FSP1andCol—1weresignificantlyup-regulated(P<0．05)，whilethelevelofTP,AlbandSmad7expressionthatwere significantlydecreased(P<0．05)．ComparedwithgroupSB，ingroupLG，thelevelof12hurineproteinconcentration(12h—Upc)，Scr,GSI，TII，theproteinexpressionofTGF一131,FSP1andCol-1weredecreased(P<0．05)，thelevelofBUNweredecreasedbutnostatisticaldifferencebetweentwogroups。whilethelevelof12h一魄鹏AlbandSmad7expressionthatwereup·regulated(P<0．05)．TheaboveparameterswerenostatisticaldifferenceamonggroupLGLDandEB．Conclusion：CCDtreatmentcouldelevateserumalbumin，inducediuresistoreduceedema，inhibitepithelialtomesenchymaltransition(EMD，alleviatetheextracellularmatrix(ECM)deposition，attenuaterenalinterstitialfibrosisandprotectkidneybywayofup—regulatingSmad7secondarytonegativeregulatingTGF一131／Smadsignalingpathwayinthekidney．Postgraduatestudent：NingHua-yingDirectedbyProf．LiuJian-yingDirectedbyProf．ShenWeiKeywords：CypriunsCarpioDecoction(CCD)；adriamycin—inducednephropathy(AIN)；transforminggrowthfactor-pl／Smadsignalingpathway；extracellularmatrixOgCM)；Epithelialtomesenchy’maltransition(EMT) 英文缩略语表ADRAdriamycin阿霉素．AINadriamycin—inducednephropathy阿霉素肾病Albalbumin白蛋白AODaverageopticaldensity平均光密度值ARBangiotensin-IIreceptorblocker血管紧张素II受体拮抗剂BUNbloodureanitrogen尿素氮CCDcyprinuscarpiodecoction鲤鱼汤CKDchronickidneydisease慢性肾脏病Col—IcollagentypeII型胶原ScrseBlmcreatinine血清肌酐DABdiaminobenzidine二氨基联苯EMTepithelial-to-mesenchymaltransition上皮．间充质细胞转分化EndoMTendothelial-mesenchymal-transition内皮细胞间充质转分化ESRDendstagerenaldisease终末期肾病FSGSFocalsegmentalglomerulosclerosis局灶节段性肾小球硬化FSPlfibroblast—specificprotein1(FSPl／S100A4)成纤维细胞特异性蛋白1Gglobulin球蛋白GBMglomerularbasementmembrane肾小球基底膜Gluglucose血糖GSglomerulosclerosis肾小球硬化GSIglomerulosclerosisindex肾小球硬化指数H&Ehematoxylinandeosin苏木素一伊红染色IODintegralopticaldensity积分光密度LDLlowdensitylipoprotein低密度脂蛋白MCNSminimalchangenephriticsyndrome微小病变肾病MyoFmyofibroblast肌成纤维细胞NSnephriticsyndrome肾病综合症 PBSIⅡI心RTECSM匕如7phosphate-bufferedsalinerenalfibrosisrenalinterstitialfibrosisrenaltubularepithelialcellSmallmotheragainstdecapentaplegichomolog7TCtotalcholesterolTGtriglycerideTGF—p1transforminggrowthfactor-betalTIITubulointerstitiuminjuryindex，TPUproUpcUvtotalproteinurineproteinexcretionurineproteinconcentrationurinevolume磷酸盐缓冲液肾纤维化肾间质纤维化肾小管上皮细胞类抗果蝇蛋白同源分子7胆固醇甘油三酯转化生长因子一131小管间质损伤指数总蛋白尿蛋白排泄尿蛋白浓度尿量 目录引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第1章材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．1实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．2主要药品、试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·51．2．1动物分组及模型制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．2实验动物干预⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3检测指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．1标本采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．2一般情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．3尿量及尿蛋白排泄量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．4血清生化指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．5肾脏病理检查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．5．1肾小球硬化程度评估⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．5．2肾小管间质损伤程度评估⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．5．3免疫组化检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4统计学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7第2章结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．1一般情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．2大鼠AIN模型建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．3大鼠血清生化指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．4大鼠12h尿蛋白浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．5大鼠12h尿量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．6大鼠GSI及TII的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一122．7大鼠肾组织超微结构的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13 2．8大鼠肾组织TGF一131及下游因子的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第3章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．18结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一20综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．26参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．45攻读硕士期间研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一64学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一65 青岛大学硕士学位论文鲤鱼汤对阿霉素肾病大鼠肾组织TGF．131／Smad7信号通路表达的影响引言慢性肾病(chronickidneydiseaseCKD)已成为21世纪危害人类健康的主要公共卫生问题，尤其是在发展中国家[1,21。AusDiab研究显示口1，澳大利亚人口CKD的患病率为12．1％，与美国全国健康和营养调查Ⅲ期研究结果11％类似【4】。中国10．2％--11．3％的人罹患CKD[5一。2005年，俄罗斯CKD及其它慢性疾病造成的巨额经济负担大约占GDP的1％，到2015年这个数值将会超过5％【|71。发达国家对终末期肾病(endstagerenaldisease，ESRD)的治疗管理付出了沉重的经济代价。约0．1％的ESKD患者消耗了超过1％的卫生财政支出【81。然而，在发展中国家有限的卫生保健财政资源无法满足ESKD病人昂贵的治疗需求。在东南亚，肾移植的费用约超过年度人均收入400美元的10倍，且卫生保险覆盖率低，肾移植及CKD的治疗并未纳入其1辛19,10】。一方面糖尿病及高血压的快速激增促进了CKD及慢性心血管病的流行，另一方面由于终末期肾移植或透析的需要，CKD不仅严重影响全球人群健康而且极大地加剧经济负担。目前，CKD致死率已升跃至全球排名第十二位，其致残率为全球排名第十七【l¨。CKD被认为是21世纪医学界面临的严峻挑战。几乎所有慢性进展性肾病的共同路径和最终结局是肾纤维化(renalfibrosisRF)。RF是一个复杂的动态过程，包括肾小球硬化(glomerulosclerosisGS)和肾间质纤维化(renalinterstitialfibrosisRIF)，几乎涉及肾实质所有细胞类型【121。大量研究表明，转化生长因子13(TGF．13)是多功能效应细胞因子，TGF．B1／Smad7信号转导通路在小管问质炎症及纤维化的发生发展中起非常重要的作用[13-20】。TGF．B1过度表达诱导肾小管上皮细胞(renaltubularepithelialcell，RTEC)通过上皮．问充质细胞转分化(epithelialmesenchymaltransdifferentiationEMT)为肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)，促进细胞外基质(extracellularmatrixECM)沉积抑制ECM降解。EMT为肾纤维化的标志【2¨，其发生与慢性小管间质性炎症有密切联系，是上皮细胞适应微环境变化的一种应答方式m1。成纤维细胞特异性蛋白1(FSPl)属S100超家族小 青岛大学硕士学位论文分子钙结合蛋白，具有多种生理活性，被认为是EMT的标志，在MyoF阳性表达；MyoF在小管周围积聚标志着肾损伤及间质纤维化的启动和进展，是慢性肾衰发展的重要因素。除了上皮细胞，EMT也可发生在内皮细胞甚至足细胞即内皮细胞间充质转分化EndoMT(endothelial．mesenchymal．transition，EndoMT)，是肾纤维化的早期阶段，属于整个肾纤维化进程的一部分[23,24]。1wano等口51用基因标记技术证实了体内EMT的发生。目前公认FSPl出现是EMT早期非常重要的分子事件，是纤维化疾病活动进展的标志126]。最新研究显示，FSPl在局灶节段性肾小球硬化FSGS(Focalsegmentalglomerulosclerosis，FSGS)患者肾足细胞高表达，且FSPl表达的数量与GS程度及小管间质C01．I沉积面积有密切联系【271。继肾损伤后TGF．131通过Smads依赖或非依赖途径促纤维化导致产生大量C01．I，C01．I反过来再刺激FSPl产生，形成恶性循环，最后导致肾小管萎缩、肾单位丧失直至肾功能衰竭。体内外研究证实了TGF一131在EMT及RF中的作用。TGF．13中性抗体、核心蛋白多糖或反义寡核苷酸抑制TGF．131的表达可以阻止或减轻RF的进展【2引。Smad7(Smallmothersagasitdecapentaplegichomolog7)是TGF一13超家族的下游信号分子，为哺乳动物类抗果蝇蛋白同源分子，被认为是抑制型Smad原形成员，分子量46kDa，426个氨基酸组成【291。内源性Smad7活化可以负向调控TGF．131／Smads信号通路的生物学效应，既抑制TGF一131诱导的纤维化，又介导TGF一131和NF．KB、Wnt等信号路径之间的交叉，也可非依赖TGF．B1／Smads信号路径，发挥抗炎、抗纤维化、促凋亡等作用【3Ⅲ。因此，具有拮抗纤维化作用的干预制剂，其发挥作用的靶点某种程度上可能与TGF．131／Smad7信号转导路径有关。肾功能进行性衰竭、久治不愈进展至ESRD伴随着高昂的医疗费用，不仅给个人、家庭、社会带来沉重的经济负担，而且使患者面临高死亡率的危险。水肿、蛋白尿是CKD的临床特征和危险因素。许多CKD患者在经历了病程缠绵、久治不愈的疾病折磨后，进而将目标转向传统中医药，希冀从本土医学的浩瀚宝典中寻求生机。与此同时，疾病谱的转变，药源性疾病的增多，促使人们的健康观念更趋向传统和回归自然。特别是SARS之后，国际上对中医药的认可和重视，推动国人重新审视传统医学这绝无仅有的、尚未被充分开采的健康资源宝藏。因此以文献记载的方剂为切入点，筛选开发新药，具有投资少、风险小、周期短，易于为世人接受的2 青岛大学硕士学位论文特点。鲤鱼汤正是这百万锦方中的效方验方。鲤鱼汤作为治疗顽固性水肿证的“药食同源"经典验方，正式载于李时珍编篡《本草纲目》鳞部第四十四卷1611页【311。目前公认鲤鱼汤源于唐代孙思邈《千金药方》，以食疗方剂为文献记载应追溯至晋代葛洪《肘后备急方》。鲤鱼周身皆可入药，千百年来其功用主治远超出水肿范围；因疗效独特，堪舆药物相当甚至药物所不及，故为历代名医所擅用；又因其简便廉验、易于取材，因此在民间备受推崇‘32斟1，：但因作用机制不明，鲤鱼汤始终被排除在主流用药之外，处于辅助补充治疗的地位，以至于无法使更多患者受益。阿霉素肾病(adriamycin—inducednephropathy,AIN)动物模型是经典的肾小球硬化模型，被广泛用于研究CKD潜在的进展机制及治疗策略[35,36]。其临床特点是持续大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂高凝状态、水肿及腹水形成【37训】，类似于临床疾病症状。前期研究显示，鲤鱼汤能够降低AIN大鼠尿蛋白排泄，据此推测该作用可能是鲤鱼汤拮抗纤维化保护肾脏的一个方面。鉴于鲤鱼汤的临床疗效事实，本实验继续采用A玳模型从以下方面进一步探讨鲤鱼汤利水消肿拮抗纤维化保护肾脏的作用及分子机制：(1)检测肾损伤后尿量，尿蛋白浓度及BUN、Scr等血生化指标变化(2)评价肾小球硬化(GSI)及小管间质损伤程度(TII)，(3)检测肾组织纤维化相关因子Smad7、TGF．131、FSPl及ColI的表达情况。 青岛大学硕士学位论文1．1实验材料第1章材料与方法1．t．1实验动物健康雄性Wistar大鼠50只，SPF级，7周龄，体质量(220±20)g；购自山东鲁抗医药有限公司，许可证号：SLXK鲁20080002。恒温恒湿，12h光照循环，标准饮食，自由饮水，饲养于青岛大学实验动物中心。1．1．2主要药品、试剂(1)阿霉素(注射用盐酸多柔比星，ADR)购于浙江海正药业股份有限公司(10mg／支，批号：110402)。(2)厄贝沙坦片购于赛诺菲安万特杭州制药有限公司(150mg／片，批号：1A101)。(3)鲤鱼汤野生黄河鲤，购自青岛产芝水库，经山东省淡水水产研究所鉴定。去除鱼腮肠杂，剔除夹脊白筋。鱼水重量比1：4。武火煎煮至沸，后文火煎煮90min，期间搅拌助鱼肉分离。滤除鱼汤，二次煎煮前擂碎鱼渣，余同前。两次鱼汤混匀，低温超滤浓缩至250％(鲤鱼2．59／m1)和500％(鲤鱼59／m1)。聚乙烯食品级塑料袋分装密封，置一20。C冰箱备用，使用前1h水浴箱37℃加热。(4)免疫组化试剂TGF—B1(bs一0086R)、Col—I(bs一0578R)、FSPl(bs一3759R)、Smad7(bs一0566R)兔抗大鼠一抗(批号989885W，北京博奥森生物技术有限公司)；PBS缓冲液、即用型PV一9001--抗试剂盒((批号K123315B)及柠檬酸盐缓冲液(北京中杉生物技术有限公司)。(5)尿蛋白测定试剂盒，北京利德曼生化技术有限公司(6)血生化测定试剂，宁波瑞源生物科技有限公司1．1．3主要仪器冷冻离心机，Eppendorf5801型，德国；日立7170A型全自动生化分析仪，Olympus(日本)奥林帕斯AU640全自动生化分析仪，Olympus(日本)光学显微镜，日本奥林帕斯生产制造；4 青岛大学硕士学位论文透射电子显微镜，JEM一1210EX型，日本奥林帕斯生产TPl020型全自动封闭式组织脱水机(LEICA)BldJ—III型包埋机，常州中威电子仪器厂BMJ—III型病理组织包埋冷冻台，常州中威电子仪器厂石蜡切片机，型号2235，德国莱卡生产制造图像分析系统，ImageProPlus-6．0彩色图像分析软件微量移液器，0．1—2．59L，0．5．109LEppendof,德国；微量移液器，10—1001xLGilson，法国；微量移液器，50．200“L、200．1000I-tLDragon，芬兰；1．2实验方法1．2．1动物分组及模型制备雄性Wistar大鼠50只，适应性喂养1周，检测尿蛋白阴性后随机分为空白对照组(KB组lO只)，造模组40只。造模组参照文献【41】予以单次尾静脉注射阿霉素6．2mg／kg制备模型，KJ3组同步予以等量生理盐水[421。建模后2周12h尿蛋白定量大于50mg视为模型成功【431。以尿蛋白为区组因素将造模组随机分为：肾病模型(AIN)组(SB组)，鲤鱼汤高剂量组(LG组)，鲤鱼汤低剂量组(LD组)，厄贝沙坦组(EB组)，每组10只。1．2．2实验动物干预造模后2周对大鼠每日灌胃干预，连续7周。LG组给予鲤鱼汤(459／9ml／kg)，LD组予以鲤鱼汤(22．59／9ml&g)(按照大鼠与人体表面积折算系数0．018计算，分别相当于70kg正常成人剂量的1倍、0．5倍)。EB组给予厄贝沙坦水溶液50mg／9ml／kg，KB组与SB组同步予以等量饮用水。1．3检测指标1．3．1标本采集常规检测体重每周卜2次。造模前(0d)，造模后5d，7d，之后每周一次，将各组大鼠单只入代谢笼，禁食不禁水，采集首次晨尿及12h尿液，检测尿量(urinaryvolume，uv)、尿蛋白排泄量(urinaryproteinexcretion，Upro)。死亡大鼠解剖留取心、肝、脾、肺、肾标本。实验第9w末，采集尿标本后10％水合氯醛3fIlL／kg腹腔麻醉，心脏穿刺采血，37。C恒温水浴箱中静置30min后，3000rmbp，离4二,10min取上清液行血生化 青岛大学硕士学位论文检测。4"C预冷生理盐水肾脏灌洗后，取肾称重，切取部分置于4％多聚甲醛固定以制备石蜡切片，备光镜及免疫组化检查；部分按电镜标本处理；余置-80。C冰箱储存备检。1．3．2一般情况常规观察各组大鼠精神状态、摄食饮水、体毛光泽、活动及二便等情况；每周称量体重、计算饮食量。1．3．3尿量及尿蛋白排泄量对上述方法采集的尿标本测量尿量；采用双缩脲法检澳lJl2h尿蛋白浓度。1．3．4血清生化指标全自动生化分析仪检测大鼠血清总蛋白(totalprotein，TP)、白蛋白(albumin，Alb)、血清肌酐(serumcreatinine，Scr)、尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)、三酰甘油(triglyceride，TG)、胆固醇(totalcholesterol，TC)等。1．3．5肾脏病理检查厚4um石蜡切片，常规HE、PAS及Masson染色，光镜下观察肾脏病理形态学变化，计算肾小球硬化指数(glomerulosclerosisindex，GSI)及肾小管间质损伤指数(Tubulointerstitiuminjuryindex，TII)，评估肾脏损伤程度。取体积约lmm3大小肾皮质用2％戊二醛甲次砷酸盐缓冲液4℃固定4h，之后固定于1％锇酸，Epon812包埋，切片厚度50nm-lOOnm，2％醋酸铀染色30min，柠檬酸铅染色10---15min．，日立JEM一1210EX型透射电镜下观察肾小球、肾小管及间质超微结构。1．3．5．1肾小球硬化程度评估参照文献Raij等n钔方法单盲分析肾组织形态学变化。根据肾小球硬化灶所占肾小球面积比例分为0-4级，0级：肾小球基本正常；卜4级肾小球硬化面积分别为：N1≤10％；N2：11％-25％；N3：26％-50％；N4>50％。每张切片(X200)随机选取20个肾小球，取3张切片均值。GSI=：[(1XNl+2xN2+3XN3+4xN4)／每张切片肾小球总数]X100％。N1一N4代表1-4级损害肾小球个数。采用ImagePr06．0高清晰度彩色病理图像分析系统，测量视野阳性信号的总面积及其占肾小球的面积比，评估基质增殖程度。1．3．5．2肾小管间质损伤程度评估参照文献H引，Masson染色光镜(×400)下每张切片随机选取10个互不重叠的视 青岛大学硕士学位论文野，依据小管扩张(ITDil)、小管细胞损伤(ITCD)、间质容积(IIV01)、间质胶原沉积(IColI)、间质炎性细胞浸润(ICells)、蛋白管型(ITC)6项指标作肾小管间质损伤指数(TII)评分。1．3．5．3免疫组化检测Envision免疫组化二步方法方法检测TGF一131、Smad7、FSP—l、Col—I的表达。(1)石蜡切片脱蜡至水(2)PBS冲洗5minX3次；(3)3％H：02溶液，室温下孵育20min：(4)ET修复液(PH8．0)对组织抗原进行高压修复，室温冷却30min，PBS冲洗5minX3次；(5)5％BAS封闭液，室温孵育20min，甩掉多余血清，不洗；(6)滴)JHTGF—Bl(1：150)、Col—I(1：150)、FSPI+(1：150、Smad7(1：200)一抗，以PBS代替一抗作为阴性对照，4。C孵育过夜：(7)室温复温30min，PBS冲洗5minX3次；滴]JHHRP标抗鼠／兔聚合物，37℃温箱下孵育30min，PBS冲洗5minX3次；(8)滴加新鲜配制DAB溶液，光镜下控制显色时间：蒸馏水充分冲洗，苏木素复染，1％盐酸分化，流水冲洗；(9)梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。阳性部位呈棕黄色，以ImagePr06．O计算机图像分析软件对肾组织免疫组化结果行半定量分析，用平均光密度(MOD)表示阳性物质的相对含量。每例切片高倍镜(×400)下至少随机选10个目标视野。1．4统计学方法数据分析采用SPSS17．0统计软件进行处理，计量资料采用x士S表示。方差齐性检验后采用单因素方差分析，组间比较采用tS9；方差不齐采用Dunnett’T3法检验。P