辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立与流行情况调查

《辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立与流行情况调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：S855.3单位代码：10183研究生学号：201185Z003密级：公开吉林大学博士学位论文辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立及流行情况调查EstablishmentofdiagnosticmethodandPrevalenceSurveyofEuropeanPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeinLiaoningProvince作者姓名：李冰专业：兽医博士研究方向：兽医技术服务指导教师：丁壮教授培养单位：动物医学学院2015年12月辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立与流行情况调查Establishm

2、entofdiagnosticmethodandPrevalenceSurveyofEuropeanPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeinLiaoningProvince作者姓名：李冰专业名称：兽医博士研究方向：兽医技术服务指导教师：丁壮教授学位类别：兽医博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年12月4日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位盲审专家正高级华中农业大学主席：王洪斌教授东北农业大学盲审专家正高级广西大学委员：钱爱东教授吉林农业大学盲审专家正高级西北农林科技大学张西

3、臣教授吉林大学盲审专家正高级中国农业科学院张乃生教授吉林大学盲审专家正高级东北林业大学高丰教授吉林大学李建华教授吉林大学冯海华教授吉林大学吉林大学博士(或硕士)学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2015年12月4日中文摘要辽宁地区欧洲型猪繁殖与呼吸综合征诊断方法建立及流行情况调查猪繁殖与呼吸综合

4、征在世界各地广泛流行，对养猪业造成了巨大的经济损失。近年来国内猪群中不断检测到欧洲型PRRSV，而且欧洲型毒株感染有上升趋势。欧洲型病毒株的感染不但可以引起猪只死亡，也能引起免疫抑制，同时还影响高致病性猪蓝耳病的防控工作。本论文以自然发病病例为基础，从病原学、病理学和分子生物学等多方面进行诊断方法的研究，并对分离毒株进行全基因测序，分析遗传变异特点，在此基础上建立PRRSV多重PCR鉴别诊断方法及间接ELISA检测方法，对辽宁地区开展欧洲型PRRSV流行情况调查，分析了发病原因并提出防控建议。用Marc-145细胞从疑似PRRS仔猪病料中分离到一株病毒，经电镜观察、中和试验、

5、PCR鉴定和基因序列分析确定为欧洲型PRRSV（命名为LNEU12）；通过仔猪感染试验对欧洲型PRRS的临诊表现、病理变化特点和病毒抗原在组织分布情况进行了全面的研究，初步建立了欧洲型PRRS的诊断方法，并证实辽宁地区存在欧洲型PRRSV。采用RT-PCR方法对辽宁分离株LNEU12的全基因序列进行分段扩增，并进行了序列分析。LNEU12毒株基因全长15083bp（不含尾部），GenBank登陆号为KM196101（已公布）。LNEU12毒株有8个开放阅读框，与国内外14株欧洲型PRRSV的核苷酸同源性为83.7%～93.0%，其中与欧洲型标准毒株LV同源性为90.1%，而与

6、美洲型标准毒株VR2332株同源性仅为59.6%。与欧洲型标准毒株LV比较缺失了18个核苷酸，在NSP2氨基酸的358～359和409位点分别缺失了4个和1个氨基酸，在ORF3、ORF4基因重叠区域缺失了3个碱基。针对欧洲型毒株ORF7和美洲型毒株NSP2基因序列用Oligo7.0软件设计2对特异性引物建立了多重PCR检测方法，该方法可以特异性扩增出欧洲型毒株、美洲型经典毒株和变异毒株的目的基因，片段大小差异在90bp以上便于电泳观察，重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。用重叠延伸PCR将欧洲型PRRSVN蛋白特异性线性抗原A、C位点的基因进行重复串联，合成186b

7、p的DNA基因片段。采用原核表达系统将串联基因序列高效表达，获得32.8kD的重组蛋白（含GST标签），经Western-blot检测，该重组蛋白能与欧洲型PRRS阳性血清发生免疫反应，并且具有较高的特异性。用纯化后的重组蛋白包被酶标板，建立了特异性检测欧洲型PRRSV抗体的间接ELISA方法，该方法可以有效区别美洲型、欧洲型毒株的中和抗体。I用建立的间接ELISA方法对辽宁地区欧洲型PRRSV进行血清学调查，结果显示个体抗体阳性率为0.51%，猪场抗体阳性率为4.55%；用多重PCR方法对57个猪场2