鸡β防御素重组乳酸菌的制备及免疫保护效果研究

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：20130694硕士学位论文鸡β防御素重组乳酸菌的制备及免疫保护效果研究Researchtheimmuneprotectiveeffectofchickengallinacrecombinelactobacilluspreparation作者姓名：张吉颖学位类别：专业硕士专业名称：兽医硕士研究方向：动物微生态与粘膜免疫指导教师：王春凤教授所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容

2、外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借

3、阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月摘要防御素抗菌谱广，对人和动物无毒副作用，具有免疫原性低、无耐药性、无残留、溶解性和热稳定性好，对高离子强度和pH变化不敏感等特点。因此，防御素具有替代传统抗生素的潜力。β

4、-防御素是动物体内一种重要的抗菌肽，不仅有抗病毒和杀菌的作用，而且它还参与机体的免疫调节，有较高的研发利用潜力，是当前生物医学的研究热点之一。本研究以鸡β-防御素6(Gal-6)为研究对象，根据Genebank中登录的Gal-6序列合成Gal-6，构建含有Gal-6的质粒pUC57-T-Gal-6。将它和穿梭表达载体pSIP409同时进行酶切，连接构建pSIP409-Gal-6质粒，转入大肠杆菌DH5α中进行鉴定，进而将鉴定正确的质粒利用电转化技术转入乳杆菌感受态NC8中。制备重组Gal-6基因乳酸菌。通过SDS-PAGE、Westernblotting方法

5、检测Gal-6在植物乳杆菌中的表达情况，应用薄层平皿琼脂糖扩散法测定重组乳酸菌的抑菌活性。结果显示成功构建了重组质粒pSIP409-Gal-6，并利用电转化技术成功转入植物乳酸杆菌中，通过检测验证表达成功。抑菌活性实验证明Gal-6分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌活性。为进一步分析重组乳酸菌的免疫保护性效果，验证Gal-6是否能增强鸡的机体免疫功能，增强抗病和抗感染能力，将构建的重组乳酸菌pSIP409-Gal-6经SppIP诱导表达后饲喂雏鸡，45只2-3周龄的雏鸡随机分成3组，每组各15只，三组分别为pSIP409-Gal-6组，pSIP40

6、9组和PBS组，以重组乳酸菌5.0×109CFU分组口服免疫雏鸡，每只免疫计量控制为0.3ml，按以上计量进行免疫三周，第四周停止免疫，第五周再次进行免疫，免疫周期结束后对鸡翅下采血并用流式细胞术检测CD4+和CD8+T淋巴细胞。口服免疫结束2周后用致病性大肠杆菌ETEC5.0×1010CFU进行攻毒实验。攻菌后每天监测体重，检测各组实验鸡的体重变化。攻毒后第10天处死，取十二指肠、回肠、盲肠制作石蜡包埋组织切片，H-E染色后观察肠道病理变化。结果显示，pSIP409-Gal-6组和pSIP409组的体重丢失低于PBS组。从流式细胞仪检测结果看出，Gal-6

7、能够增加CD4+T淋巴细胞数量，增强机体免疫力。攻毒后肠道病理切片得出，口服重组乳酸菌pSIP409-Gal-6能改善肠道病理变化。因此，将β-防御素通过乳酸菌在动物体内表达，增强动物机体抗感染能力，这对动物性食品安全和公共卫生具重要意义，对减少和替代抗生素的使用起到积极促进作用。关键词：鸡β-防御素，乳酸菌，Gal-6，大肠杆菌ETECIAbstractDefensinhasthecharacteristicsofwideantimicrobialspectrum,non-toxicsideeffectsforpeopleandanimals,lowimm

8、unogenicity,nodrugresistan