2011-2014年我国部分地区诺如病毒的分子流行病学研究

2011-2014年我国部分地区诺如病毒的分子流行病学研究

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单位代巧:84501号:MPm3011‘J密级:硕女《隹讼A1m1II20-112014年我国部分地区?璋另病^诺如病毒的分子流行病学研究IM1|’生:?L翔羽制^、lq培养单位:中国疾控中也病毒病所|Ij导师:段招军研究员/I心^指导老师:斬森副研究员现场导师:刘巧P助理研究员专业:公共卫生^ii^y^12'?■iijr2015年I 中国疾病预巧控制中屯、公共卫生硕±学位论文分类号;A14密级:UDC:025.32单位代码84501:学位论文-20112014年我国部分地区语如病毒的分子流行病学硏究研究生;孔翔羽导师:段招军研巧员指导老师:斩森副研究员现场导师;刘娜助理研究员中国疾病预防控制中也病毒病预防控制所申请学位级别:公共卫生硕±学位授予单位:中国疾病预防控制中也2015 中国疾病预防控測中也公共节牛硕壬堂也论文''20-112014年我国部分地区诺如病毒的分子流巧病学硏究研究生孔翔羽导师段招军研究员指导老师斩森副研究员现场导师刘娜助理研究员中国疾病预防控制中松病毒病预防控制所北京市昌平区昌百路1扣号102206tofViralDiarrheaNationalInstiUteJiiD巧artmen,ofVralDs化seControlandPrevention,沈ineseCenterforDiseaseControland化evention(CCDC)1巧Changbailu,化an甜in削u,Beijing102206,P.R.China 中国疾病预防控制中必公其卫生硕±学位论文学位论文原创性、真实性声明20-112014本人郑重声明:《年我国部分地区诺如病毒的分子流行病学研究》是本人在中国疾病预防控制中‘。攻读公共卫生硕去学位期间。,在导师指导下完成的公共丑生硕壬学位论文我承拖本论文中、乂及研究结果均真实可信所涉及的所有数据试验记录k,引用资料已注明出处无剥窃、篡改、抄袭之行为。如本论文原创性方面出现问,题,我愿负法律责任。本课题的研究成果杉中国疾病预防控制中所有,发表文章的单‘。位署矣为中国疾病预防控制中。特此声明!学位论文作者(签名):研究生导师(签違):201月曰20l畔月曰J^^^7 中园疾病巧防控制中也公共卫生硕±学位论文目录缩略词表12中;¥:摘要英文摘要5臟能9材料和方法111研巧目的112研究方案113技术路线124材料方法13職结^18職32结论35课题的局限性巧参考纖36附录401、综述40248、麵3、个人简历494、難树50 中国疾病预防控制中也公共卫生硕壬学位论文缩略词表英文缩写英文全名中文全名HuCVHumancalicivirus人类林状病毒NLVNo-rwalklikevirus诺瓦克样病毒NVNorovirus诺如病毒0DOticalnsipdety吸光度SVSapovirus札如病毒rmtt/inRevoluionserminue每分钟转数pORFsOenreadinframespg开放阅读框架PCRPolmerasechanreactonyii聚合酶链反应 ̄ ̄ ̄-meReversetranscriptionolrasechain^py逆转录聚合瞧反应t巧acionbpBasepairs碱基对yLMicroliter微升DNADeoxyribonucleicacidis脱氧核糖棱酸dNTPDeoxyribonucleosideTriphosphate脱氧棱糖核背兰鱗酸1 中国疾病预防控制中也公共卫生硕击学位论文-20112014年我国部分地区诺如病毒的舒流行病学研究中文巧要背景诺如病毒(加1:0¥1]:11565,化乂3)属于杯状病毒科(〔&11(;1¥1]:11563)诺如病毒属(加:1:0\^]:115),一是引起全球人类急性胃肠炎暴发流行的重要病因之,可感染所有年齡组。诺如病毒具有传染性强、变异快巧环境中稳定的特点,常在学校、家庭、医院、军队等较封用场所的人群中引起5暴发,也是引起岁下婴幼儿腹泻常见的病原,仅次于轮状病毒。发达国家将轮状病毒疫苗纳入免疫规划后,诺如病毒就迅速取代轮状病毒成为引起婴幼儿腹泻的最重要病原。诺如病毒每隔几年就有新的变异株出现,引起全球诺如病毒暴发流行。据报道,诺如病毒在美国每年引2100,90万口、40万急诊病例、7起万人感染其中包括1诊病例.1万人住院病例和800人死亡。美国因诺如病毒食源性暴发在医疗费用和生产力损失方面达2么美元。在发展中国家,诺如病毒导致21.8万5岁W下儿童死亡。随着我国经济水平及病原检测能力的提高,诺如病毒暴发引起了社会和民众的高度关注。2013年1至3月,广州大学城6所学校相继发生诺如病,22014年12月,10巧3毒疫情发病人数扣人,;浙江嘉兴学校所幼儿园发生诺如病毒暴发发病人数511人。长期的监测研究表明诺如病毒在我国5岁W下儿童腹湾病例的阳性率为…-20%20-40%。由此可见诺如病毒肠胃炎是包括我国在内的全;在成人腹泻中的阳性率为球性的公共卫生问题。因此,开展诺如病毒分子流行病学研究,了解诺如病毒在我国的流行规律、流行毒株特征,对我国病毒性腹泻的预防控制工作具有重要意义。目的20-204分析111年我国部分地区5岁下腹泻住院婴幼儿中诺如病毒的疾病负担、流行特征和分子变异规律,为我国诺如病毒胃肠炎的预防和控制提供基础数据和科学依据。方法11142798.收集和整理201年月至201年1月四年间19个监测地区19份5岁W下腹泻住院婴幼儿的人口资料、临床信息及检测结果,应用统计学方法分析我国诺如病毒的流行特征。2 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文220-2010685.收集11U年我国部分地区份岁W下腹泻住院婴幼儿诺如病毒阳性粪便样RT-PCR、本,序列加王、比对及系统,采用方法扩増诺如病毒聚合酶区基因片段通过基因测序进化分析方法确定聚合酶区诺如病毒基因型别,分析诺如病毒基因特征及流行株变异情况;--3.对其中20132014年494份诺如病毒阳性毒株,采用RTPCR方法扩増诺如病毒衣壳蛋白区基因片段,过基因测序、序列加工、比对及系统进化分析方法确定衣壳蛋白区诺如病毒基因型别,并利用聚合酶区和衣壳蛋白共同分析诺如病毒基因特征,确定聚合酶区和衣壳区型别一致的诺如病毒毒株不。结果-97981.收集20112014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒全国共检测样本1化阳性752022025%201314-3454份.%,1I.,.48%。20112014,平均检出率为1年度最高为,年度最低为59-年年我国岁W下住院腹泻儿童诺如病毒阳性率最高的年龄段依次分别为11月(24.01%)、一----2041217月(24.27%)、1217月(17.75%)和68月(20.28%)。20111四年间第至第四20-04%1662%9.87%1548%20U2014季度诺如病毒平均检出率分别为.、.、1和.,监测数据表明,-年我国腹泻住院婴幼儿诺如病毒感染全年均有发生,在23月和9月呈现季节裔峰,9的高峰--(检出率是23.3%)稍高于23月(22.5%和21.6%)。20112014年诺如病毒检出率在19个监=测地区的分布有差异(卡方542.963,P<0.05),其中前H位的分别是福建、江苏和四川,检29,出率分别为.71%、26.48%、23.96%,而新疆、湖南、河南这H个地区的检出率较低分别1118%1017%403%。58091120.47%为.、.、.其中沿海地区检测样本份,阳性样本89份,阳性率为;内陆地区检测样本139抑份,阳性样本2265份,阳性率为16.19%,沿海地区和内陆地区诺如=521P<0.3.05)。病毒的检出率有统计学差异(卡方,北方地区和南方地区诺如病毒检出率存=3067,P〈05,在统计学意义上的差异(卡方.8.0),南方地区诺如病毒检出率高于北方地区沿二=海南方和内陆南方诺如病毒的检出率也有统计学差异(卡方22.600,P<0.017,a校正0.017);沿海南方的诺如病毒检出率高于内陆南方诺如病毒检出率。221-1111.01204年共获得068个诺如病毒毒株聚合靡区序列GII99.3(060/068),,占GI07%8/1068GIL4589%629/1068)GIIP口,占.()。型为主要检出型别,占.(.;其次为型333%(1068-)0134%GIIP1、GII.P2、GIIP5、GIIP6、占.356/他型别检出率在..,...;其包括GII.P7、GILP13、GII.P16、GII.P17、GH.P21、GII.P22、Gll.Pe、Gll.Pg、GI.P2、GI.3、一-GI.4和GI.6。20112014年GII.4型进步分为H个亚群GII.P4/DenHaa、GH.P4New,g/20-20Orleans和GII.P4/的化巧2012。GII.PVDenHaag变异株在1114年占GIL4型的百分3 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文915%、804%、163%10%GIIP4Ol8%63%率分别为...和../Newreans百分率为.5、.、;变异株所占5%1%GIIP4/S2012017%98%和.化巧、3.3%、78.。两;y变异株所占音分率为和个主要检出的基因型GII.P4和GII.P12在不同地区分布有差别,新疆、四川、福建、山西、北京、江苏、广东和广西GII.P4所占的比例高于GII.N2、、P12,内蒙古河北上海和吉南GII.的比例高于GII.P4,吉林和安徽GII.P12和GII.P4所占的比例相当。在5岁W下的腹泻住院儿童中,4GIIP453%左右48-的月岁W前的儿童.所占的比例在,在各个月齡组相差不大但是在龄中没有发现GII.P4基因型5岁レ;[30%5。GIU在:下儿童月龄组中占但是在小于月龄儿童中所占比例较島,在6月W上所占比例较低。3-.获得20132014年我国部分地区诺如病毒衣壳区基因序列494个GII.4,W型为主,占526%GII4S2012G4NewOrleanG4.,其中./ydn巧变异株、II./s变异株和II./DenHaag变异II35%11IIII-I3-株分别占G.4的9.、5.4%和.%。其次是G.3,占38.5%,其中G.3D和GI.E变异株分别占GII.3的8.9%和91.1%;其他型别包括GII.2、GII.5、GIL6、GII.7、GII.9、G-13H.、GII.17、GII.20、GII.21和GII.22,占0.2%义7%。一4-.获得20132014年间486株同时具有聚合酶区和衣壳蛋白区序列的毒株,其中型别致,,的毒株共265株占54.5%包括GII.17(3株)、GII.21(3株)、GII.6(1株)、GII.22(1株)、Gll.7(5株)、GII.4/Sydney2012变异株(218株)、GII.4/NewOrleans变异株(17株)和GII.4/DenHaag一变异株(17株)221,.4%GII.P12GII.3(;型别不致的毒株共个占化,主要为/聚合酶/衣壳区)(177株)。结论一-1.诺如病毒是引起我国5岁W下儿童住院腹泻的个重要病原,20112014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒检出率为17.5%(3化4/巧巧8)。222-39.诺如病毒主要感染岁W内儿童,每年的月和月为病毒感染高峰期,诺如病毒检出率南方高于北方,,沿海高于内陆有统计学差异。3.我国5岁W下住院儿童诺如病毒呈基因多样性,包括4个GI和14个GII基因型,其中GII.P4型为主要流行的基因型,2012年Sydn巧2012变异株取代GII.4/DenHa%变异株成为新的流行株;聚合酶区分型中GII.P12是仅次于GII.P4的主要流行株。4.聚合酶区和衣壳蛋白区系统进化分析提示诺如病毒发生重組或混合感染的比例较高。:病毒性腹泻婴幼儿关键词;诺如病毒流行病学因型;;分子;基4 中国疾病预防控制中必公共卫生硕±学位论文AbstractBackroundgNorovim化sNoVsbelonin化Caliciviru化sNorovimshavelonbeenreconizedasoneof()gg,,gg化'eimportantcau化sof讯eworldshuma打acutegastroenteritisoutbreak,whichcaninfectallagegroups.NoVshave化echaracteristicsofstronginfectious打ess,rapidm山ationandbeingstableintheenvironme打t.Andtheoutbreaksoftenoccurredin化lativelye打closedspacessuchasschools,homes,hospitalsa打dmilitary.Inaddition,NoVsarealsocommo打athoe打whichcauseddiarrheaininfantspgandchildrenlessthan5earsoldrankinonlsecond化rotavirus.Afterdeveloedcountriesindudey,gyprotavrusvacc打enoermmunzaonroramsoVsuicklreacedrotavrusaneeiiit化iiitiNlidbecam化,ypgqpmostimortantathoe打causininfantUediarrhea.AnewNoVsimitantstrai打aearseverfewppggppyyearsandcau化salobaloutbreak.Itisreortedthat21millioneolein化eUnitedStatescausedbgpppy打orovmsnfectio打eacheari打19milionoutatie打ts0.4millionemerenccases71000iiycludi打g.l,p,gy,:hospitalizationsand800deaths.medicalexpensesandroductivitlo巧intheUnitedStatescausinpygbfoodborae〇山1)化&扛5ofNoVsreached¥200million.IndeveloincountriesNoVsled化218000ypg,,deathsfbrchildrenunderage5.Wilh化edevelopmentofeconomicsandpathogendetectioncapabilitynChnaoiUbreasofNoVssedreatconcernin化ewholesocietandeole.iikhavecau^gyppDuringJanuary化Marchi打2013,NoVsoutbreaksoccurredin6schoolsin化eGuangzhouUniversitit,witii652incidencecases.OnDecember2014NoVsoutbrein10schoolsand3yCy,aknurserscls-hooinJfiaxinZheianProvincewi化511incide打cecases.Lontermmonor打stuyg,gkidyj,gg--showedthatNoVsositivechildrenunderae5wereashihas10%20%whileinadultswerepgg,20%-40%ThVtrtitloubcealtliliChina.usNosasoenerisisaballihhrobemncudnin.,ggpp,gTttofosunderstandthereforesudonhemoleculareidemioloNVinonheeidemicreularit,ypgy,gpgyandandemicstraincharacteristicofNoVsinChinaisofvitalimportancefor化ereventionandppcontroofvraarrhea.lildiObectivesjAnalsisofthediseaseburdeneidemioloicalcharacteristicsandmolecularvariatilawy,pgonofoVsnostazed打fonarrheaunderae5nsomeareasofnaomo1NihiliitsfordigiChifr2011t204p,couroveascataandscentcevide打cefbrthereventionancontrolofNoVldpidbidi巧pdsastroenteritisg.5 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文Methods1iliiii.Collectandoranize19798demorahcdatacncalnformatonand化巧resultsofggp,hositalizedinfantsfordiarrheaunderae5in19moni1:orinareasfromJamiai2011化pggyDecember2014.Statktcame化odswereu化d化analze化eeidemiccharacterkticsofNoVsinilypChina.-2.Collect1068samlesoffaecesofNoVsositivehositalizedinfantsfordiarrheaunderae5inpppgf-someareasoChinafrom2011U)2014民TPC民wasuse!〇amleeneamentinthe.d:pifygfrg化omerasereonofNoVse打eseuencnseuencerocessnanmentandoeneicplygi.Gqigililt,qpg,gphyganalysismethodwasused化determineNoVsgenotypesinIhepolymeraseregionandanalyzegeneticcharacteristicsandvariationofepidemicNoVsstrains.--3494NoVs-os化amFoitvestransobtainedin20132014RTPC艮wasusedeene.riilip,pfy化gfragmentin化ecapsidproteinareaofNoVs.Genesequencing,sequenceprocessi打g,alignmentandphylogeneticanalysisme化odwasusedtodetermineNoVsge打otypesin化ecapsidproteinarea.Polymeraseregiona打dcapsidroteinwasused化gether化analzegeneticcharacteri巧icspyofNoVsand化determinediferentNoVsstranswenotesin比eolmerasereonandii也i,gyppygcasid巧gion.pResults1.19798demographicdataclinicalinformationandtestresultsofhositalizedinfantsfordiarrhea,punderage5in19mcmi化ringareasfromJanuary2011toD说ember2014werecollected,wi化-〇3454NoVsositive.Theaveraedetectionratewas17.5/〇wi化化ehihest20.25%in2012andpg,g化-eIowestl448%n2013Theaerouswthie巧NoVsostveratenhositalized.i.ggpihghpiiip-20--ifantsrdarrheaunderae5in201114were911months24.01%1217monthsnfoig(,)-〇h-2028%24lTh.27%1217monts17.75/^and68months.resective.eaveraedeletion(),(〇(),pygfrfit化201-ratesofNoVsom化ersuarter化e仿urthuarterin12014were20.04%、16.62%、qq1987%and1548%tilMitttftNVtit..resecve.onorindaa沈owediaosinfecionsinhosalized,pygpnfanoriarrinhinaaveoccurred化rouhout化ewholeearfrom1and化eitsfdheaChg201化2014y,eakseasonshowed-inFebruararchandSetemberwhile出eakinSetemberdetectionpyMp,epp(Feb-225%and26Ntt!rateof扣.3%)isslightlyhigher也anruaryMarch(.1.%).oVsdetecio打rae=--showeddiferenceschisuare542963P<00519t20112014T..in化emoniorinareasin.he(q,)g6 中国疾病预防控制中如公共卫生硕古学位论文〇lteeareasareFuanJiansuandSichuanandtileetection29.71%2648^d:ohri,g,drateswere./?anpj,2396%resectivel.TtectonratesofXinimiHunanHenanwereowerwt1118.hedeilih.%,pyjg,,,,10.17%,4.03%,respectively.5809samplesweredetectedin化ecoastalareas,with'-t1189NoVsosiivesamlesandtheositiveratewas20.47%.13989samlesweredetectedinpp,pp〇-iswt2265NoVsotvesamlttt1619/ThNVtilenlandareai;hsiiesandheosiiveraewas.〇.eos,pp,p=detectionratesincoastalandinlwdwerestatisticalsinicantch-sre52.31P<0.05.lygif(iqua,)TheNoVsdetectionratesbetweennorthernandsouthernwgionswerestati巧icallysign巧cant=ch-isuare30.678P<0.05.TheNoVsdetectionratesin1:hesouthionwerehiher化anq,regg()1hati化rtA1NVdetectiont:nenohernregion.打d:heosratesincoasalscmthemregio打a打dinland-=sothernwerea-unrelsostatisticallsinificantch22600P<0017acotigioygisuare..rrecon(q,,0.TNoVs化ctionratesncoastasouernreonwereerthanannandouern.017)hedeilthgihigh化tiilsthreion.g20—21120141068olmeasereonsetritiGII.yrgiuencesofNoVssanswereobainedofwhchpq,accountedfor99.3%060/1068GIfbr0.7%8/1068.GH.4tewasas化emaindetection^),()yp0type,accountmgft)r巧.9%(629/1068);the打followedbyGII.P12type,accoimtingfor33.3/0356tttttt-/1068deecionraesofoheresaccouninfor0.13.4%includinGII.P1、GII.P2、,();ypggGIIP5、GIIP6、GIIJP7、GIIP13、G比P16、GIIP17GIIP21G比P22、GILPGllP、....、.、e、.gG-I.P2、GI.3、GI.4andGI.6.TheGII.4typein201l2014wasfiirtherdividedintothreesubgroups,GII.P4/DenHaag、GII.P4/NeworleansandGII.P4/Sydney2012.ThepercentageofGII.P4/〇DenHtantsaccountn-aa.t20112014wa915%804163/d10%gmuigforGII4ypeins.,.%.〇an.,0resectve.TheercentaeofGII.P4NewOre抑smutantswas85>63%5/and1%pilypg/l,%,.,0,巧sectivelwhilefor化eGII.P4/Sd打2012化eercentaewas013.3%78.7%and98%py,y巧,pg,,,巧sectively.Thetwomaind幻ectedgenotypesGII.P4andG化PI2diferedindiferentpdistributionarts化erortionofGII.P4inXinia打SichuanFuianShanxiBeiin^Fiansu,ppo,,,,,pjg,jjggGuangdongandGuangxiwashigherthanthatofGII.P12.TheproportionofGII.P12inInnerMo打olaHebeiShanhaiandYunnanwashieranGIIP4TheG比PI2andGnP4gi,化...,gghaccountedsimilarroortioninJilinandAnhui.Among化ehositalizedchildrenfordiarrheappp^-thtGIIP4-under5earseroorionof.inchildrenunder4earoldwasabout53%anddidnty,ppyhavece-muchdineachaeouBti1tGIIP4wtfbund4859iferenggrp.u:heenee.asnoin化egyp〇monthsgroup.GIDaccountedfor30y^in化0childre打under5yearsofagegroup,butaccounted7 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文-ah-ihroorto打nechlrenunr5montholdandaccountedowerin也echren6gppii也iddelildmonthsolder.3494ene-seuencesi打ecasidroteinareaoNoVsinsomeareasoChinain20132014were.gq化ppffobtai打ed,ofwhich化emaintypewasGIL4,accountingfor52.6%.GII.4/Sydney2012variants,GIL4/NewOrleansvariantsandGII.4/DenHaavariantsaccounted93.5%,5.4%andg〇-llresect-./〇ivel.Theseco打dwasG化3,accountinfor38.5%,ofwhichGII.3DandGII.3E,pyg%*variantsaccounted8.9and91.1%iesectiveland0化ertesincludedGII.2G化5,GII.6,,py;yp,〇〇-GII.7GII.9GIU3GII.17GII.20GII.21andGII.22accountinfor0.2/〇3.7/〇.,,,,,,g4-2014t.486strai打swithbotholmerasereiona打dcasidro化inreionin2013wereobainedpygpp呂,inwhich265had1:hesamestramteaccountinfor54.5%tincludinGII.173stai打sGII.21yp,g(,g),3staG化6tiIL22stansGII75stasGII.4S2012mutant218inssansGi.in/dne(),,y),y),()yy(stains,GIL4/NewOrleansmutant17stainsandGII.4/DenHaagmutant17)()(stains).221strainshadinconskte打types,accountingfor45.4%,mainlyGII.P12/GII.3*olmerase/casidreion177strains.(pypg)()Co田elusions1.NoVsareimportantpathogenwhichcauseddiarrheainhospi化lizedinfantsandchildrenfordltltifhosttfodiaiarrheaesshan5earsod.Theaveragedeteconrateopializedinfansrrrheayunderae5inChinafrom2011化2014was17.5%.g2.NoVsprimarilyinfectedchildrenlessrtian2yearsandtilepeakseasonshowedin-anddetecSouFebmarMarchSetember.NoVstionratein化ethwashiher化anthatin1:heypgNorthand化erateincoastalwashigher化antiiatininland,whichhadstatisticallysignific扣ice.3.Novsofhositalizedchildrenunder5earsinChinahadeneticdiversitincludinfourGIpygy,genotesand140。enotesofichtileGIIP4enotewasredominantJn2012Sdnewh.gypgyp,gyppyy2012mutanthadrelacedGII.4/DenHaavariationstrainandbecametheneweidemicpgpstrains.InolmeraseteGII.P12was化eredominantstrainsrankedonlafterII.P4.pyyp,pyG4.Phloeneticanalsismolmerasereionand化ecasidro化inreionshowedthat化eratioofygypygppgreoranizato打ormixednfectonooVswahgiiifNsigh.Keywords:Viraldiarrhea;Infant;Norovims;Molecularq)idemiology;Genotype8 中国疾病预防控制中必公共卫生硕dr学位论文研究背巧诺如病毒(Noroviruses,NoVs)属于杯状病毒科(仿姑),是引起全球胃肠炎暴W发流行的最重要病原。据统计,在世界范围内每年诺如病毒感染超过2亿6700万例,诺如病毒引起的暴发约占所有胃肠炎暴发的50%,在非菌性胃麻炎暴发中达到95%W上诺如病毒在美国每年引起2100万人感染,其中包括190万口诊病例、40万急诊病例、7.1万人住院58001一病例和人死亡。在引起全球食源性胃肠炎暴发的病原中排第位,占食源性疾病暴发6560%1’"21的W上。美国因诺如病毒食源性暴发在医巧费用和生产力损失方面达亿美元。诺如病毒尽管是自限性疾病,但是在儿童、老年人、免疫抑制病人W及患有基础性疾病的人当中"1也引起重症胃肠炎,甚至死亡。在发展中国家,诺如病毒导致21.8万5岁W下儿童死0-诺如病毒具有感染剂量低(1100个病毒粒子)和外环境持续存活(2至数周)的特点,使其很容易通过水、食物、飞沫W及污染环境在学校、医院、军队、邮轮、老人院和幼儿园等一一密集场所引起大规模暴发,并且很难控制。诺如病毒主要通过粪口途径传播。些作者已经"^?一提出人类杯状病毒可W通过污染患者呕化物的悬浮粒子传播。诺如病毒感染在年中各个季节都发生,但冬季常为高峰期。诺如病毒每隔几年就有新变异株出现,引起全球胃肠炎暴发一和流斤。2006年日本发生了巧年最大的次诺如病毒感染,发病人数超过300万人2012。年由于诺如病毒GII.4新变异株的出现,引起全球各国胃肠炎暴发感染人数明显増加。英国因G一^II.4新变异株感染的人数达119万人比前63%经济水平的提,年同期増长了,随着我国高,诺如病毒暴发引起社会巧民众高度关注。2013年1至3月,广州大学城6所学校相继发生诺如病毒疫情,发病人数652人;2014年12月,浙江嘉兴10所学校3所幼儿园发生诺如^-5.病毒暴发11020%,发病人数人。诺如病毒在我国5岁下儿童腹泻病例的阳性率为1^在成人腹泻中的阳性率为20-40%。但目对于近年来有关我国5岁W下住院儿童诺如病毒的疾病负担相关数据很有限,因此开展5岁W下住院儿童诺如病毒分子流行病学调查十分必要。诺如病毒属于单股正链无包膜RNA病毒,全长约7.5kb,包括3个开放阅读框(化enReadingFrames,ORFs)。ORFl编码聚蛋白,翻译后被蛋白酶裂解为分别为p48、NTP酶(NTPase)、p22、irlrotin-li,VP)、RNARNA病毒基因組连接蛋白〇;apegenomenkedg蛋白酶和聚合酶(d巧endentRNApolymerase,Rd化)ORFl和0RF2分别编码主要结构蛋白VPl和次要结构VP2一蛋白。VP1进步分为壳区(化ell,S)和突出区(Protrudingdomain,P),S区包裹病一毒RNA,P区通过较链区与S区相连,位于VP1的C端。P区进步分为P1和高变区P2亚区,9 中国疾病预防控制中如公共卫生硕±学位论文被认为受体结合巧潜在中和位点。由于人诺如病毒培养困难,因此无法对诺如病毒进行血清型分型,诺如病毒具有基因多样性,分为六个遗传组(Genogroup,G),GI巧Gn是感染人的主GIV,P1要的两个遗传姐,同时也感染人但很少检出。根据完整V氨基酸序列,每个遗传组进一一步分为多个基因型。GI和GII进步分为9个和22个基因型。但是由于诺如病毒重組发生0RFF一RF1/0R2重叠区,1,些基因型(衣壳区)比其他基因型倾向于重组因此根据聚合酶区(0)W和聚合酶区同时分型的双重命名系统被提出。诺如病毒具有基因多样性,GII.4基因型是引2-34起全球暴发的流行优势株,每隔年GII.型诺如病毒就有新的变异株出现全巧流行,引起W。自1995至今,II5/96(巧96年)几个G.4变异株与全球胃肠炎流行相关,包括9US株19[2。]1【]2【2][创、FarmingtonHills株(2002年)、Hunter株(004年)、200化株(2006年)、[23)脚lSdnNewOreans株(2009年)和y巧2012株(2012年)。其他GII.4变异株尽管没有H12001i引起全球流行,但在局部地区引起流行enry200、a2003、,包括株Japan株、As株2006aApeldoorn2008。Asia200320042005株巧株株是我国和日本至年的流行优势株,在12"4其他国家未见报道。有关GII.型诺如病辜进化几个可能的机制己经被提出。群体免疫压力驱使衣壳蛋白高变区P2亚区发生抗原变异,该区域可与宿主细胞吸附因子组织血型抗原z"H-bt(sitoloodgroupantigens,册GAs)与其他基因型相比,GII.4型诺如病毒可结合更一GAG一广泛的册s。同源重组是导致新的II.4变异株出现的另个可能的机制,同基因型或不。GII同基因型之间重组非常普遍群体免疫逃逸和同源重组可能都是导致新的.4变异株出现的W"7’2?4重要因素。在GII.变异株流行的同时,其他基因型也引起世界局部地区的流行。95/9IWW6US变异株和FarmingtonHill变异株分别在1996年和2002年引起美国流行高峰。在1996年和2002年两个流行高峰之间,GII.4变异株引起的暴发占所有诺如病毒暴发的-1029%GII.3基因型从1996年的4%上升到25%。2009年1020103,,与此同时,月到年月GII.12基因型新的变异株在美国引起了32起急性胃肠炎暴发,占引起美国诺如病毒所有暴发w的16%。因此,诺如病毒其他基因型引起的流行也不容忽视。20-本研究对112014年我国部分地区的五岁W下腹泻住院儿童诺如病毒地感染状况、流行病学及分子特征进行了分祈和研究,较全面地分析了我国诺如病毒基因型的多样性和流行株的变异W及重组情况。上述研究为我国诺如病毒胃肠炎的预防巧控制提供了科学依据,并为我国诺如病毒疫苗的研发提供了基础数据。10 中国疾病预防控制中必公共卫生硕丈学位论文材料和方法1研究目的分析2011-2014年我国部分地区5岁下腹泻住院婴幼儿中诺如病毒的疾病负担、流行特征和分子变异。为我国诺如病毒胃肠炎的预防和控制提供基础数据和科学依据。2研究方案(固1)Figure.IResearchroramspg确定监测地区选择哨点医院确定调查对象采集标本、个案调查°-80C将仿本^存在I[省CDC;进行标本汇总、资料录入,每月30日前上送(传)相关表格和数据库,并每半年首月20日之前运送标本至中国CDC请毒病所][中国CDC病毒病所:对省CDC的部分结果进行复核图111 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文3技术路线(国2)Figure.ZTechnologyRoadmap诺如病毒阳性原始标本样本处理广核酸提取RT-PCRI测序i_序列分析,riTi序列加工序列比对系统进化分IIII?1'V±t诺如病毒基因料1IS资ki':?r]诺如病毒分子流行特征图212 中国疾病预防控制中也公共卫生硕dr学位论文4材料方法4.1实验材料4.1.1病毒标本20-收集和整理11年2014年我国19个省份地区全年19798例5岁W下住院腹泻儿童的粪便样本。42.1.实验试剂一ViralNucleicAcidExtractionKitII(台湾Geneaid公司)病毒;诺如步法试剂盒(德国QIAGEN公司)lOmMdNTPs(大连TaKaRa公司)RM酶RRI(大连TaKaRa;;抑制剂/公司);DNAMarker(大连TaKaRa公司);琼脂糖(北京华字泰克生物技术公司);生物素核酸Go化-TaPromeSit染料ldViewII(北京赛百盛生物工程公司);qDNA聚合酶(ga)、啡erScrp证逆转录酶(Invitrigen)、RRI逆转录酶抑制(宝生物工程有限公司);4.1.3实验仪巧 ̄X-漉满振荡器TD1(北京方通达科技公司)I生物安全柜Baker403(北京造蠢企业有限公司)一-化京市六仪器厂稳压稳流电泳仪DYY)PCR仪(Enpen公司)Powe-核酸电泳仪rPAC3000(田0RAD公司)一-33A韦最电泳槽DYCP(北京市六仪器厂)凝胶成像系统ImageMasterVDS(PharmaciaBiotech公司)电子天平肝323S(Sartorius公司)lml离也管、PCR反应管(Axen.Syg公司)滤芯枪头(Axygen公司)可调节移液器(E叩endorf公司)Thermo公洗板机:(司)he)酶标仪:(Trmo公司4.1.4所用软件PrimerPremiers、DNAMAN、DNAStar软件包、MEGA5.0、SPSS19.0等。4.2实验方法4.2.1标本处理(10%便悬液制备)13 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文4.2.1.1在1.5ml邸管上标巧标本号;4.2.1.2在每管中化入约900P1的诺如病毒标本稀释液(诺如病毒试剂盒中附带,为SampleDiluent);一4.2.1.3在生物安全柜中将每份粪便标本取lOOyl(固体取小碗豆大小),加入已标记好的EPEP一管中)(确保管上的标号与原始标本的标号致;’4-.2.1.4剩余的原始标本最好留在原容器中,冻存于20C;4.2.1.53次,每次10snrpmn用漉渴振荡器剧烈震荡,静止lOmi,8000离也5mi;一-4.2.1.6在生物安全柜中取上清进行下步试验或于2(TC保存。4.2.2核酸提取巧eneaU病奉核觀取试剂盒提取核酸)化-4.2.2.1在实验开始前,在ADBuffer和shBuff巧中分别加入30ml和50ml96100%的乙醇;4.2.2.2在核酸提取记录纸(实验记录纸)上记录本次实验操作者姓名,,实验日期所鉴定标EP本的名称及标本的顺序,标记好加标本的管;42EPW裂解缓冲液(V..2.3在每个标记好的管中加入400BLysisBuffer)’?4.2.2.4加入200叫10乂便悬液上清(1525(:)〇111111,,,游祸震荡混匀,室温静止1在此期间将VB柱子放入2ml收集管中;4.2.2.5加4則W已加乙醇的ADBuffer至上述样本裂解物中,游祸震荡混匀;4.2.2.6小也地打开VB柱盖子,将600W裂解物移至VB柱子中,注意不要弄湿柱子边缘,盖上盖子,13000rpm离也Imin;4.2.2.7弃去滤过液,仍将柱子放入原收集管中,将剩余裂解物加入至相应VB柱中I13000rpm离也Imin;4.2.2.8将VB柱移至新的收集管中,加400W化Buffer至VB柱中,13000rpm离也30S;4.2.2.9弃去滤过液,仍将柱子放入原收集管中,加600t4己加过乙醇的化shBuffer至VB柱1300030S子中,rpm离也;42210,130003...弃去收集管中滤过液rpm,离也空柱子min;-4..化ee.2.211将干燥的VB柱放入干净的15m化P管中,加50l4RNase水至VB柱中进行洗脱,室3m-_一湿膊育in13000rm离也Imin。RTPCR,2(rC或7(TC备用。,p病毒核酸直接进行或胆存于14 中国疾巧预防控制中私公共卫生硕±学位论文4.2.3PCR反应RT-PCR两步法检测诺如病毒,是针对诺如病毒不同的基因型别采用不同的引物扩増诺如RT-PCR病毒来进行鉴定与分型的。即两步法是检测诺如病毒衣壳蛋白区(Capsid),采用引物—-G1-SKF/G--ISKR和C0G2F/G2SKR,分别扩増诺如病毒的GI和別分型。而RTPCR步法是用来检测诺如病毒聚合酶区的,引物是P289/P290。检测诺如病毒所用引物如表1所示:表1诺如病毒分型的寡聚核昔酸引物Table1Norovirustypeofoligonucleotideprimers''病毒名齋扩增医^引物名称极性弓-3bI物序列巧产物大小)(p)NV-Gasd-FCGAATTYGTAAATGA330ICpiGlSK+CTGCC-G-ISKRCCAACCCARCCATTRTACANV-GIICapsidCoG2F+CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG387—G2-SKRCCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-TGACGATTTCATCATCACCATANVRPRD289H3巧289-1TGACGATTTCATCATCCCCGTA290H+GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC2901+GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC290J牛GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC290K+GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC-4.2.3.1RTPCR两步法:(1)RT反应;臥提取的病毒RNA核酸为模板,用随机引物进行逆转录,得到病毒的cDNA,0""反应体系如表2所示,轻微离也后放入PCR仪,反应条件为:巧C化,99C5min,4C保存。表2RT反应体系15 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文Tabe2RTreactionsstemly试剂体職SxFirsttrandBuf2.05sferiL|O.IMDTT0.75叫lOmMdNTPOJSiLp0.5mulRandomrimer0.巧lLg/p^50U/ulRNasin05.叫ZOOU/ul巧O.SiLIIIjH202.2iLiRNA7却LTotalIS川(2)PCR反应;得到病毒cDNA后用诺如病毒的特异性引物GISKFGISKR和COG2FG2SKR//进行基因扩增,引物终浓度为33Mm,总反应体积为巧HU反应体系如表3所示:表3诺如病毒PCR反应体系TablesNorovirusPCRReactionS巧emy试剂体积lOmMdNTP0.5叫lOxTaBuffer2.5iLqpT巧酶cmSpiL33nmGISKF0.2(iL33^mGISKR0.2叫33nmCOG2F0.2叫33^mG2SKR0.2叫H2018.575HLRT产物2.5叫Total25nL轻微离也后放入PCR仪扩増,反应条件如表4所示:表4PCR扩増的反应条件Table4PCRamlification巧actionconditionspm^°94C3min^°94C30s°?巧clesC3sCy巧0以。2〔Imin‘72C7min—4--.2.3.2RTPCR步法W提取的病毒RNA核酸为模板RTPCR,用诺如病毒的特异性引物方ll法:引物巧9/290,弓10lm50RNA2l5|物终浓度为^,总反应体积为n其中,反应体系如表所,^16 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文示:5RT-PCR表逆转录聚合酶区链反应()反应体系me-mTablesPolraseareaRTPCRreactionsstey()y-试剂体积aen-ones化PCRBuffer5xlOLQi呂pRT^dNTPmix10mMeach2il(\)lO^mP2893tiLlO^mP2903叫巧-2xlQiaienoneeRTPCREnzmemixgpy\5xSolutQion10叫Rnase-inhibrter0.25叫RNA2iLfH2017J5叫Total50xL|反应参数如表6所示为:表6诺如病毒聚合酶链反应RT-PCR()扩増条件hat-(Tabliitiile6)Norovirusolmerasecin巧acionRTPCRamfcaoncond化onspy()p—湿度时间°50C32min"95CEmin*94CImin「'40Ccles\49Clmin20sy^72VIminlOmin4.2.4琼臘睹巧胶电泳签定5R,1.5取nlPC扩増产物%琼脂糖凝胶电泳,电皮巧OV,用紫外投射仪观察目的条带,并PCR6.用凝胶成像系统照相,判断的检测结果。见图17 中閣疾病预防控制中如公共书生硕rlr学位论文'■-H‘,-1:巧言*;LT?9'IMw‘l品'-----—?^窜.f?K^'’"’*-|..T400b?a*二;护蘇遊成吗:料鲜/I讀每:.■^?■3〇〇b*-pml.w.Ij££iI小…-.V裙-腳匯p-斬._.-一If图6电泳结果Figure.6Agarosegelelectrophoresis4.2.5序列分析一将诺如病毒阳性标本的PCR产物送往北京天辉远生物技术有限公司进行序列测定。利用MEGA5对所获得的序列建系统进化树进行基巧亲缘性分析,参比序列均来自GenBank。4.2.6质量控制,为使调查方法科学,、严谨结果准确、具有可信性我们把质量控制贯穿于项目实施的全过程,,包括腔测哨点的选择参加调查的各级人员层层把好质量关、人员培训、实验室检测、标本的采集、保存、运送,数据的收集、整理、录入!^及统计分析等各环节、各阶段确定严格的质量控制方法,进行严格的质量控制。、、》?实验室设置上要分:配液区、模板提取区扩増区电泳区;实验流程为:配液区模板提取区》?扩増区》?电泳区顺序,严禁倒流。同时,我们及时、定期地对实验室,仪器进行卫生消毒;确保每次实验操作快速、准确等。研究结果-120112014年我国部分地区5岁W下腹毎住院儿童诺如病毒疾病负担2011-2014年,巧收集我国19个地区5岁W下腹泻住院儿童19巧8份粪便样本,诺如病34547-毒阳性数为份.52%。20112014.06%、,检出率为1年诺如病毒分年度的检出率分别为巧20.巧%、14.80%和巧.95%。凹年诺如病毒检山率有统计学差异(卡方=67.766,P<CK05),其中18 中国疾病预防控制中也公共卫生硕古学位论文2012年度最商,为20.巧%,2013年度最低,为14.48%。表72011-2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒检出率Table7TheositiverateofNoVsforhositalizedchildrenwithdiarrheaunder5earsofaeinppygCh-ina20112014,年度检测数阳性数阴性数诺如病毒检出率(%)2011年4660888377219.062012年4873987388620.2520135080巧243巧14.80年2014年51化827435815.95220。-2014年我国部分地区5岁W下腹泻住院如病韋流行病学情况-2,120112014年我国5岁BTF腹泻住院儿童诺如病幸申龄分布1-112014诺如病毒感染腹泻患儿最小月龄,最大59月龄,患儿平均月龄为12月。20年我国部分地区5岁W下腹泻住院儿童的诺如病毒年龄分布如表8所示,平巧检出率最高的是6-23----前月齡月龄(17.51%20.24%),平均检出率技低的是05月龄(12.41%16.30%)和24-49-24-(9.67%1.16%)。2011年11(.01%)48597.50%),月龄检出率最高,月齡检出率最低(;---2012年1217(24.27%)48閒月龄检出率最化(9.52%)20131217,月龄检出率最高,;年,-(1775%)3647-(8.43%)20H68月龄检出率最高.,月龄检出率最低年,;月龄检出率最高-(20.28%)2435(11.18%)。,月龄检出率最低表82011-2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒年龄分布Tabe8AeistritionofNoVsetecionratesoros化alizeirenw化hdiarrheaunr5lgdbudtfhpdchlddeea-rsofaeinChina20112014yg, ̄ ̄月龄分布2011年20口年2013年2014年2011-2014均值0-98122.9613.2613.9412.41月^43-517月.8317.5914.巧巧.化16.306-822月.0020.1614.9020.2819.巧9-1124月.0124.0916.3016.巧20.2412-2017月.3624.2717.乃18.3120.17-化1823月.化24.0213.巧16.巧17.51-008111化.18.;62435月.6717.11.14136-479月.669.918.4311.669.9148-597月.509.529.9011.769.67合计16.4117.3013.4114.7019 中巧疾病顿防朽制中私公化下I.生硕:巧位论文2-.220112014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒季节分布-2011204-1年我国5岁W下住院儿童诺如病毒检出率平均值最高的在23月(22.52%和〇〇21.59/〇)和9月(23.31/〇)(表9)。其中2011年的季节高峰在6月(29.75%)2012年季节;高峰在1月(25.巧%)和9月(28.72%);2013年季节高峰分别出现在2月(24.巧%)和9〇225/2014月(.8〇)3(70)(17)7);年季节高峰分别出现在月22.%和9月9.0%(图。表92011-2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒季节分布TablesSeasonaldistributionofNoVsdetectionratesforhositalizedchidithiplrenwdarrheaunder5朗rsofanh-ygeiCina20112014,-季度月份2011年2012年2013年2014年20112014年均值n^25.7283121116..96.02第—季度2月20.;3924.1024.1521.4522.523月19.3824.5819.6822.7021.59422月.5322.1653131巧..658.47第二季度5月19.2112.7511.19巧.8414.756月29.巧16.928.7411.2016.657月20.:3817.3715.87112.663第H季度8月24.6021.5418.口15.0019.979月22.4028.7222.8519.2723.3110月17.0320.%1448.19.0217.70第四季度11月20.1616.6112.2716.巧It4412月14.7313.777.2113.4612.29合计19.9320116071.385.63.8.005-''’'—.-■0IIII1''I1'>11;I"—111I1!111妄1M惠sISi重ii妻i衰gI重i当i君sii章1i童UiiiIi呈i吉iI表a1172011-20145图年我国岁lti下腹泻住院儿童诺如病毒季节分布Figure7SeasonaldistributionofNoVsdetectionratesforhospitalizedchildrenwi化diarrh巧underSearso-yfaeinChina20112014g,2-32011.2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病奉地区分布2011-20145年我国岁W下腹泻住院儿童诺如病毒检出率在19个监测地区的分布有差异〇(卡方巧42.%3,P<0.化),其中前H位的分别是福建、江苏和四川71〇、,检出率分别为巧./20 中周疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文2648%、2361118%、1017..9%,而新疆、湖南、河南这S个地区的检出率较低,分别为..%、4.03%(表10)。表102011-2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒地区分布TablelOAreadistributionofNoVsdetectionratesforhospitalizedchildrenwithdiarrhea-underSyearsofageinChina20112014,省份检测数阳性数检出率(%)13472792071河北.四川111829626.48吉林巧912化15.40福建1003298巧.71172399山西6148.新疆1521711.18内蒙1405271化巧119223019孤上海.江苏146135023.96河南1时9664.的湖南13281巧10.17云南5%6011.19安徽99717117.15北京21893巧16.67广东7扣10413.87甘肃巧312218.说12171巧1471广西.黑龙江417卵21.58山东:1挑巧15.05197983^^按我国地理和行政区域划分,19个监测地区中广西、福建、上海、江苏、广东、山东为沿海地区,河北、四川、吉林、山西、新疆、内蒙、河南、湖南、吉南、安徽、北京、甘肃、黑龙江为内陆地区091189,20.47%,沿海地区检测样本妨份,阳性份检出率为地区;内陆1398922化,6.1%地区和内陆地区诺如病毒的检检测样本份,阳性样本份检出率为1,沿海.05)。出率有统计学差异(卡方巧2.31,P<0,沿海地区诺如病毒的检出率高于内陆地区(表11)表112011-2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒检出率沿海和内陆比较TablellComparisonofNoVdetectionratesforhositalizedchildrenwithdiarrheaunder5earspyof-ageincoa巧ala巧as化inlanda巧asinChina20112014,,地区分布样本数阴性数阳性数检出率福sm4m20.47内陆13989117242265It19合计19798163443m17.5021 中国疾病预防控制中屯、公共卫生硕±学位论文按我国地理和行政区域划分,19个监测地区中黑龙江、山东、河北、吉林、山西、新疆、内蒙、河南、北京、甘肃为北方地区,四川、福建、上海、江苏、湖南、云南、安徽、广东、广西为南方地区。北方地区检测样本10196份,其中阳性样本1631份,检出率为16%;南方地区检测样本9602份23.,阳性样本18份,检出率为化99%,北方地区和南方地区诺如病毒=30678)05检出率存在统汁学意义上的差异(卡方.PO.),,南方地区诺如病毒检出率高于北方地区(见表12)2201-15表11204年我国岁W下腹泻住院儿童诺如病毒检出率南方与北方地区比较Tablel2ComparisonofNoVdetectionratesforhospitalizedchildrenwithdiarrheaunder5earsofyae-insouthernareas化northernareasinChina112014g,20, ̄ ̄ ̄ ̄涵宝分布样本数阴性数阳性数检出率(%)北方地区10196^16.00南方地区960277巧182318.9919798163441750合汁.^按我国地理和行政划分;,分为沿海南方、沿海北方、内陆南方、内陆北方划分。沿海南方广西、广东、上海、江苏、福建::;内陆南方云南、安徽、湖南、四川;内陆北方黑龙江、河南、河北、新疆、内蒙、吉林、山西、北京、甘肃、山东。沿海南方地区诺如病毒检出率(20.47%)(16.64%)(16.00%)分别高于南方内陆和北方内陆地区,有统计学差异:南方内陆和北方地。区诺如病毒检出率相当,没有统计学差异见表13。132011-20145表年我国岁!^下腹泻住院儿童诺如病毒检出率南方沿海、南方内陆及北方内陆地区比较Tablarthhlheaundeel3CompisonofNoVdeectionratesforospitalizedcidrenwithdiarrr5yearsof-ageamongsoutherncoastalareassoutherninlandareasandnorthernareasinChina20112014,,, ̄ ̄地区分布检测数阳性数阴性数检出率日8098946202047沿海南方11.内陆南方39796623317化.64内陆北方1019616318565化.00320U-2014年我国部分地区5岁抖下腹泻住院儿童诺如病奉分子持征3.1聚合巧区基因分型结果3-脚-.1.120112014年诺如病奉阳巧样本收集PCR、巧合庚区检測及测序情况-2011年收集北京和江苏两个地区诺如病毒阳性本共319份,利用聚合酶区RTPCR检测2巧12580份,通过测序获得序列数2化份20份,通过测序获得序列数430份;年收集样本共;20135572082014494年收集样本共份,通过测序获得序列数份,;年收集样本共份通过测序获得序列数225份;见表14。14--表20112014年诺如病毒阳性标本收集、RTPCR检测和测序情况22 中巧疾病巧防控制中必公共卫生硕±学位论文-Table14thenumberofNoVosttlllltdtectdiivesoosamescoecedRTPCReionanseuencedpp,q年份2011年2012年2013年2014年--地区m性RT-PC测阳性样RTPCR测阳性样RT-PCR测W巧样RTPCR测样本R检测序本收集檢测数序本收集检测数序本收集检测数序收集数数aS数北京1677878555日270_河北5694434342121l11105900il西__87848412610内裴1735920占林650393724黑巧0557302916TJ1:海日2020江苏15212712718180_^安徽日27202026108桶建3329591918182_山东0日3湖南301919151387_r00尔_广两001日1417_叫川82675427272010109云南0日181818新疆300423123728354总计319205205580257430日572012084941672253丄22011-2014年我国部分地区诺如病毒年度聚合酪区基因分型结果-巧所示-20112014年我国部分地区诺如病毒基因分型结果如表,20112014年共获得诺如068111213142011-病毒毒株序列1个,20、20、20和20年分别为205、430、208和2巧个2014。II9.3(1060/1068),GI1068)cIIP4,58.91068)年G占9占0.7%(8/G.型为主要检Hi型别占%(629/;-其次为G.,33.3%(巧6/1068)0.13.4%G.P、GII.P2、IIP12型占;其他型别检出率在,包括II1.巧、G..I....l...GIIII巧、GIIP7、GII.P13、GIP16、GIIP17、GIIP21、GIIP22、Gl.Pe、GllPg、GIP2、GIP3、0〇〇-G.I..II.I.P4和GIP6。20112014年GIP4型的检山率分另8O.7/0、目己9/〇、386/〇和44.目%;31|为G的一-检出率份别为28.2..2014II.4.6%、52%、522%和438%。2011年G型进步分为兰个亚群,GII.P4/DenHaaGII.P4/NeworlIIP4/Sdn2012,1日,g、eans和G.y巧各年度检出数如表所示-GII.4...P4/DenHaag变异株在20112014年hGIIP型的百分率分别为915%、80.4%、163%和'1.0%.l...;GII4/NewOreans变异株的百分率为85%、63%、5%和1%;GIIP4/Sydney2012变0133%787%98%2146站株的巧分率为、.、.和。聚合酶区系统进化分析见附录图1、和1。表52011-2014年()1我国诺如病毒年度基因分型结果聚合酶区23 中国疾病预防控制中也公巧卫生硕±学位论文T-able15GenotNi201ins山tofoVsinChna12014(PolenseRgi加)ypg怕,ym基因型2011201220132014总计GILP4/DenHaag1502291313^GILP4/NewOrleans14184137GII.P4/Sydn巧2012386398199GII.P122812210898356GILPI33GILP2112GII.P5224GII.P66219GIIP7141516%.GIIP1322.GII.P16617GII.P1744GIIP21112.GILP221214GILPe11Gll.Pg11GIP2112.(JI.巧33GIP411.GI.P622总计m1068^^^3-.1.320112014年诺如病奉基因型别年度分布20-根据112014年诺如病毒基因型别年度分布图(图8),GII.PVDenHaag变异株为-口年为主要201120优势株,自2012年GII.P4/Sydn巧20口变异株在中国出现,GII.PVSydn巧2012变异株逐渐成为优势株。24 ?中罔疾祸预防巧制中心公化。化倾I学位论文.500]450-400-350-300-250-引■圓■nV/IIiII2011201220132014■..Gll.P4/DenHaagGIIP4/rsiewOrleans■G!IP4/Sydne2012■GII.P12y■....GIIPl■GIIP2■GIIP5■GIIP61G.■6II.P13■GII.P16*GI.P171IP7I>■G..IIF21HGII.PS^GllPeBGIt.Pg■.GI.P2巧GIP3GI.P4Gi.P68-图20112014年我国诺如病毒基因型别年度分布圓Ftt-igu化8GenoypedistributionofNoVdeect:edinChina20112014,3-.1.420112014年我国诺如病奉聚合酶区基因型别地区分布如图9所示,两个主要检出的基因型GII.P4和GII.P12在不同地区分布有差别,新疆、四川、福建、山西、北京、江苏、广东和广西GII.P4所占的比例高于GII.P12,内蒙古、河北、上海和云南GIIP12II.P4GII.P12和GII.P4所占的比例相当。.的比例高于G,吉林和安徽25 :中闽疾桐预防巧制中私公共巧生硕I学位论文广闲如I广东I云南上巧巧龙江II北京女徽湖南河北^-山州■]I祸迷i吉林"H-]I新疆i—^―"p020406080100120140化0■日II.P4■GII.P12■GII.P7BGII.Pe■GII.P5■Gll.PgaGII.Pe■GII.P22■■GBG■GGII.P21II.P2II-PIBII.P17-■G...IIP16■GllungenotypedGIP4BG1P3■.it.GIP2GIP6图92011-2014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒基因型地区分布FiuresAreadtbuttdttnhotaltgisriionofNoVenoeeecedisiizedchidrenwihdiarrheaunder5gyppearsofagey3-2014.1.52011年我国诺如病毒聚合醇区基因型别年龄分布在5岁W下的腹泻住院儿童中,4岁W前的儿童GII.P4所占的比例在53%左右,在各个月48-59GP4IIP125龄组相差不大,但是在月龄中没有发现II.基因型。G.在岁W下儿童月龄组中占30%,但是在小于5月龄儿童中所占比例较高,在6月W上所占比例较低。(表16)。26 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文表162011-2014年我国5岁臥下腹泻住院儿童中诺如病毒基因型月龄分布FNoVi5igurel6Agedistributionofenotedetectedinhositalzedchidrenw化hdiarrheaundergyppyearsofage基因型分型0-2月3-5月6-8月9-11月12-17月18-巧月24-巧月36-47月48-如月合计GIIP426115110.6210396巧40480GIIP1224706目455717841292.幻I.P7055目8550135GIIP61000101003.GII0110000.P5002Gll.P0010000001gGII.化0000100001GIIP^0000100023.GII21000002.P0011GIIP2110100003.0(5II170030001004.PGIIPW0222100007.Gllungengtype0101100003GI,P40000000101GLP30020100003GI.P20000010102合计511421巧15119963301748634诺如病奉衣壳区基因分型结果4-.120132014年我国部分地区诺如病奉衣壳蛋白区分型结果根据衣壳区,2013年我国5岁W下住院儿童诺如病毒WGII.4型为主,占50.8%(120/236),其中幻1.4/Sydney2012变异株占GII.4的化.8%,Gll.4/NewOrl的ns变异株占11.7%,G-IID2.5II32II33941.4/enHa%G.型,占43.%,其中G.E.的.%,巧变异株占;其次是变异株占別G-II3D异株占5.9%型别包括GII.5、GII.6、GII.7、GII.2、GII13、GII.20和GII.21.变.,百;其他分 ̄率占4.21.7%。2014GII4543%Gll4Sne2012GII400%II3年仍W.型为主,占.,./ydy变异株占.的1G.型;--34II3EI75%IID125II占.1%,其中G.变异株占GI.3的8.,G.3变异株占.%型别包括G.6、;其他 ̄〇GII.7、GII.9、GII.2、GII.13、GII.20、GII.21和幻1.22,百分率占0.45.4/〇(表17)。衣壳蛋白区系统进化分析见附录图13、巧和17。27 中间疾柄质防抗制中必公化节生硕i:学位论义表2013-201417年我国部分地区诺如病毒分型结果(衣壳区)F-igure17GenotypingresultofNoVsinChina20112014(Casid巧gion),p基MGll.Gll.lGll.Gll.Gll.Gil.Gll.Gil.GII.4GII.4GII.4G..llGllGilGll.总13722021223-D3-EDenewdn型NSy.5679计HaaOrleaegyns20:1220131011106963141032440236^2014252031117700140014122584-.220132014年我国部分地区诺如病毒衣壳区基因型别季节分布根据2013-2014年我国部分地区诺如病毒衣壳区基因型别季节分布,主要WGll.4/Sydney2012变异株为主要流行,2009年流行的Gll.1NewOrleans变异株在2013年8,/月之后消失G-II4DenHa巧变异株在2013年5月6/和月有少量检出外,其他月份均未见。GII.3型主要W--G-II.3E变异株为流行II.3D变异株也有少量分布。GII.3E2013912,其次G变异株在年月至20147911G-月检出很少年月至月、II3E变异株。;月未检出/50'IG.II9化-GII.740G.IIGb巧iGiis30'十■G.dnell4/Syy2012.…-—25^————■G.lll4/NewOreans—■G.20II4/DenHaag-■.——-—_.Gll3E15■^;置tl&Hr"■G-舌5含單抒§^另2含ii20§隻妄3再-|妾〇<w〇2Q?u_S<^,WZ〇<图102化3-2014年我国诺如病毒衣壳区基因型别季节分布F-iure10SeasonaldistributionofNoVenotebasedoncasrhggyppideioninCina20132014g,-520口2014年诺如病毒聚合庚区和衣壳蛋白区双重分型5-.120132014年我国部分地区诺如病奉聚合庚和衣壳蛋白区型别分析2013-2014年诺如病毒聚合酶区和衣壳蛋白区同时分型获得序列的毒株共486株,根据系统进化分析一,在聚合酶区型别致的包括GII.17(3株)、GII.21(3株)、GII6(1).株、GII.2228 中国疾病预防控制中屯、公巧卫生硕±学位论文(1株)、GII.7(5株)、Gll.4/Sydne2012变异株(218株)、GII.4/NewOrleans变异株(17株)y一54和G,这些毒株II.4/DenHaag变异株(17株)。结果表明,型别致的毒株共2扣株,占.5%未发生重组。一型别不致的毒株共221个,占化.4%。聚合酶区是GII.P4/Sydney2012变异株,《壳区一-致型别包括GII3E(2GII2(291Gll4NOan4)不.株)、.株)、幻1.(株)和./ewrles变异株(株;一HP12G--聚合酶区是GllD、I.E、ll2、.,衣壳蛋白不致型别包括.3(18株)GI3(巧9株)G.2(株)G一II.9(1)和过1.4NewOrleans(4株)区是GII.P6区不株/;聚合酶,衣壳蛋致的型别包括一Gl202GII10I1l.4/Sydney口(株)、.6(株)、GI.9(株),其他聚合酶和衣壳蛋白型别不致的IUDenHaaGII4Nr2、IIPI1II.PII.5。包括Gg/./ew0l的ns(株)G.化/GIJ(株)和G2^G(4株)毒株的地区分布(表18)29 '‘-中闽疾柄顿防矜制中心公化下;.尘硕I吁化洛义表182013-2014年我園部分地区诺如病毒基因型分布(聚合酶区和衣壳蛋白区同时分型)*e-TabieaistrutionoenotedoVsinina20132014tincaisomerasel18AdibfgypNChbohdandl,ppy(reiong)"""" ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄^ ̄ ̄;叫内蒙H^I^^^I^^^IIIIII'PolmeraseCapsid北巧北古吉林让上海江苏安徽桐建山东湖南T两M川云南新體总计yG.II.P17GII171113GII.P21GII.21123GII.P22GII.2211GII.P6GII.611G.II.P7GII72215G.GII.4IIP4//DenHaaDenHaa56日17ggG.GII.4IIP4//NewOrleansNewOrleans48517GII.P4/GII.4/Sydney212Sydney2125181924322191912896化2化GII.P4/dne-S212G.yyII3E22GII.P4/Sydney212GII.222GII.P4/Sydney212G.II911G..IIP4/GII4/S212NeO44ydneywrleansGII.P4/GII.4/DenHaagNewOrleans22GIIP12GII222.._-G..1IP12GII3D5462118-G.II.P12GII3E143812325167163276191巧GII.4/G.dne212224IIP12SyyGII.P16Gil.1311GII.P22GII.544G.II4/G.SdneIIP7yy21222G..IIP7GII611322110G..IIP7GII911939563279364134332174412884865.22013年和2014年我国部分地区诺如病奉基因型别分布对2013和2014年聚合酶区和衣壳蛋白区型别均明确的485株诺如病毒进行基因型别分析,30 中闺疾巧预防巧制中必公化节生硕I:巧位论文2013年和2014占优势的变异株为GG12PG-S年ll.4/Sydney2012和II.II.3E。2013年Gll.4dne//yy2012G-巧%和巧冷2014-和II12PGII3EGll.4Sne2012GN12PGII3E./.分别占年/ydy和./.分别占55%和扣%(图11)2013年2014年6"".3E贯/2I[^■,USI-GM.17■G1I.211311.22■百ydnev2012I.3E巧■ll4DaHGrea■4Nwrld<j.enH^gIMNewOlnsGII.eOleans■日l.Sdne之012yYll.dr2012/G.lneG.L4enaa.NeI.4H.ean■GVSII2■Gl.4/Svdy2012II9■GIDH/Gll4wOrleans■GISdne2012/G4MewOrlsy巧/YgY■II.aGIP1-G6li.7GI.P12巧lUO■G(I.2/GH.3D■I-GI.P12/百11.3E*GII.P12/GII.化dne2012GIIP化ASIU5GIP22G.5vy../IIIPIP7巧1P7I.GI.7/幻I.化ydney2012G.1.6GI1./GI9112013-2014年诺如病毒基因型别分布图图(聚合酶区和巧壳蛋白区同时分型)t-tFliurellGenotedisributionofNoVsinChina20132014bohincaisdandomerasereiongyp,(ppyg)9进化树分析(图片见附录)-由图1213可W看出Kobe200化与NewOrleans2009在20122013,年仍有普遍流行;,在2014年,却很少有这两种毒株所致的感染。Sy化ey2012自2012年始便有流行,到2013与2014年,其所致感染逐渐增加,取代Kobe200化与NewOrleans2009,而成为优势毒株。14巧G-由图II.3型在1214II.P12,可W看出,诺如病毒年均有感染流行,其中,WG与R。0打erdamGII.3c为主由图16,17可W看出,2013年与2014年度均尚有其他型别的诺如病毒感染GII.6,尤W为著GII.1720141^?,。此外,GII.21、GIL7;自年来有着不可忽视的流行强度等型别W及札如病毒亦有着不同程度的流行。31 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文讨论20-本研究对112014年我国部分地区5岁下住院腹泻病例开展系统的诺如病毒分子流行20--11201454病学调查。年我国岁W下儿童诺如病毒检出率是1.80%20.25%,平均检出率为一17.50%,与其他国家报道的监测结果相致。俄罗斯对10198份腹泻住院儿童的监测表明,2003-20-0"12年诺如病毒的平均检出率为7.3%,不同年份阳性率不同,从7.1%21.3%不等。日2004-20-139本年腹汚儿童中诺如病毒的阳性率是3.3%.5%43.。,不同年份的阳性率为8泰国5岁W下住院腹泻儿童诺如病毒的阳性率是15.我国27省、市腹湾口诊病例诺如35<16%6-23病毒的调查表明,诺如病毒的检出率是11.,月齡检出率最高,为13.7%。根据诺如病毒感染的月齡分布201159-11,年我国岁W下住院腹泻儿童诺如病毒检出率最高的年龄段为24-月.01%20125217,检出率为年我国岁W下住院腹泻儿童诺如病毒检出率最高的为1,;月24-.27%201351217月为,检:年我国岁W下住院腹泻儿童诺如病毒粒出率最高的月龄段为-出率为17.75%,2014年检出率最高的月龄段为68月,检出率率为20.28%。2012年到2014年诺如病毒感染的月龄高峰在不断前移。可能是由于来自母乳的免疫保护。6月齡W前婴儿的6-24主要由于母乳喂养的免疫保护作用而感染率较低,月月感染率最島。同时2岁W上,诺如病毒的感染率开始后下降,在4岁到5岁之间诺如病毒的感染率最低,这可能与在儿童在2WW岁W后身体器官发育成熟,身体免疫力提高有关。四年的监测数据显示在我国诺如病毒在2月、3月和9月有两个感染高峰,2月为22.52%,321.59%931%,923月为,月为23.月的流行高峰稍高于月和月的流行高峰,此流行特征与"9胃1一"国内外报道致,2月3月处于在我国进入春季,气温从寒冷转向温暖的时间段;而9月在我国进入秋季则是我国气温从温暖转向寒冷的时刻,提示诺如病毒感染的高峰与气温的转变W有关。同时提示在临床诊断和治疗中,除轮状病毒引起婴幼儿秋冬季腹泻外,还应该考虑到诺如病毒感染。按我国地理和巧政区域划分,19个监测地区中广西、福建、上海、江苏、广东、山东为沿海地区,河北、四川、吉林、山西、新疆、内蒙、河南、湖南、云南、安徽、北京、甘肃、黑龙江为肉陆地区,19798,阳性%54170%全国共检测样本份份,检出率为.5地,其中沿海区检测样本5809份,阳性1189份,检出率为20.47%;内陆地区检测样本13989份,阳性样本226日份,检出率为16.19%,沿海地区和内陆地区诺如病毒的检出率有统计学差异(卡方=52.31P〈0.05)。,,沿海地区诺如病毒的检出率高于内陆地区提示可能与沿海地区人群的饮32 中国疾病预防控制中也公共玉生硕±学位论文"4‘?15食习惯有关,文献显示贝类等海产品中诺如病毒检出率较高,能达到如。从饮食习惯上一讲沿海地区人群比内陆地区人群接触贝类等海产品的机会多,更容易通过饮食感染,进步通过粪口途径传播给儿童。按我国地理和行政区域划分,19个监测地区中黑龙江、山东、河北、吉林、山西、新疆、内蒙、河南、北京、甘肃为北方地区,四川、福建、上海、江苏、湖南、云南、安徽、广东、广西为南方地区10196,6316%。北方地区检测样本份其中阳性样本1份,检出率为1;南方地区检测样本9602份,阳性样本化23份,检出率为18.99%,北方地区和南方地区诺如病毒二检出率存在统计学意义上的差异(卡方30.678,P<0.05),南方地区诺如病毒检出率高于北方地区,提示这可能饮食和温度因素有关,大多数南方地区属于沿海地区,而这些贝类等海产品比较丰富,而且贝类等海产品中诺如病毒的携带率较高;同时,温度的变化和差异影响者病原体的变异和流行。诺如病毒具有基因多样性,6,根据衣壳蛋白氨基酸序列诺如病毒可分为个遗传组-(Genogro叩,GIVI),其中GI、GII和GIV感染人,包括32种上的基因型别(Genotype)-(refs)。GII.4基因型是引起全球暴发的流行优势株,每隔23年GIL4型诺如病毒就有新的变异株出现,引起全球流行。自1995至今,6个GII.4变异株与全球胃肠炎流行相关,包括95/96US株(1996年)、FarmingtonHills株(2002年)、Hunter株(2004年)、DenHaag[1W]株(2006年)NewOrleans(2009年)W及Sydney2012株(2012年)。其他GII.4变异株尽管没有引起全球流行,enry2001aan2001Asia,但在局部地区引起流行包括H株、Jp株、tw20032006aA2008Ai320042005株、株和peldoorn株。sa200株是我国和日本至年的流W行优势株,在其他国家未见报道。在GII.4变异株流行的同时,其他基因型也引起世界局部地区的流行。95/96US变异株和FarmingtonHill变异株分别在19%年和2002年引起美国两WW个流行高峰。在1996年和2002年两个流行高峰之间GII.4,变异株引起的暴发占所有1-29%II12跳20090,G.39964%上0诺如病毒暴发的;与此同时基因型从年的升到年1月到2010年3月,GII.12基因型新的变异株在美国引起了32起急性胃肠炎暴发,占引起美15|>6%-国诺如病毒所有暴发的1。因此,诺如病毒其他基因型引起的流行不容忽视。20112014一年我国主要检出的型别是GII.4基因型,日8.9%,这与国内外报道相致。根据全球GII.4型GII4变异株流行的规律,每隔几年有新的变异株出现引起流行,我国.变异株的流行也符合全一球的流行规律。自2001年出现GII.4/DenHaag变异株后,直为我国诺如病毒暴发散发的流行优势株在本研究中DenHaag变异株在2011年仍为优势株,在20口年出现GII.4/Sydn巧33 中国疾病预防控制中屯、公共卫生硕±学位论文2012DenHaa。2015GII.变异株后,代替g变异株成为我国新的流行优势株是否有新的4变异一株出现,仍需进步监测。点突变是导致诺如病毒出现基因多样性的重要机制一。诺如病毒的基因特征之就是基因多样性,诺如病毒的基因型超过30个。本研究除了GII.4基因型外,根据聚合酶区检测结果,4GI12GIIGII4发现个和个。此外,由于点突变的累积,可能导致.变异株抗原表位或受体一结合位点发生变异,轮诺如病毒暴发,导致新的变异株出现,逃离群体免疫圧力从而引起新RNA病毒一一和流行,个重要机制。重组位点发生在。像其他样重组是诺如病毒进化的另'ORFl/ORFS重蠢区。对于诺如病毒来说重组极易发生,因此,根据聚合酶区和衣壳蛋白区的双15W11-2014重分类系统被提出。本研究在聚合酶区分析20年诺如病毒基因型的基础上,对20-20一RT-PCR1314年诺如病毒阳性毒株衣壳蛋白进步进行及序列分析。结果发现很多诺如一4病毒毒株聚合酶区和衣壳蛋白区分型结果不致(表1,。本研)这表明重组或海合感染发生一究型别不致的毒株占多数的是GII.P12/GII.3(聚合酶/衣壳蛋白).P7,其次GII与多种衣化e一壳蛋白基因型,Gll.VSyy2012变异株与多种基因型等。为排除混合感染的进步确定重组,需要扩増包括0RF1/0RF2重叠区的片段进行序列分析,这部分王作仍在进行。20-通过本研究132014年部分毒株利用双重命名系统被明确基因型别,处GII.4变异株(型一别致)为优势株外,仅次于GII.4变异株的毒株是GII.P12/GII.3基因型。GII.3基因型是儿童散发感染最常见的病原,在70年代末80年代、90年代早期、2000年左右,GII.3毒株在II1几个国家特别流行。G.3型诺如病毒在2000年后检出的毒株均是重组株。Jackie等对9巧年至2010年GII.3型诺如病毒进行分类,结合聚合酶区和衣壳蛋白区分析发现,GII.3型诺一A-E-如病毒按年代进化Lineage)oLineaDSublinea),,分为五个群(,ge进步分为两个亚群(g聚合酶区分别为GII.b和GILPL2。Lineag純的聚合酶区为GII.b。本研究检出的GII.3型诺如病毒衣壳区属于111163£6〇和^〇6&366,分别占8.9%和91.1%,聚合酶区均为611.口12。-DGIIP12/GII3.3毒株..亚群主要在亚洲如日本、韩国巧亚洲地区检出。本研究主要的GII一一G-GlII.P12/GII.3E衣壳蛋白区与先前研究致,但聚合区与分类结果不致,不是l.b,而G2G一是II.P1。因此,II.3基因型的流行具有定区域性GII.3,由此可见,不同亚群的型诺如病毒流行也存在一定的差异。34 中国疾病预防控制中如公共卫生硕±学位论文结论一-1.诺如病毒是引起我国5岁W下儿童住院腹泻的个重要病原,20112014年我国5岁W下腹泻住院儿童诺如病毒检出率为17.5%(3454/19798)。2-.诺如病毒主要感染2岁W内儿童239,,每年的月和月为病毒感染高峰期诺如病毒检出率南方高于北方,沿海高于内陆,有统计学差异。351.我国岁W下住院儿童诺如病毒呈基因多样性44Gn基因型GII.P4,包括个GI和个,其中型为主要流行的基因型,2012年Sydn巧2012变异株取代GII.4/De地aag变异株成为新的流行株;聚合酶区分型中GII.P12是仅次于GII.P4的主要流行株。4.聚合酶区和衣壳蛋白区系统进化分析提示诺如病毒发生重组或海合感染的比例较高谋题的局限性一1,.个别省份无法获得诺如病毒序列信息或同个省份未获得连续的阳性样本。2。.本研究获得样本时间滞后,诺如病毒分子流行趋势分析的时效性欠缺3.本研究需要分析诺如病毒重姐,同时排除海合感染情况。4.未进行临床相关的信息巧数据分析。35 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文参考文献1]UdatednorovirusoutbreakmanaementanddiseasereventionuidelinesJ.MMWR[pgpg[]R--ecommRep201160RR3:118.,,()B-ilrenMCristensonBHedlundK0etal.idemioloofNorwalklikehumanlghEP],,,pgycallmareain19Jicivirusesinhositalovrtbreaksofacutegastroenteritisi打化eStockho96.Jp[]〇〇2l-32Infec44:26.a,()[3]WiddowsonMA,SulkaA,BulensSN,etal.Norovirusandfbodbornedisease,UnitedStates,-1991-2000J.E的erInfectDis2005lll:%102.g,,[]()ScalboillnidtllanEGrifinPMAnuloFJeta.FoodrneessacureintheUnied的,,g:q-State—tItsunsedfiedaens.EmernfecDis2刖l17l:1622-pg阴g,,()HofinannBteMBMJAcostofnessandt-steearossesnSaorrisJ.nnualillliadudlifeli口],,quayjye-UnitedStatesdue化14oodbomeathoensJ.JFoodProt2012757:12921302.化fj,pg[]()-6HaikiltVttUidllAJWswoMEPrneKeal.ialsins:化odbomenorovirusoubreaksnte,,g,g[]-Sta2009-2012JMMWRtes.MorbMortalWklRe20146322:491495.,[]yp,,()7NodaMFukudaS,Ni浊ioO.Statisticalanalysisofatackratei打norovirusfoodbome[],--outbreaks口.IntJFoodMicrobiol,2008,122l2):216220.](vanAstenkSiebengaJvande打Wi打aardC,etal.Unsedfiedastroenteritisillnessand巧],jgpgw-deathsintheelderlyassociatedithnoroviruseidemicsJ.Eidemiolo20ll,223:336343.p[]pgy,()9StCKPatelSlildit.Intitaldescritiveandanatcaataonanoutbreakofnorovirusin拓cto打a[],pys200816941-marinecorrecruitdeotParrisIslandSouthCarolinaJ.JInfectDis98:942pp,[],,(),-943942.""Mo-10Fankhauser民l^NoelJSnroeSSetalMolidemioloofNiki.说ulareorwa化levruses[],,,pgy-inoutbreaksofastroenteritsneUnitedStatesJJhfectDis19981786:15711578gii化?.,,([])11FarkasTJianXGuerreroML巧alltdit.Prevaenceandeneiciversofhumancalicivimses,,[],ggyHuCVsJJV1-()inMexicanchildren[.Medirol,2000622:27223.],()[1句Kapl細JE,GaryGW,Baron民C,etal.EpidemiologyofNorwalkgastroenteritisand化eroleof、lkvimsinoutbreaksofacutenonbacteriaastroentertAnnInternMed1982966PtNorwaliis?,,g口](36 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中国疾病预防控制中也公巧卫生硕±学位论文m1、综述诺如病奉与備性疾病孔潮羽1斬森1段招军1110220.中国疾病预防控制中也病毒病预防控制所,北京6一,摘要:诺如病毒是引起全球急性胃肠炎疾病的主要病原体么可通过污染食物在人群中引起大规模胃肠炎暴发,在食源性暴发中占上。引起食源性暴发的食物主要涉及贝类、蔬莱、水果及即食食品等,食品类型不同诺如病毒提取方法也不同,分为蛋白质/脂肪类、碳水化合物类和贝类兰类。大多数食源性诺如病毒暴发都可追溯到食品加工任何环节相关的食品操作人员。本丈从诺如病毒引起食源性暴发、诺如病毒引起的食物污染、诺如病毒在食品中的检测臥及如何预防和控制政及治疗方面进行综述,为食源性诺如病毒疾病的预防控制、风险预警预测等方面提供参考。关键字:诺如病毒;食源性;xian ̄Studyprogressonnorovirusrelatedtofoodbomediseaseskonggya.NationalInstituteForViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,ChinaCorrespondau-_i打gthor:DUANZha〇Jun,E描ail;zhaoJund§126.comAbstrasct:Norovirusis0打eofi曲portantpathogenscausin呂gastroenteritisworldwide,whichisalsothenu怔beroneoffoodbor打eviruseswhichcauseslargeoubreaksbyfoodcontaminationresposibleformorethan50%foodborneoutbreaks.Norovirusfoodborne--outbreaksisassociatedwithshellfishes,vegegatbles,fruitsandreadyt〇eatfoods.Differentfoodtypeshavedifferentvirusextractionmethodswhichcanbeclassified—-intofat/protei打carbohydrate/waterandreadyt〇eatts.Mostfoodbor打eoutbreaks,ypecouldbetrackedtothefoodha打dlersrelatedtoeveryfoodprocessing.I打thisstudywereviewfoodborneoutbreakscausedbyNorovirusfoodcotan扭i打ationbyNorovirus,,作者单位:中国疾病预防控制中也病毒病预防控制所,北京102206江省巧河市人化-ma诺如病毒监测及研究;136712巧巧0Ei作者简介:孔翔羽,男,黑龙,实习研究员,主要从事II,l:kongK.iangYu5@aliyuncomI*"--通讯作者:段招军,研究员,Teh01058900閱8,Fax:010巧卵孤97,Email:zhaound@126.comj40 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文thedetectionofNorovirusinfoodandthepreventio打andcontrolandtreatme打t,earlywarni打gandpredictio打offoodbor打eNorovirusKeywords:Norovirus:Foodbor打e:诺如病毒(NorovirusNoV(仿施),,)是属于杯状病毒科的单链正股RNA病毒一是引起全世界病毒性急性胃肠炎散发和暴发的主要病原体么,全球急性胃肠炎病人中诺如病毒感染率高达18%,感染率仅次于轮状病毒;感染涉及全年龄组人辭,社区和口诊腹湾人群中诺如病毒的检出率高于住院腹泻人群,同时发达国家诺如病毒检出率高于欠发达国家。可与发IW达国家开展轮状病毒疫苗接种之后诺如病毒迅速代替轮状病毒成为最主要的病原有关。1999年W来我国开展的5岁W下儿童病毒性腹泻原体监测结果显示诺如病毒的检出率在。"29]83--邮1126%.38.6%。诺如病毒在成人口诊腹泻病例中检出率为.9.2。胃肠炎暴发监测表iw明结果表明诺如病毒在腹泻暴发人群中检出率为63.2%。该病毒经常在学校、医院、老人院、军队等半封闭环境中主要通过人-人传播而引起大规模暴发58%。据报道的食源性腹泻的暴发--是由诺如病毒引起的。在美国诺如病毒每年引起日70800死亡病例、5600071000住院病例、U"--40万急诊病例和17001900万的口诊病例。诺如病毒潜伏期为口48小时,症状包括腹泻、呕吐、无血便、恶&、腹痛巧低烧,病程不超过48小时,属自限性疾病。1诺如病毒与食源性胃肠炎暴发一诺如病毒在引起全球食源性疾病暴发中排第位,占食源性疾病暴发的50%W上,在非菌90%-性胃肠炎暴发中占W上。20092012年美国CDC食源性暴发监测网络数据显示由诺如病毒008324一引起的暴发有1起,占所有食源性暴发的48%,其中起暴发涉及种食物污染,主要涉及到的食物有绿叶蔬菜(3090、水果(16%、)和贝类水产品(13%)2010年欧盟发生了84起有明显证据的食源性诺如病毒暴发事件,主要涉及到的食物有贝类水产品(25%)、自助a"22-餐食物(.6%)和水果类食物(9.5%)20062008;年日本和英国发生的史上规模最大的W35’1诺如病毒疫情均由生食诺如病毒污染的贝类有关;2012年德国多所学校同时发涉及11000UW病例的诺如病毒感染事件也由冷冻的草舊引起。近年来我国诺如病毒暴发呈上升趋势,2012W6652年广州大学城所学校发生的涉及人的疫情与诺如病毒感染的厨师通过污染食物而引起。2食物污染引起的传播食物可通过几个方式被诺如病毒污染,包括被人的粪便污染、与粪便污染的表面(包括人的手)接触、被啦吐物污染、接触病人出现过的环境和病人产生的气溶胶W及被感染的食物操作者接触。食物加工者在食源性疾病毒传播中是最核也作用,主要是由于有症状的食物加工者在发病41 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文期间排毒W及其在恢复后至少H周内仍持续排毒,无症状感染的食物加工者与感染者有相似水平的排毒量,很容易导致食源性暴发发生。尽管大多数暴发都可追溯到位于食物链终端的食物加工者,,但食品加工人员可W在食品生产过程中的多个巧节污染食物,包括污染食品包装用含有诺如病毒的污水灌概,,使用人和动物粪便做有机肥料而污染食物也可导致进食者发病发?病的巧类养殖人员将呕吐物清理到船下而导致大规模的暴发。诺如病毒是引起食源性疾病最常见的病原体,在蔬菜、水果、贝类和熟食中经常被检测到。化-tot等发现在英格兰和威尔±地区19922000年发生的83起肠病毒引起的食源性暴发中诺如病毒引起的占了13起,另外23起根据临床症狀和流行病学特点分析也认为是诺如病毒引起;UW这83起中有20%是由于食用污染了诺如病毒的蔬菜和水果所引起。发生在欧洲涉及人数多09311006口的40%达人的起诺如病毒暴发的原因主要是食用了从波兰进冷冻草舊。在美国的W食源性疾病被认为和诺如病毒有关联。诺如病毒不会在食品中生长,因此在食物的生产和胆W藏过程中病毒汚染量不会増长,但是诺如病毒很低剂量就可W使人发病。Carter等研究者认为水果和蔬菜在加工之前被灌概水或有机肥料中的诺如病毒污染,,如葡萄木赏,草舊等通W一常被认为是诺如病毒暴发的载体。诺如病毒污染海产品可分为两个途径,是贝壳类生活在被诺如病毒污染的海洋环境,二是除了贝类W外的海产品被感染了诺如病毒的食品操作人员二42"1次污染所致。3食品中诺如病毒的检测食品类型不同一,诺如病毒提取、检测的方法也不同。被检测的食品分为H种不同的类型,第种是碳水化合物或水为基础的食物,包括大多数水果和蔬菜;第二种类型食物主要有脂肪和虽白质组成,:第H种是贝类,由于贝类能够通过消化腺从水中富集和浓缩病毒颗粒,所W检测方法不同于其他食品。对于H种类型食品,主要有四种病毒提取方法:(1)从食物表面洗脱病毒粒子并浓缩;(2)酸吸附食物表面病毒粒子、洗脫并浓缩;(3)不通过洗脱/浓缩步骤而直RNA-接从食品基质中提取病毒;(4)将食品进行蛋白酶K处理后进行病毒提取。洗脱浓缩方--法和酸吸附洗脱浓缩方法均可W应用于H种类型的食品,RNA直接提取方法应用于贝类和脂肪/蛋白质为基础的食品,蛋白酶K方法只应用于贝类食品检测。W目前为止,因此,没有合适的细胞可用于诺如病毒的培养诺如病毒的检测必须赖于分子-PCRr---检测方法,应用最广泛的就是RT和ealtimeRTPCR。大量的realtimeRTPCR用-来检测临床、食物和环境样本,多重藥式RTPCR也用于诺如病毒检测。将免疫技术和分子生-物学结合,通过免疫磁珠分离诺如病毒,RTPCR的方法进行检测再用,获得较高的检测特异42 中国疾病巧防控制中也公共卫生硕±学位论文W性和灵敏度。Park等利用免疫磁性分离法从新鲜草璋中浓缩诺如病毒。免疫磁性分离法和Taqmanrea-ltimeRTPCR结合分离浓缩病毒更好的利于检测污染食品中低拷贝的诺如病毒。免疫磁性分离法的特异性和敏感性取决于抗体特异性、保温培养期、冲洗条件及随后的!^RT寸CR检测水平RT-PCR。免疫磁性分离法最大的好处是使检测体系中标本量大大的减少。分析认为影响病毒提取的决定因素是前期对食物的处理、浓缩W及在样品处理过程中抑制因子去除剂的使用QIAamviralRNA。有研究表明通过前期对样品进行免疫磁性分离法处理后再应用p?MiniKit试剂盒提取核酸是最好的组合方法。贝类中的诺如病毒主要来源于大雨冲刷、洪水或污水处理不当时水中携带的诺如病毒,它伴随贝类的摄食富集到贝类体内,主要集中在贝rea-类的消化道、胃肠腺盲管憩室等部位,目前最灵敏最常用的定量检测方法是ltimePCR。2005年Jothikumar等减少了Kageyama设计的引物中的简并引物,因而提高了反应特异性和"W灵敏度,每次实验能检出低于10个拷贝的病毒颗粒。由于假阴性或假阳性结果的存化质控对照食品诺如病毒检测过程中非常关键。食品检测中应该包括阳性对照一PCR,尽管每步都包括抑制剂的去处,但对的抑制仍可能发生。在开始V-检测时将过程对照加入到待检样品中个可控制整个检测过程。鼠诺如病毒(MN1)、猫杯状病毒(FCV)、基因被修饰的鼠也肌炎病毒(vMC。)和幢菌体(MS2)都可W用来做为过程对照。4预防与控制II"-,在水、食物和环境中可存活24周上缺乏有效的诺如病毒在外环境抵抗力较强,在加诺如病毒的疫苗和人群对其普遍易感,预防和控制诸如病毒暴发和散发都极具挑战性,诺如病一毒暴发往往是从接触受诺如病毒污染的食物或者饮用水的人开始,进而通过人传人方式进步一扩散。追踪调查暴发原因需要把代病例和二代病例分隔开来。同时确定首发病例W及疫情传播和流行的先后次序。暴发蔓延时应对诺如病毒毒株的特殊可变突出区域进行测序监测毒株的进化W及识别与长期传播相关的单个奉株,并在常规性污染食物或水质筛查中对流行株作出评估,阻止诺如病毒暴发扩散也是需要很大努力,例如清理医院、轮船等受污染地点,有些wi时候甚至要把怀疑受病毒污染的水池排空才能减少污染。目前为止最有效的预防就是限制接触受污染的食物和阻断食品操作人员加工人员引起的?传播。严格管理所有食品加工者的个人丑生,建议不要让感染的食品操作人员带病操作加工和销售食物,同时应该严格执行个人卫生规范,切断人传人传播途径W及避免接触受病毒污染的环境是防止暴发的关键举措。增强个人卫生和自我保护意识,搞好净化环境表面的卫生工作,同时建立和健全食源性疾病监测网络,加强对食品中诺如病毒的检测,重点注意食品与饮水卫43 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文生的管理,重视贝类水产品的消毒和检疫,避免生食贝类水产品。5治疗诺如病毒引起的急性胃肠炎属自限性疾病,尚无特异药物治疗,防止水和电解质奈乱、减轻症状、缩短病程是治疗追求的目标。W对症及支持治疗为主的治疗措施主要包括使用抗病毒药物利己韦林、干扰素,粘膜保护剂,益生菌,补锋和补水和维持电解质平衡等措施,抗生素一口OR对诺如病毒感染没有疗效,径度脱水般可用服补液(S)的方法纠正,中至重度脱水则需静脉输液治疗一,补液W及时、快速、适量为原则。由于诺如病毒导致小肠功能受损,般W清W1淡饮食为宜。同时患者应该注意静养W缩短病程、加快治愈。44 ■中国疾病预防控制中如公共卫生硕±学位论文参考文献AhmedSMHallAJobEt.RinsonAealGlobalrevalenceofnorovirusincasesof[,U,,p--astroenteritisttiitliJLtItDis2014148^25730:assemacrevewandmeaanass[.ancenfec.gyy],,()2?,19992005年J.方肇寅谢华萍,吕红霞,等.我国婴幼儿人杯状病毒腹泻研究[病毒学[]]0-报20071:915.,()3GaoYJinMConXetalClinilmllidililf.caandoecuareemoocanaseso,,],gy[pg-tastroen化rsnadusomenna.ednorovirusassociaedsoradicitiiltfrBiigChiJMpgj,y]ro-Vil2011836:10781085.,,()4Ta打打ietaLlinicalcharacteristicsandeneticdiversitof打orovim化si打adultsiGJiMLHC[],,,gy--w她acuteastroenteritisinBeiinChinain20082009J.JMedVirol2014867:12351242.gjg,[],,()5-斩蘇,,20062007.,孙军玲常昭瑞等.中圍年诺如病毒胃肠炎暴发奴其病原学特征分析阴[]〇-中华流行病学杂志,21〇315:5495巧.,()6HallAJ,LomanBA,PaneDC,etal.NorovimsdiseaseintheUnitedStatesJ.EmergInfect[]py[]D-is2013198:!1981205.,,()7a-HllAJsworinleKtal.Vitalsins:foodbomenorovimsoutbreaksUnited,WikME,Pg,e[]g-Sta2009-2012MM49tesJ.WRMorbMortalWklRe20146322:14W,,[]yp,,()B-elliotGLoma打BAAmbertBalaKetal.Theburdenofnorovirusastroenteritis;細[巧,p,y,g--ortantoodbomeandhealthcarereiimflatedmfectionJ,ClinMicrobolInfect2014208:724730.p,[],()巧liimaYTanakaSOhishiH.Multileoutbreaksofastroenteritisdue!:〇asinlestrainof]j,,pggenoteGII/4norovirusinKobeJaan2006;riskfactorsfornorovirussreadi打healthcaregyp,p,pset-insJ〇JInfectDis2008615:419422.g.化[],,()1HuatzMimnochSAranTetalAnorovirusoutbreaka泌ociatedwkhconsumtion0ppC,,Wog,p[]ofNSWoysters:implicationsforualityassurancesstems.CommimDisI打tellqy口]QRe200832l88-:91.p,,()[11]BernardH,FaberM,WilkingH,etal.LargemultistateoutbreakofnorovirusgastroenteritisassocatedwtstrawerriesGerma打2012?EuroSurveiU201419:20719.iihfrozenb,y,口,,]巧)-12CaiWFXitAtitifieHPLuYFeal.neidemioloicalinvesaononabodbomou化reakof,,,[pgg[]打orovirucausedbySydney2012GIL4strain][J],Zho打ghuaLiuXingBingXueZa45 中國疾病预防控制中也公共五生硕女学位论文20-Zhi13348:804807.,,()*-化13BeiDEKohnMAFarleTAetalMultstateoutreas化astroenteitistedg.ibkofacurrac,,y,g[]caUcon-耗taminatedoystersharvestedinLouisiana.JInfectDis2000181Sul2:S381S386.口],,ppl14ButotSPutalazTSa打chezG.Procedureforraidconcentrationanddetectio打ofenteric,,p[]-virusesfromberriesandveetablesJ,AlEnvironMicrobiol2007731:186192.g[]pp,,()加aB民llwooBHeeta.Eofcommonused打tantsorelti,AdPdb^gCWlfficacyldisifecf化[巧,,ynac-JFoodtvatonofcaicvrusonsawberretuceandaoodconacurJiiiliitry,lt,fttsface.[]P-rot2001649:14301434.,,()16CarterMJ.E打tericallin伤ctinviruses:athoenicittransmissionandsin巧canceforfood[]ygpgy,g-andwaterborneinfection?JAlMicrobiol200586:13541380.饥pp,^()17BoxmanILlrJJTeLNetal.Detectionofnorovesslthe,Tibugirusinhelfishin[],,th-NeerlandsItFMbio20061083391396.nJoodicrol:.^],,()18CheesbrouhJSGreenJGallimoreCI巧al.Widesreadenvironmentalcontaminationwith[]g,,,pNorwa化-eHkvirusesNLVdetectedinarolongedhotel0山breakofgastroenteritisJ.Epidemiol()p[]-Infect2000125l:%98.,,()[19]UekiY,Sa打0D,WatanabeT,etal.Noroviruspathwayinwaterenvironmente巧imatedbygeneticanalysisofstrainsfrompatientsofgastroenteritis,sewage,treatedwastewater,riverwaterandos-ters?WaterRes20053918:42714280.y阴,,()[20]ZhengDP,AndoT,Fankhauser民L,etal.Norovirusclassificationandproposedstrain打omenc-latureJ.Virolo200634623口323gy:.[],,()*2-merever犹1ParkYChoYHJeeYetal.Immunomaneticsearationcombinedwithiealti,,,gp[]transcriptasePCRassays抗rdetectionofnorovirusincontaminated仿odJ],ApplEnviron[200874-Microbiol13:42%4230.,,()22K*imJHKimHNLeeKTetalGeneeifilil.xiessonroesnaUbladdercancer:化ecose[],,,ppgen巧csmiartseen拓reara打dadvancedallbladdercancersmaexanoorronoiJgiiliylygypli化eppss,g[]Tumour-Biol200829l;4149.,,()23Brt^aeLUtendaeleMDebevereJ.Evaluatio打ofviialextractionme化ods0打abroadraneof[],y,g---ReadTo-EatodswtreameTrorovrusItectonJInyfbihconventionalandltiRPC民foNiGIdei.tJ[]FoodMcrob〇n--l:1iiU0083201108.,()[24]LeGuyaderFS,Mite化olzerC,HaugarreauI^,etal.Detectionofnorovirusesi打raspberries斗6 中国疾病预防控制中也公共卫生硕古学位论文-associatedwithaastroenteritisoutbreak口?IntJFoodMicrobiol200497:179186.,,g]口)25LeGuaderFLosFAtmar民1-化o>etal.NorwaUcvsseccbindinsterestveyiimi行过igi[],y,,pgyme-tissuesJ.ErIn挺ctDis2006126每31936.[]g,,()[26]康利红,赵紅梅.散发性诺如病毒性胃肠炎临床观察及护理[J].护理研200923151358-360究:1.,,()47 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文2、致谢首先感谢各位评委老师百忙之中参加我的答辩。il值此论文完成之际,向导师段招军教巧致l^崇巧的敬意和衷也的感巧,感谢您这些年来!对我的教诲和关怀您正直诚恳的为人态度、严肃的科学态度,严谨的治学結神,精益求巧。的工作作风,深深地感染和澈励着我,永远是我们的学习榜样特别感谢斩森博壬,作为指导老师,在实验和论文撰写过程中都给予了我悉也的指导和帮助。感谢刘娜、李静欣、章青、李丹地、李煮颖、徐子谦、孙晓曼在论文撰写过程中给予的指导和帮助。感谢张顺先、周永康、谢广成在实验巧论文巧写过程中给予的指导和帮助?感谢腹泻室所有的同事、同学对我的巧助,感谢各省市疾控中也和哨点监拥医院工作人员辛勤的劳动和对本研究的支持?!最后,巧谢我的家人的支持和巧#48 中国疾巧预防控制中也公共玉生硕±学位论文3、个人简历基本情况姓名!孔翔羽性别S男出生日期:198208民族:汉籍赏:黑龙江省谓娜学习经历-2003..09200807本科哈尔滨医科大学临床医学-2008.072015.06病奉舰工(病毒性腹泻室)-2013..0320巧06在职研究生公共卫生49 中国疾病预防控制中也公共卫生硕±学位论文-12G—I.4图诺如病毒I4型进化树聚合酶E、进化树—123S1007/03/2012/FuJ/CHN/eiMJI12141008/01/2012/hX^/CHN/6{4San|J-I1243tO15/O2/2012/HuNan/CHN/GI4—I13511033/01/之OIS/SiCh/CMN/GIW-:l3131044/O2/2O13yHeBei/CHN/SI4J—113131053/0/乙013/aCHN/C3ll43HBWQII.4/OHvriantonoooaL1243oi0/01。〇1a/HNa/CN/GIW1unH—131S122^02/2013/Nil/l/CHN/GII4J0eS—AB291S4aKb0M/2006"P<3化4_oe——2511221/09/2012^SiCh/CHN/OI(412111〇e3/04/2012/BeiJ/CHN/6IME511220/08/2012/S-iCh/CHN/GII4AY502023ParttHI"/2002/US〇".々_mnaon_,A_I巨F187497NZ327/20Q6/NZlC3iM_^pIS320DQ078801ta/040/ALI<3l.4—Hunr_211*1I/〇e^2012/BlJ/CHN/3U411OeI1111/0//e2^10S32012BiaCMN/GI4I12^1042/03/20//HN/GJI412HuNanC」l084I143/05/2012/HuNan/CHN/G114_J31J ̄I—121S107S/03/之012/N<M/atN/eiMeI?w"iMTiBvcur__Oli.4/MOtenrirtL/Gn12511070/03/2012/SICh/CHN4f-GU44&3aS_N?w_OHMn?1805/2009/USA^QI.441221062/02/2012/J/342iUn/CHIMC(lI-* ̄123S1009/03/2012/FJ/CHN/GUIM|j^5/0012J/CMIM/OII412310033/2/FU^AY03Be〇0VA98387198I4_/8_OI这WHu/OB,Sg3/包I.P4/Sri,tol/IIwX65S7Loltel?i包148_n?<一rua—1r巨U1874371H/501734/2003yjRN/GI.12.|u-I-*GQ8564eeH7/2tVBei/56037/200/CHNGI.1pij ̄ ̄2II/u/JP/00S/Gl./Ski/04179/OtlP12GH2iP1aalj^AB22092^saKai/041T9/2005/JP_eii.4I/US/Gl/Hu1971/Q比997I/T,GIHu/OR/GI.户J/巨3/GIIPJIOII/H/JP/007/0化R/OC07138/G"P,|_u2eIJX?599〇e—Sydn?y\NSWOSi4\2012\AU_G".4厂12442015/10/2012/GuagD/CHN/GMnI14eS1057/04/2014/XW/C?1N/GI4Ir—31O18/O3/2014/FuJ/CHMrQI4145|?X144S12SO/O9/2O14/O^CHN/GIMuan04221151/0S/20i4/JiU/CH/OI4£1nNI<Ee/CH-143112W03/201?/Hr<VeiM2ar13351011/01/2013/HBi/CMWGIMua(一//133"035/02/2013/ShamaHCHNGI41334"O0/O4/2O13/HUWCMN/GI4Ctl4./Svcin0v20tZvariant—14S31002/01/203l14/YunlM/CHN/<l43511043/01/2013/运ICh/CHWGIM11434之08e/08/2014/AnHul/GHN/GH41323104S/08/2013/HB/CHN/OII4aerHs|G412151283/1G/2012/N?tlS/l/Ct/II—14151058/04/2014/NeiM/CHN/OIMI-B^/CHN141320〇/01/2014/H/<3l4Hi|el<i4431011/01/2014/HuNan/CHN/GI41L14S1i〇i9/〇3/2014/SiCIVCHN/包II4IQWHuunePCGIn/IW20〇e/0化RnVPWIPnOWHu/AU"ea3/G".PWQ〇u/〇"Plbum_V"lay。j?s000AI^H/Jf/2004/{./Srl/GIIPaGueiPa20IIAB1904S7.1SN2000JA/2000AIP/G".3|*Gi76cnoMtl/0"Pl/Hu/US/i,/C3化P/Swoun,ncIGWHIu/JP/,997/Gll.Phy〇C970077C3"Ph一巨U92</,38巧Hu/口unebPCS2/2007/lnd?aaH.3bj*R〇1OH/HU/FR/2004/OII.P2"口onL如ic?〇S73/0"P21一1。072241H/OHN3918e/OCO<4/GI3bIf巨.2|u.'AB3SS43 ̄577/2004/US即r?/TCH04/<3".3bXMI口S<3H///1998/G./MOH/G"口5HuHUlIIQWHu/OE/2000/GH.P16/Neu?tre"tz2e〇/0"口ieOn/H"04/G/。P2/M*lk,h/<3P2uB9".am"一J0"Hu1/FR/19d9/G".口"SeS/OIPfVCAlt/H/19ei/Oli.P3m>rnt/GHP3OiooIGuFR2004/OIP13/Brt87CV。"口13H/H//.anconIJAB98321820,4/G化R17/KW323/J口_OH/Po/US/?)03/GI.Pie/OHQW,01/8"口18IOWHokBkAJFV2003/OI.P之2/Hki133/6IIP2之Uo_I-eI■IGl/H/CN/200/0"P/SSeS,/GlPlu7.nBWngn*—?G?US/ie97/0"IVI.P"/Sw9,8/G"P11IJAOH/HIP/2002/6"P8/S"2S/G8u.,,m、V"口GIUHu/JP/1096/C3化口k/0096065'<3"口k——■HGH/JP/L/u20Q2/ail.P6/Sti",ma_U16/QII口8rIGII/HU/JP/2002/OII.P7/S,ltam、U4/G"口7IMeOll/Hu/J口/20〇e/包化P1S/Hlro,ma6/e"P1。IIIOWH/OE/2005/GU0II.P2(kLW?n2e>C3"PuV?ver72oo.s50 中阐疾病预防控制中必公共卫生硕i-学位论文-13诺如病毒G-團II.4型进化抓衣壳区14371132/11/2014/ShanD/CHN/C3l14I14SS1060/04/之01々/XJnJ/CHNI/GU*如I141S101a/0220es/14/NiM/C:Hrl/GII414231244/0S/2014/HaErBCHN//GII413431100/04/2013/HuNan/CMNGW/I-14-SI1019/03/201s-4/SiCh/CH|l/GII41331100S/01/2013/ShangH/CHM/C5n4GII/Hu/AU/2012/C5ll.4/Sdne/QM4yy136S11S1/06/2013/XinJ/CHIsJ/C3ll4—13651172/06/3013/X3nJ/CHM/Qn4f13342011/02/之013/AnHui/CHN/GU413530A32/04/2014/FuJ/CHN/G1I4S乙2vvinev01vwiaiit-ee13131375/12/2013/H巨WC:HN/GII4-n3乙31018/05/2013H百巨rB//CHN/CSIW13113011/01/乙013/BeiJ/GHN<3M厂/4131130之0/0之2013Bel(//J/CHM/3n4T31S100S/012013/tsleiM/CHWC3/l414131032/01/2014/H?Bei/CHN/<3114142之1075/02/2014/jmr?/C:MN/C3n4j 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