prrsv的gp5和nsp7原核表达及elisa检测方法的建立

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分类号：S854.4单位代码：10193密级：公开学号：2012618硕士学位论文PRRSV的GP5和Nsp7原核表达及ELISA检测方法的建立ProkaryoticexpressionofGP5andNsp7ofPRRSVandestablishanindirectELISAbasedonexpressionproduce作者姓名：杨欢学位类别：农学硕士专业名称：临床兽医学研究方向：现代兽医临床诊疗新技术指导教师：崔焕忠副教授、张辉高级实验员所在学院：动物科学技术学院2015年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是一种病毒性传染病，它的传播给全球养猪业带来的经济损失是不可估量的。如何有效的预防和治疗该病是各国研究的热点，比较有效的检测方法包括RT-PCR、ELISA检测等，ELISA检测快速、有效的优点使其能够广泛的应用。接种灭活疫苗是我国预防该病的主要方法，但是单一的结构蛋白或单一的非结构蛋白的ELISA检测不能够判断抗体的产生是由灭活疫苗引起还是感染野毒引起的，这就会影响该病的检测结果，如何建立更加准确、有效的ELISA检测方法是目前的当务之急。GP5蛋白是检测PRRSV抗体的主要靶蛋白，Nsp7基因在非结构蛋白中相对保守，不同毒株之间差异较小，它的这个特点可以使其在检测不同毒株刺激机体产生的抗体时保持较高的特异性。接种灭活疫苗和感染PRRSV都可以刺激机体产生针对结构蛋白的抗体，所以只用结构蛋白作检测抗原会影响检测结果的准确性。本研究在单一结构蛋白ELISA检测的基础上增加一种非结构蛋白以达到能准确判断抗体来源的ELISA检测方法，利用PCR技术，从PRRSV分离株中扩增出GP5和Nsp7基因，将目的基因与表达载体pET28a连接，将构建的重组表达载体pET28a-GP5、pET28a-Nsp7转化到表达菌株BL21（DE3）中，测序鉴定。经IPTG诱导表达，表达产物再进行SDS-PAGE分析。结果表明成功表达了GP5蛋白和Nsp7蛋白，表达蛋白经HisTrapFF纯化柱纯化，然后进行Westernblot分析，证明表达的重组蛋白均具有良好的抗原性。优化ELISA检测的各种条件，成功建立GP5-Nsp7-ELISA检测方法。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；GP5蛋白；Nsp7蛋白；原核表达；ELISAI AbstractTheoutbreakofPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)bringhugeeconomiclossesoftheglobal.It’sahottopicabouthowtopreventionandtreatmentPRRSeffectively,themeasuresofRT-PCR;ELISAweremoreeffectinthedetectionofPRRSV,ELISAtestwasusedintensivelybecauseofrapidityandeffectively.ThepreventionofPRRSinourcountrywasmainlyrelyontheinjectionofinactivatedvaccine,butsinglestructuralproteinorsinglenon-structuralproteincouldnotbeusedforthedifferentiationofpost-infectionandpost-vaccinationantibodiesinanimalsvaccinatedwithinactivatedvaccine,itmadeatroubleinthedetectionofPRRS,newELISAtestwasurgentinneed.Theenvelopeglycoprotein(GP5)wasthemaintargetproteininthedetectionofPRRSVantigen,thenon-structuralprotein7(Nsp7)wascodedbytherelativelyconservedregionoftheviralgenomeandhavehighsimilarityindifferentstrains,couldbeusedasanantigentoidentifywheredidantibodycome.ThehostcouldinduceantibodytostructuralproteinswheninjectedwithinactivatedvaccineandinfectedwithPRRSV,therefore,itwasnotsuitablytousestructuralproteinsasantigensonly.Thegoalofthisworkistousenon-structuralproteinasanantigeninanindirectELISAtestonthebaseofstructuralproteintoidentifyPRRSVeffectively.GP5andNsp7wereamplifiedfromisolatestrainsofPRRSVbyPCR,connectedtargetgenewithpET28a,transformedpET28a-GP5,pET28a-Nsp7intoBL21（DE3）respectively,thenidentifiedthembysequenceanalysis.InducedexpressionwithIPTG,theexpressionproductswereidentifiedbySDS-PAGE.TheresultshowsthatGP5andNsp7wereexpressedsuccessfully,analyzedbywesternblotshowedthattherecombinantproteinshavegoodsensitivityandspecificity.TheGP5-Nsp7-ELISAwasestablishedsuccessfully,aftertermsandconditionswereoptimized.Keywords：PRRSV；GP5；Nsp7；prokaryoticexpression；ELISAII 目录前言...............................................................1第一篇文献综述....................................................2第一章猪繁殖与呼吸综合征概述......................................21.1PRRSV概述....................................................21.2病原学........................................................21.3PRRSV的基因结构与功能........................................31.4PRRSV结构蛋白GP5的编码及功能................................31.5PRRSV非结构蛋白Nsp7的编码及功能.............................41.6PRRSV在猪呼吸道的免疫发病机理................................51.7PRRSV的检测方法..............................................8第二篇研究内容...................................................12第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达.........................121实验材料........................................................121.1病毒和菌株...................................................121.2主要仪器和设备...............................................121.3载体及试剂盒.................................................121.4主要试剂的配制...............................................132实验方法........................................................142.1目的基因的扩增及鉴定.........................................142.2重组质粒pMD18-T-GP5和pMD18-T-Nsp7的构建....................152.3重组质粒pET28a-GP5和pET28a-Nsp7的构建.....................182.4目的蛋白的诱导表达...........................................182.5目的蛋白的纯化...............................................203结果............................................................213.1PRRSVGP5和Nsp7基因的扩增及鉴定............................213.2重组质粒pMD18-T-GP5和pMD18-T-Nsp7的筛选与鉴定.............223.3目的蛋白的诱导表达...........................................233.4重组蛋白的纯化及Westernblot................................254讨论............................................................265小结.............................................................27第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立...........281实验材料........................................................281.1主要溶液的配制...............................................282方法............................................................282.1间接ELISA检测方法的建立及优化...............................283结果............................................................303.1抗原包被浓度、血清稀释倍数的优化.............................303.2抗原包被时间的选择...........................................313.3封闭条件的优化...............................................31III 3.4血清反应时间的优化...........................................313.5酶标二抗工作条件的优化.......................................323.6特异性试验...................................................333.7间接ELISA检测方法的建立.....................................334讨论............................................................335小结............................................................34结论..........................................................35参考文献..........................................................36作者简介..........................................................42致谢..........................................................43IV 吉林农业大学硕士学位论文前言前言PRRS的防治不仅是我国养猪业也是全球养猪业面临的巨大挑战，如何有效的预防和控制该病已经越来越受到重视。由于弱毒疫苗存在毒力返强的潜在危害，我国对PRRSV的预防主要依靠灭活疫苗的接种，疫苗接种后抗体水平的检测以及抗体的来源的鉴定对疫苗接种的效果和是否已经感染有重要意义。PRRS的诊断对于该病的预防和控制至关重要，对该病有效的检测对防治PRRS来说是重中之重。目前比较常用的检测主要是分子生物学检测和ELISA检测，由于分子生物学检测对仪器设备和人员的要求较高，并且耗时，不适合大规模的检测，难以在基层和现场的检测中使用。目前商品化的PRRSV抗体检测试剂盒是美国的IDEXXELISA试剂盒，该产品价格较高，具有较高敏感性和特异性的同时，也存在假阳性的缺点。在我国PRRS的预防主要是接种灭活疫苗，这就给疾病的检测造成了干扰，在抗体检测中，不能够判断抗体的产生是由接种疫苗引起的还有由于病毒感染引起的。有研究表明疫苗接种后检测的抗体主要针对病毒的结构蛋白，病毒感染后的抗体除了针对结构蛋白外还针对病毒的非结构蛋白，这就为检测PRRS提供了一种新的思路。近年来基于单一蛋白作为检测抗原的间接ELISA检测方法有很多，虽然在PRRSV的检测方面起到一些作用，但仍然存在着一些问题。本研究的目的在于：利用RT-PCR技术从PRRSV中扩增出GP5和Nsp7基因，构建原核重组表达载体pET28a-GP5和pET28a-Nsp7，并将表达载体转化到BL21（DE3）中，经过诱导表达后，再将表达的目的蛋白进行纯化。将纯化后的蛋白作为检测抗原，用来检测抗体的产生是由灭活疫苗接种引起的还是由病毒感染引起的。该方法的建立弥补了单一结构蛋白或单一非结构蛋白在检测PRRSV抗体的不足，能够判断抗体的来源，对疾病的预防和治疗有指导意义。1 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述第一篇文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征概述1.1PRRSV概述猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的，主要引起怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍疾病，仔猪呼吸障碍的传染病[1]。该病1987年首次爆发于美国，随后在世界范围内传播。由于对该病了解的不够全面，称该病为猪神秘病（MysterySwineDisease，MSD），病猪在发病过程中会出现耳朵发绀的症状，故又称为蓝耳病（BlueEarDisease）。1991年欧洲分离出PRRS的病原体PRRSV，并命名为莱利斯塔得病毒（Lelystadvirus），美国随后分离出PRRSV，命为VR-2332。通过核酸序列比较将欧洲和北美分离出的PRRSV分为称为Ⅰ型和Ⅱ型[2]。虽然Ⅰ型和Ⅱ型病毒同时出现并且表现出相似的临床表现，但在核酸水平两者仅有70%的同一性[3]。郭宝清等在1996年在我国首次分离到该病毒，随后在各地均有该病的发生，经鉴定多为北美型，也有部分欧洲型，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）的出现和流行，使该病变得更加复杂，也更加的难以控制。1.2病原学PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，是折叠的、单股正链RNA病毒；大小约为15.4kb，有9个开放阅读框（OpenReadingFrame，ORF），由核酸蛋白（N蛋白）聚合物构成的囊膜包裹在病毒基因组周围，病毒粒子的表面则由通过二硫键与基质（M）蛋白连接的糖蛋白（GP5）占据[4]。病毒核衣壳的直径在30-50nm之间，电镜下的病毒粒子呈二十面体对称的球形，病毒表面覆盖纤突。PRRSV的热稳定性差，在56℃下保持45min，病毒即可失去活性[6,7]。PRRSV的传染能力受pH值得影响较大，ph在6.5-7.5时PRRSV才能保持稳定。自然分离到的PRRSV不具备血凝活性，获得血凝活性需用吐温-80和乙醚处理，但是这种活性又受到PRRSV特异性抗血清的抑制[8]。PRRSV具有抗体依赖性增强作用（ADE），PRRSV特异性的母源抗体或者疫苗抗体能够使病毒更易于侵入靶细胞，从而导致感染增强。PRRSV对巨噬细胞（PAM）有亲嗜性[9]，病毒能够在2 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述肺巨噬细胞内大量复制，影响宿主的免疫系统，导致宿主的免疫功能下降，继发感染随之而来或者加速其它疾病的进程，这也是该病危害严重的原因之一。PRRSV能够逃避宿主免疫系统的监测，持续感染引起宿主长时间的病毒血症，并且它的抗原性变异较快的特点[10,11]，也增加了该病在免疫预防上的难度。1.3PRRSV的基因结构与功能PRRSV基因组包括9个重叠的开放阅读框（OpenReadingFrame）：1a、1b、2a、2b、3~7。其中ORF1a和ORF1b占整个基因组的80%，这两个阅读框编码13个非结构蛋白（NonstructuralProtein，Nsp），对PRRSV的复制起重要作用[12-15]。对非结构蛋白的研究越来越深入和全面，已经探明Nsp9有RNA聚合酶功能，有两个非结构蛋白具有蛋白水解酶活性，包括Nsp4和Nsp1α，Nsp10有解旋酶功能，Nsp11具有核糖核酸内切酶的功能[16-19]；而Nsp1α/β，Nsp2，Nsp4，Nsp7，和Nsp11在机体免疫应答方面的研究较多。研究显示Nsp1、Nsp2和Nsp7均具有较高抗体应答水平，其中Nsp7抗体水平能维持较长时间[20]。OFR2-7编码PRRSV病毒的结构蛋白，核蛋白N、基质蛋白M和囊膜糖蛋白GP5是病毒的三个主要结构蛋白，其中GP2、GP3和GP4，属于次要结构蛋白，它们与PRRSV囊膜有关[21,22]。1.4PRRSV结构蛋白GP5的编码及功能GP5蛋白是病毒中变异最大、功能最复杂的蛋白，作为PRRSV三个主要结构蛋白之一，它能在猪体内引起抗病毒中和抗体反应[23]。从感染细胞分离出的病毒中，GP5和膜基质蛋白M以二聚体的形式存在，它们之间以二硫键相连接。M蛋白能够被猪的T淋巴细胞识别，M蛋白和GP5在病毒的感染和组装中起着重要作用。N蛋白是第三个主要的结构蛋白，含量较少，占病毒蛋白总量的20%-40%，N蛋白抗体主要产生在PRRSV感染早期[24]。GP5是一种糖基化蛋白，由PRRSV的ORF5基因翻译，分子量大约为25KDa，它的表面有四个糖基化位点，有6个诱导机体产生特异性中和抗体的抗原决定簇，产生的这些抗体无论是在体内还是体外都能中和病毒感染[25,26]。GP5蛋白的内部有一段可能与锚定作用有关的疏水区域。GP5的氨基酸序列在北美洲型和欧洲型的编码同源性仅在51-55%之间，GP5的N末端胞外域含有病毒中和表位和参与病毒中和的表位[27]。欧洲型分离株GP5的C羧基段发现一个免疫显性表位（170-201aa或178-199），但它的识别不够精确。在北美洲型分离株中发现了三个表位（1-15aa、31-45aa和187-200aa）[29-31]。GP5蛋白能够参与机体的体液免疫和细胞免疫，普遍认为GP5具有较强的抗原3 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述性和反应原性，并且已经证明GP5抗体具有病毒中和活性。GP5蛋白胞外域拥有两个保守的N端糖基化位点，这两个位点位于Ⅱ型病毒的N44和N51，Ⅰ型病毒的N46和N53[32,33]。另外，天冬氨酸末端/富丝氨酸区域位于氨基酸30和38，有一个数量可变的蛋白N糖基化位点的小片段。根据病毒的分离，胞外域末端N位点的数量在0-3之间。N位点的数量在在动脉炎病毒属中的作用首先是在感染LDV小鼠VP-3上的N糖基化位点数量的变化上表现出来的[34]。在N45和N52的保守位点，LDV上VP-3与PRRSV的GP5有着相似的结构，这两个位点的保存与抵御中和抗体反应和持续性感染有关。与此相反，某一噬神经结构、自然爆发的LDV毒株缺少N末端和N45糖基化位点[35]。这两个位点根据功能的不同分别命名为表位A和表位B。表位A在PRRSV感染的早期能够识别猪血清中的非中和抗体，不能识别血清内的中和抗体和GP5中和抗体，而表位B可以识别[36]。诱导产生的GP5抗体上，能减弱或屏蔽表位B的表位A占主导，使表位B不能产生相应的免疫应答反应。在感染PRRSV的过程中，表位A能识别的非中和抗体的产生可以延缓表位B能识别的中和抗体的产生，这就是表位A对表位B的覆盖效应。GP5蛋白诱导产生中和抗体的时间虽然较晚，但是具有较强的中和活性，因此常作为新型疫苗的靶蛋白。因为表位A对表位B的覆盖效应，在构建疫苗时并不采用ORF5的全基因。研究表明经过修饰的DNA疫苗能够诱导机体产生更强的免疫应答和更高的中和抗体水平[37,38]。GP5的N聚糖保护壳的特异性功能已经通过传染性cDNA克隆的反向遗传学得到证实[39]。重组病毒由GP5上不同的N34，N44，N51突变组成，研究表明缺乏N44的病毒在培养时无法生长，表明天冬酰胺或者多聚糖对病毒来说是必需的。N34和N51糖基化位点的缺失会提高缺失株对缺失株感染猪产生的抗体中和反应的敏感性。用但缺失或双缺失N34和N51糖基化位点的病毒感染猪，能够诱导机体产生更强的抗体中和反应[40]。多糖抗抗体作用与37-45之间保守的B细胞表位蛋白有关。1.5PRRSV非结构蛋白Nsp7的编码及功能Nsp7（PRRSVⅠ型中长度269个氨基酸，Ⅱ型中长度为259个氨基酸）与Nsp6和Nsp8相邻，这两个序列可能与Nsp7功能的调节有关。Nsp7能被Nsp4蛋白酶从内部裂解成Nsp7α和Nsp7β两部分。PRRSV感染宿主时，机体会产生较高滴度的非结构蛋白特异性抗体，特别是针对Nsp1α、Nsp1β、Nsp2和Nsp7[41]。因此这些蛋白可以用来鉴定抗体的产生是由感染后引起的还是由接种疫苗后引起的。然而目前对包括Nsp7在内的非结构蛋白的了解还不全面，依然不清楚它们在病毒复制中起什么作用。Manolaridis等利用核磁共振发现EAV的Nsp7α溶4 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述液结构中有一个折叠。结构反向遗传学技术研究表明Nsp7对病毒RNA综合体非常重要。Nsp7蛋白普遍被认为是PRRSV的主要毒力蛋白，Nsp7抗体水平能维持较长时间，较高水平，说明它在病毒感染期间持续存在。通过不同毒株的Nsp7基因序列的分析表明，Nsp7序列相对保守，Ⅰ型中基因同源率达到96.7%-97.4%，Ⅱ型中的同源率可达84.9%-100%，Ⅰ型和Ⅱ型之间的同源率可以达到45%[42]，它的高度保守对维持病毒的毒力具有重要意义。1.6PRRSV在猪呼吸道的免疫发病机理1.6.1肺部PRRSV的防御体系PRRSV损伤呼吸道的假复层上皮细胞，破坏黏膜纤毛转运系统，阻碍微生物从呼吸系统排出。猪肺泡巨噬细胞（PAMs）是PRRSV复制的主要靶细胞，主要负责吞噬肺泡中的微生物。PRRSV在PAMs中复制，主要破坏细胞的基本功能，包括吞噬作用、抗原递呈作用和分泌细胞因子[43]。PRRSV引起PAMs的坏死或凋亡，也会引起肺和淋巴器官中淋巴细胞和巨噬细胞的凋亡，降低宿主的免疫应答反应[44]。提高猪对继发感染敏感性的因素包括PRRSV的呼吸毒性和在淋巴器官（主要是扁桃体和淋巴结）停留（≥25天）的能力[45]。这些特性受PRRSV基因的抗原性和毒性，以及宿主的遗传背景的影响。PRRSV-2的呼吸毒性比PRRSV-1高，但二者引起的系统临床症状，病毒位置和病毒分布没有明显差异。然而，无论是HP-PRRSV-1还是HP-PRRSV-2，都能引起更多的临床症状，也会损伤肺和加快病毒复制[46]。1.6.2巨噬细胞对PRRSV的作用PAMs、肺间质巨噬细胞、肺血管内巨噬细胞（PIMs）组成了肺的单核巨噬细胞系统。PAMs在肺泡间隙中自由移动，并在间隙吞噬侵入的粒子。PIMs存在于肺毛细血管，粘附在内皮细胞上，可清除外来粒子并能移动到损伤的位置。PRRSV对PAMs具有亲噬性，尽管病毒也可在其他的巨噬细胞亚群复制，但PAMs是PRRSV复制主要的靶细胞。PRRSV也能在单核细胞和髓源性树突状细胞内复制[47]。硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素和CD163是PRRSV附着位点，病毒脱壳的主要表面受体。实验表明PRRSV在PAMs和PIMs内的增殖，会影响PAMs的杀菌能力。由于PIMs的主要功能是清除血液中的细菌，病毒在PAMs和PIMs的复制可能引起肺部继发病毒感染或细菌病原体的定殖，也会引起血源性细菌的传播。PRRSV对PAMs的靶向性要强于对膈巨噬细胞（PIMs和间质巨噬细胞）的5 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述靶向性[48]。虽然PRRSV主要在PAMs进行复制，但促炎细胞因子主要由膈巨噬细胞分泌，这表明PAMs和膈巨噬细胞在PRRS中起着不同的作用。PAMs的主要功能是作为微生物入侵吞噬防御体系的第一道防线，膈巨噬细胞分泌的细胞因子能帮助膈巨噬细胞调节局部炎症和免疫反应。感染PRRSV的PAMs的吞噬作用会受到唾液酸黏附素的抑制[49]。1.6.3PRRSV与继发呼吸道感染的免疫应答调节PRRSV能提高宿主对一些病毒和呼吸道病原微生物的敏感性，引起严重的临床症状和肺组织损伤。PRRSV和猪流感病毒、猪呼吸道冠状病毒或PCV2的并发感染非常常见，并发感染的猪比单独感染PRRSV的猪呈现的临床症状更加严重，生长速度更加迟缓[50]。在PRRSV和PRCV双重感染的猪体内，肺脏先天免疫应答的抑制，特别是IFN-α分泌的减少，引起自然杀伤细胞（NK）介导的细胞毒性作用的降低。获得性免疫应答的抑制，会加速PAMs细胞凋亡，IL-6和IL-10的浓度也因此而升高[51]。感染PRRSV猪的先天免疫调节会引起部分NK细胞毒性作用的减弱[52]。NK细胞的功能调节受血浆中IL-4，IL-10和IL-2浓度的影响，这些细胞因子在调节宿主的免疫反应中起到一定作用。调节性T细胞可以由PRRSV-2诱导产生，PRRSV-1则不能，它能够抑制宿主的免疫应答[53]。尽管PRRSV-2可增加T细胞的含量，但它在体内对免疫应答的影响还不清楚。PRRSV感染猪对继发感染病原微生物的敏感性与CD14的上调和脂多糖（LPS）结合蛋白（LBP）息息相关，它们在LPS的识别和信号转导上相互协同。这些分子在肺部表达的增加，能够提高肺脏对继发病原微生物感染的敏感性。在感染PRRSV的膈巨噬细胞和PAMs内CD14有所上升，CD14的增加很可能是由渗透到肺间隙的CD14阳性单核细胞引起的，这些单核细胞会分化为膈巨噬细胞。PRRSV和细菌内毒素协同作用加重感染巨噬细胞的炎症反应[54]。在感染PRRSV猪的膈巨噬细胞中，促炎细胞因子的表达量有升高趋势[55]。这些发现表明膈巨噬细胞通过上调CD14和激活细胞因子级联反应在PRRS继发感染病原微生物免疫发病机理中发挥一定作用。1.6.4APPs在PRRS中的作用急性时相反应蛋白（APPs）在急性期反应产生，主要由肝细胞合成，对促炎细胞因子产生应答[56]。根据APPs在急性期反应在血清中的浓度是升高还是降低，可将其分为阳性和阴性两类。猪体内主要的APPs包括结合珠蛋白（Hp）、C反应蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A（SAA）和猪主要急性蛋白（pig-MAP）。APPs诱导促炎性反应和发热，分泌过多也可起到抗炎作用[57]。在PRRS中，血清中促炎细胞因子的浓度没有显著的变化，这可能是PRRSV6 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述逃避宿主免疫反应的一种方式，能够使肝细胞的活化受到抑制，诱导一个高效的急性期反应。在PRRS的早期分泌Hp和pig-MAP，然而血清中CRP和SAA出现较晚并呈不同程度增加。CRP参与补体激活反应和变形，可诱导巨噬细胞产生细胞因子[58]。SAA具有单核细胞、T细胞及中性粒细胞的趋化性。CRP和SAA的增多可降低感染PRRSV猪的早期免疫反应。Hp通过复杂的相互作用和一系列感受器来调节免疫反应。实验室感染PRRSV后，血清中Hp的浓度有所增加，同时IL-6和TNF-α的分泌增多[59]。Hp与PRRSV的受体CD163相互作用，能增加抗炎细胞因子的分泌。CD163分子是清道夫受体蛋白家族中的一员，位于细胞表面，可与众多配体分子结合[60]，能够清除血液循环中的血红蛋白－结合珠蛋白复合体，减少细菌性病原体对血红蛋白的需求和氧化应激。Hp通过调节免疫应答和诱导抗炎细胞因子（如IL-10）在PRRS的发病机制中起一定作用。在感染PRRSV的猪中，用唾液样本和肉汁样本替代血清来测量和监测APPs。因而检测口腔粘液样本可能也是一种可靠、经济的监测PRRSV的方法。1.6.5PRRS中抗炎细胞因子的分泌与其他病毒引起的猪呼吸系统疾病相比，仅PRRSV能诱导抗炎细胞因子的分泌。感染PRRSV-1和PRRSV-2的猪在mRNA和蛋白水平上抗炎细胞因子的分泌都较低[60]。这可能与在实验室条件下感染PRRSV产生的呼吸道和系统性临床症状轻微、不发热和未呈现严重的间质性肺炎有密切关系。PRRSV毒株的毒力、临床症状的严重程度与促炎细胞因子的分泌存在某种关系。感染HP-PRRSV的猪表现出食欲废绝和严重的呼吸系统症状，与传统的PRRSV株相比，它导致严重的间质性肺炎和肺部IL-1α分泌升高。猪肺部在其他呼吸道疾病时仅能有效激活炎性反应，而血清中促炎细胞因子的浓度没有本质性的变化。感染PRRSV-1的猪肺部IL-1α、IL-6和TNF-α分泌的增多与间质性肺炎的发展息息相关。如上所述，PRRSV能够抑制宿主的免疫反应。PRRSV抗原的表达与猪肺部调节性细胞因子（如IL-10，转化生长因子(TGF）β)的分泌有关[61]。血清中促炎细胞因子浓度没有本质性改变，这可能是PRRSV逃避宿主免疫反应的一种方式。在感染PRSSV猪的淋巴器官中促炎细胞因子的分泌量存在差异。在纵膈淋巴结TNF-α和IL-1α的分泌量存在显著差异，在扁桃体和咽后淋巴结这些细胞因子分泌量的增加是有限的[62]。1.6.6PRRS中的促炎性和抗炎性反应TNF-α在炎症反应中起着重要作用，这些细胞因子可能有抗病毒作用，保护细胞免受病毒感染或者通过IFN独立机制增强对被病毒感染细胞的选择清除能7 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述力。猪的重组TNF-α能抑制PRRSV的复制，感染PRRSV的PAMs中TNF-α的分泌量减少。大多数PRRSV毒株对TNF-α的诱导作用较弱，通过抑制胞外信号调节激酶（ERK）信号通路来减少TNF-α的分泌；这种机制可能会影响HP-PRRSV的毒性。研究表明NSP1α和NSP1β的特定氨基酸残基会影响TNF-α启动子的活性，替换这些特定的氨基酸残基是生产PRRSV弱毒疫苗的一种潜在途径[63]。实验室感染某些PRRSV所引起的限制TNF-α分泌可能是这些毒株抑制宿主免疫应答，阻止病毒被清除的机理。IL-10是由T细胞、B细胞、树突状细胞（DCs）和单核细胞巨噬细胞等多种细胞合成的一种重要的免疫调节因子。IL-10能抑制多种细胞因子的合成，故被称为“细胞因子合成的抑制因子”[64]。在某些感染PRRSV病例中IL-10在抑制或平衡IFN-γ反应、限制PRRSV复制方面起着作用。因此，IL-10以相同的方式抑制IFN-γ的分泌，也可能抑制感染PRRSV猪的促炎症反应。在感染PRRSV猪的肺部，PRRSV抗原的表达和调节因子的分泌有密切的关系，但在淋巴器官没有发现这种关系。基于这些发现提出了一些假说，在其他免疫调节中，肺实质的细胞修复受IL-10和/或TGF-β的调节。另一个假说是说调节细胞因子能够在肺部的炎症反应中起关键性作用主要是通过减少炎症细胞的渗透和增殖来完成的[65]。IL-10主要由膈巨噬细胞分泌，PAMs和其他细胞分泌的较少。TGF-β则主要由PAMs分泌，膈巨噬细胞分泌的较少。肺巨噬细胞不同亚群分泌的调节因子可减弱PAMs和PIMs的杀菌作用，也会抑制膈巨噬细胞诱导宿主局部免疫反应。对于一些PRRSV-1毒株，TGF-β在记忆反应时产生，在同源再感染时表现的更显著，这表明T细胞克隆的TGF-β产生时期和PRRSV株有关。促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的不平衡可以调节CD163的分泌，CD163是PRRSV侵入时所需受体复合体的一部分。IL-10和IL-6能促进CD163的分泌，CD163能促进PRRSV的侵入和复制，但TNF-α、TGF-β和IFN-γ能降低CD163的分泌[66]。其他的一些介质也会调节CD163的分泌。PRRSV的不同分离株表达不同的细胞因子，可以通过分析不同淋巴器官的促炎细胞因子和抗炎细胞因子研究不同PRRSV毒株的免疫发病机理。1.7PRRSV的检测方法1.7.1病毒分离病毒分离是PRRS诊断中准确度最高的方法。通常选取死胎或者弱仔猪的血清、淋巴结、肺脏、扁桃体等病料进行病毒的分离，从木乃伊胎儿和公猪精液中很难分离出病毒，采集病料时需注意[67]。将血清或者组织进行匀浆后取其上清接8 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述种于敏感细胞，培养细胞并观察有无特征性的细胞病变（cytopathiceffect，CPE），病变主要表现为细胞的固缩、聚集、脱落。PRRSV常用的增殖细胞主要有原代猪肺泡巨噬细胞（PAM）、Marc-145细胞以及克隆自Marc-145的HS.2H细胞等。研究表明，大多数毒株尤其是Ⅰ型均能够在PAM上生长，但有的毒株只能在一种细胞上生长，有的毒株却能够在多种细胞上生长。不同的分离株在敏感细胞上出现CPE的时间也不一样，有的细胞培养一代就可以出现CPE，有些需要培养三代，更有一些不会出现CPE，这就需要结合其他的检测方法进行下一步的检测。该方法最突出的优点是诊断准确，但也存在耗时较长并需要专门人员与仪器的不足。1.7.2分子生物学检测PRRSV的分子生物学诊断主要包括RT-PCR检测、原位杂交技术（ISH）、基因芯片技术和环介导等温扩增技术（LAMP）等，该方法具有特异性强、敏感度高的特点。针对微生物核苷酸的RT-PCR诊断技术于80年代兴起，具有较高的敏感性、特异性。在PRRSV诊断方面主要依据病毒的ORF序列设计特异性的引物，利用Nsp2基因序列合成特异性引物可以鉴别PRRSV经典株和变异株；针对Nsp2、ORF5和ORF7基因序列设计特异性引物，进行多重RT-PCR检测可以同时检测并且区分Ⅰ型毒株、Ⅱ型经典毒株和变异株。实时荧光定量RT-PCR在PRRSV检测时主要用基于SYBRGreenⅠ染料和基于TaqMan探针的FQ-RT-PCR方法，能同时检测PRRSVⅡ型经典株、变异株和Ⅰ型毒株的多重TaqManFQ-RT-PCR由WernikeK首次建立，这种方法为鉴别复杂多样的PRRSV毒株提供了可行的技术指导[68]。ISH主要用标记染料标记来自PRRSVORF7保守序列，反转成从DNA，制成特异性探针。这种方法可以用来检测组织切片、淋巴结、肺泡巨噬细胞等感染细胞里的病毒RNA。LAMP是一种新颖的恒温核酸扩增方法，能够在等温（60-65℃）条件下，短时间内进行核酸扩增，该方法简便、快速、精确、低价，和普通PCR相比，不需要热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP特异性强并且简单、快速，在各项指标上均可与普通PCR相媲美，在某些方面甚至还要优于普通PCR，并且它不需要依赖专门的仪器设备就可以实现高通量快速检测，检测成本也要远低于RT-PCR。GaoM针对PRRSV最保守的ORF6序列合成一套引物，能够同时检测Ⅱ型经典毒株和变异株的RT-LAMP，其敏感性是RT-PCR的100倍。该检测方法操作简单，不需要复杂的仪器，比较适合基层检测。1.7.3病毒的抗原检测9 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述PRRSV抗原的检测是在单克隆抗体的基础上建立起来的，通过PRRSVGP5蛋白、M蛋白和N蛋白等单克隆抗体的制备，利用免疫胶体金技术、免疫荧光抗体染色等技术检测PRRSV。该检测方法操作比较简单，检测结果快速清晰并且不需要特殊的设备，没有复杂的操作，这些也是它能够广泛用于临床诊断的原因。免疫胶体金技术在1971年首次应用于免疫化学研究，它是以胶体金颗粒包被抗原或抗体，进行抗体或抗原的快速检测。常用来制备胶体金的方法是柠檬酸钠还原法和鞣酸-柠檬酸三钠还原法，这两种方法具有操作简单，能够制备直径大小比较均匀的胶体金颗粒的特点。我国的方莹等利用ELISA原理和胶体金技术，制成了检测猪PRRS的抗体胶体金试纸，用该试纸与IDEXXELISA检测试剂盒对比，结果符合率达93%。1.7.4血清学检测PRRSV感染猪后的1-2周内机体的免疫系统被激活，开始产生体液免疫和细胞免疫应答。研究表明最早产生的是抗N蛋白的抗体，持续的时间可达数月，接着是抗M蛋白抗体，然后是抗GP5抗体。血清学方法检测抗体更适合PRRS的诊断，也是目前使用较普遍的方法。常用的血清学检测方法有间接荧光试验(IFA)、血清中和试验(SN)、免疫过氧化物酶单层实验（IPMA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。IFA是国际上通用的检测PRRSV阳性抗体的方法，虽然具有较高的敏感性和特异性，但该方法的实验结果主观性较强，存在假阳性，也需要专业的人员和设备。SN需要在细胞培养物上固定病毒、改变血清，设立阳性、阴性血清对照，在检测PRRSV抗体特异性时表现较好、抗原类型差异明显[69]。这种方法对实验技术的要求比较高，主要适用于实验室诊断，不适合基层检测。LPMA具有较高的敏感性和特异性，适用于检测病毒抗原，鉴定病毒和检测抗体，在欧美国家使用广泛。该方法有较好重复性，但和SN一样需要有经验的人员，实验结果有主观性，容易出现假阳性。ELISA是一种较成熟和经典的抗原、抗体检测技术，该技术具有高度的敏感性和特异性，操作简单，结果判断客观，适用于大规模的样品检测。ELISA检测出抗体的时间虽然要比IFA和IPMA晚，但能够在提高敏感性的同时保持高度特异性。在PRRSV检测上常用的有包被全病毒的间接ELISA和包被N蛋白的间接ELISA。蔡雪辉等利用差速离心法和非线性蔗糖密度梯度离心法纯化PRRSV，建立了PRRSV抗体的ELISA检测方法[70]。基于全病毒的间接ELISA的难度在于全病毒蛋白纯化工艺复杂，一些成分如血清、细胞成分等不易纯化干净，在检测时会有较强的非特异性反应和背景反应，并且批次的不同也会影响结果。随着研究的深入越来越都的研究人员将目光放在了基于N蛋白的间接ELISA，N蛋10 吉林农业大学硕士学位论文第一篇文献综述白的基因序列比较保守，大多数的分离株都具有相同的抗原表位；N蛋白在病毒粒子中是含量最高、免疫原性最强的蛋白。通过构建重组表达载体，表达的重组N蛋白经过纯化后可作为抗原应用到PRRSV的检测中。除了N蛋白，常用到的还有重组Nsp7蛋白和Nsp2蛋白等都在间接ELISA检测表现出了较高的敏感性和特异性。11 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达第二篇研究内容第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达1实验材料1.1病毒和菌株病毒为PRRSV分离株，E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)由吉林农业大学动物科技学院细胞生物学实验室保存。1.2主要仪器和设备单人无菌操作台苏州净化SW—CJ—1G型台式离心机德国SIGMA3K15PCR扩增仪杭州博日科技有限公司TC-96/G/H（b）智能压力蒸汽灭菌锅长春百奥生物仪器有限责任公司VP-2432凝胶图像处理系统北京鼎昊源科技有限公司IMAGINGG6电泳仪北京六一仪器厂水浴恒温振荡器金坛市江南仪器制造厂THZ-82超低温电冰箱SANYOMDF-U2086S1.3载体及试剂盒TaqDNA聚合酶、pMD18Tsimple载体、T4DNAligase、DNAMarker、BamHI和HindⅢ等限制性内切酶，购自宝生物工程有限公司；原核表达载体pET-28a(+)，购自Novogen公司；质粒小提试剂盒，购自北京索莱宝；DNA凝胶回收试剂盒，购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；RNALyzol试剂盒，购自上海依科赛生物制品有限公司；M-MLV第一链合成系统，购自Invitrogen公司。12 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达1.4主要试剂的配制1.4.1LB液体培养基称取NaCL10.0g，酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.0g，加双蒸水定容至1000mL，完全溶解后，用5moL/LNaOH调节pH至7.0-7.2，121℃下灭菌30min。1.4.2LB固体培养基先配制LB液体培养基，再按照15g/L加入琼脂粉，将pH调至7.0-7.2，121℃下高压蒸汽灭菌30min，冷却到50℃左右，加入相应的抗生素混合均匀后倒入培养皿中，培养基厚度约为2-3mm，培养基完全凝固后，用封口膜封口，置于4℃备用。1.4.2氨苄青霉素（100mg/mL）称取氨苄青霉素0.5g加入到5mL双蒸水中，溶解后在无菌条件下用0.22μm过滤器过滤，分装到1.5mL离心管中，每管1mL，-20℃保存。1.4.350×TAE电泳缓冲液取冰乙酸57.1mL，Tris242g，Na2EDTA·2H2O37.2g，双蒸水定容至1L，电泳时稀释成1×TAE电泳缓冲液使用。1.4.41.0%琼脂糖电泳凝胶50×TAE稀释成1×TAE，取1×TAE电泳缓冲液100mL，称琼脂糖1.0g，微波炉加热至琼脂糖完全溶解，将电泳液倒入凝胶盒，加入EB1.2μL混合均匀，插入梳子，室温静置30min，拔出梳子，取出凝胶并将其置于电泳槽，电泳液没过凝胶。1.4.5SDS-PAGE电泳缓冲液称取TrisBase3.02g，SDS1.0g，甘氨酸18.8g，用三蒸水定容至1L。1.4.61.0moL/LTris·Cl（pH6.8）取TrisBase6.05g，加入30mL三蒸水溶解，定容到50mL，调节pH到6.8.1.4.71.5moL/LTris·Cl（pH8.8）取TrisBase18.2g，70mL三蒸水溶解，定容到100mL，调节pH到8.8.1.4.810%SDS称取SDS1.0g，加入90mL三蒸水，68℃加热溶解，调节pH到7.2.1.4.910%过硫酸铵（AP）称取过硫酸铵50mg，加入0.5mL三蒸水充分溶解，现用现配。1.4.1030%丙烯酰胺称丙烯酰胺29.0g，N.N-二甲叉双丙烯酰胺1.0g，用三蒸水定容至100mL，过滤，最后4℃保存。1.4.11R-250考马斯亮蓝染色液13 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达量取甲醇450mL，三蒸水450mL，冰醋酸50mL，称取R-2500.25g，溶解后过滤。1.4.12脱色液三蒸水45%，甲醇45%，冰醋酸10%。1.4.13结合缓冲液（Bindingbuffer）20mM磷酸钠，0.5MNaCl，20-40mM咪唑，调节pH到7.4。1.4.14洗脱缓冲液（Elutionbuffer）20mM磷酸钠，0.5MNaCl，200mM咪唑，pH7.4。2实验方法2.1目的基因的扩增及鉴定2.1.1病毒RNA的提取按照RNALyzol试剂盒（购自上海依科赛）操作说明提取病毒总RNA。1）将400μLPRRSV细胞悬浮液加入到离心管中，加入1mL的RNALyzol多次吹打均匀，使其充分混合。2）向离心管中加入氯仿200μL，剧烈振荡30s，在4℃下，12000rpm离心5min。3）将上清液转移到新的离心管中，再加入和上清液等体积的异丙醇，4℃下放置5min，再在4℃下，12000rpm离心5min。4）弃上清，用70%的无水乙醇700μL清洗沉淀，在4℃下，12000rpm离心5min。5）重复步骤4）一次。6）弃去上清，保留沉淀，室温下干燥，用DEPC水（25-30μL）定容。将所得到的RNA溶液置于-80℃保存。2.1.2cDNA的合成利用M-MLV第一链合成系统（购自Invitrogen）合成cDNA，反应总体积为20μL。将灭菌蒸馏水9μL、总RNA2μL、10mMdNTP混合物1μL和Oligo（dT）201μL加入到无核酸酶的微量离心管中，混合液在65℃下保持5min后，迅速置于冰水中冷却。短暂离心后再加入5×第一链合成缓冲液4μL、0.1MDTT2μL，轻轻混合后，在37℃下孵育2min。加入M-MLV逆转录酶1μL（200U），混匀后，37℃孵育50min。最后在70℃下加热15min以终止反应，利用反应产物进行PCR。2.1.3GP5和Nsp7目的基因的扩增根据GenBank上公布的PRRSV（KC771271.2）GP5基因序列，使用DNAMAN设计合成一对引物，预期目的基因片段大小为603bp，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。14 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达，，上游引物：5-GAATTCATGTTGGTAGAAATGCTTGAC-3；下游引物5’-AAGCTTCTAAGGACGACCCCATTGTT-3’；斜体划线分别为EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点。根据公布PRRSV（AF635006）的Nsp7基因序列，设计合成一对引物，预期基因片段大小约为777bp，引物由上海生工合成。上游引物序列：5′-CGGATCCTCGCTGACTGGTGCCCTC-3′；下游引物序列：5′-GCGCGGAAGCTTTTCCCACTGAGCTCT-3′；斜线加粗分别为BamHI和HindIII酶切位点利用2×TaqMasterMix（购自北京康为世纪有限公司）进行PCR反应，反应总体积为20μL，反应组成为：2×TaqMasterMix10μL、RNase-FreeWater8.0μL、上游引物和下游引物各0.5μL、cDNA1.0μL。PCR反应参数为94℃预变性5min；94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸35s，30个循环；最后72℃延伸8min。PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行目的基因的凝胶回收。2.1.4目的基因的凝胶回收出现目的基因条带后，按照回收试剂盒的说明进行目的基因的回收。1）紫外灯下用刀片将含有目的基因的凝胶小心切下，用纸巾吸尽凝胶表面的电泳液并将其切碎。将切碎的凝胶装入提前记录重量的离心管中再次称重，计算出凝胶重量，并将该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μL体积）。2）向离心管中加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀，75℃加热，每2-3min间断混合一次，直至胶块完全熔化，溶液颜色均匀（约6-8min）。3）再向离心管中加入0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，充分混合。4）吸取3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。5）将制备管放回2mL离心管，加入500μLBufferW1，12000rpm离心1min，弃滤液。6）将制备管放回2mL离心管，加入700μLBufferW2，12000rpm离心1min，弃滤液。再次重洗一次。7）将制备管重新放回2mL离心管中，不加任何溶液，12000rpm离心1min。8)将制备管置于试剂盒内提供的洁净1.2mL离心管中，在制备膜中央加25-30μLEluent或去离子水，枪头不要接触到膜，室温静置1min。12000rpm离心1min洗脱DNA。9）凝胶回收产物进行1.0%凝胶电泳鉴定，紫外灯下察看目的基因是否成功回收。2.2重组质粒pMD18-T-GP5和pMD18-T-Nsp7的构建2.2.1pMD18-Tsimplevector与GP5、Nsp7的连接15 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达GP5和Nsp7的PCR产物用凝胶回收试剂盒进行回收后，将回收产物分别与pMD18-Tsimplevector连接。SolutionⅠ4.5μL，PCR回收产物5μL，Vector0.5μL，体系体积共10μL，4℃连接过夜后再进行转化。2.2.2连接产物转化至E.coliDH5α1）将E.coliDH5α从-80℃转至冰水中融化，将5μL连接产物加入到融化的E.coliDH5α中，冰浴30min。2）将混合物置于水浴锅中42℃热激90s，然后迅速置于冰上，冰浴2min。3）将混合物全部转移到500mL的LB液体培养基中，在摇床上37℃，125r/min培养1h。4）将20μLX-Gal（100μg/mL）100μL氨苄青霉素（Amp）和100μLIPTG（100mmoL）混合均匀后，均匀涂在LB固体培养基上，室温静置备用。5）取培养1h后的LB液体培养基20μL均匀涂在4）中准备的LB固体培养基上，37℃培养12h。6）观察菌落，白色菌落为阳性转化，蓝色菌落为阴性转化。2.2.3pMD18-T-GP5和pMD18-T-Nsp7重组质粒的筛选与鉴定挑取单个白色菌落，分别接种到含有Amp的LB液体培养基中，摇床上37℃培养12h，取菌液离心，收集沉淀，按质粒小量提取试剂盒的要求提取质粒。1）取阳性菌的细菌培养物，12000rpm离心1min，弃去上清保留沉淀，沉淀较少时可以在同一离心管中多次离心以收集足够菌体。2）向离心管中加入250μL溶液Ⅰ（提前加入RNase），用移液器反复吹打，重悬细菌细胞。保证菌块与溶液混合均匀，以保证提取的质粒有较高纯度和质量。3）向混合均匀的混合液中加入250μL溶液Ⅱ，缓慢的上下翻转离心管6-8次使菌体充分裂解。注意：动作一定要缓慢、温和，保证基因组DNA不受污染，此时菌液粘稠清亮，作用时间不超过5min为宜，以免破坏质粒。4）向上述混合液中加入350μL溶液Ⅲ，马上缓慢温和的上下翻转离心管6-8次，混合均匀，会出现白色的絮状物沉淀。12000rpm离心10min。注意：为避免局部产生沉淀，溶液Ⅲ加入后要立即混合。可再次离心除去上清中微小的白色沉淀。5）将以上得到的上清液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），静置2min后，再12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管。6）按说明向漂洗液中加入无水乙醇，混匀后向吸附柱中加入漂洗液700μL，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管。7）向吸附柱中加入漂洗液500μL，12000rpm离心1min，弃废液，再将吸附柱重新放回收集管中。8）12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱数分钟，将吸附柱16 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达中残留的漂洗液蒸发除去，漂洗液中的乙醇会影响后续酶切、PCR等实验。9）将吸附柱置于新的离心管中，向吸附柱中滤膜上悬空滴加50-200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置1min，1200rpm离心1min。10），将得到的洗脱液重新加入到吸附柱中，再次洗脱可以增加质粒的回收效率，室温放置1min，再12000rpm离心1min。将提取的质粒进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，电压100V，电流100A，电泳10min，电泳结束后用凝胶成像系统观察凝胶。出现目的条带后，再对提取质粒进行PCR鉴定，PCR反应体系如表1-1。表1-1PCR反应体系Tab.1-1ReactionsystemofPCR2×MasterMix5μLRnaseFreeWater4.25μL上游引物0.25μL下游引物0.25μL模板0.25μLTotal10μL反应参数：95℃预变性5min；94℃变性30s、GP5基因50℃退火30s，Nsp7基因58℃退火30s、72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸8min，4℃保存。PCR产物进行1.0%凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统观察并拍照。2.2.4质粒的双酶切鉴定质粒与目的基因成功连接后，对质粒和载体进行双酶切鉴定，切下并回收目的基因。酶切反应体系分别如下表1-2和表1-3。表1-2GP5和质粒酶切体系Tab.1-2EnzymedigestionsystemofGP5andplasmidEcoRⅠ2μLHindⅢ2μLEBuffer4μLT-GP5质粒/pET-28a32μLTotal40μL17 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达表1-3Nsp7酶切体系Tab.1-3EnzymedigestionsystemofNsp7andplasmidBamHⅠ2μLHindⅢ2μLEBuffer4μLT-Nsp7质粒/pET-28a32μLTotal40μL将整个酶切体系置于37℃恒温振荡器，水浴振荡2h，反应结束后对反应产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。2.2.5目的基因的凝胶回收凝胶电泳结果鉴定出目的基因后，再按照AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒说明书对目的基因进行切胶回收，回收产物进行电泳鉴定。2.3重组质粒pET28a-GP5和pET28a-Nsp7的构建2.3.1目的基因与pET-28a的连接目的基因回收成功后，将目的基因回收产物分别与相对应的酶切载体回收产物连接，4℃下连接过夜。连接体系如表1-4。表1-4连接体系Tab.1-4ConnectsystemT-GP5/T-Nsp7质粒酶切回收产物4.25μLpET-28a酶切回收产物4.25μLBuffer1.0μLT4连接酶0.5μLTotal10μL2.3.2构建质粒的转化及重组质粒的鉴定将4℃连接过夜产物转化到BL21（DE3）内，转化方法参考转化到DH5α方法。挑选白色菌落并将其接种到含有Amp的LB液体培养基中，在恒温振荡器上37℃振荡培养12h，按质粒提取试剂盒的说明提取质粒，并对提取的质粒进行PCR鉴定，PCR产物再进行凝胶电泳鉴定。2.4目的蛋白的诱导表达2.4.1目的蛋白的诱导表达将检测阳性菌在37℃，125r/min振荡过夜培养，然后按1：100将菌液加入18 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达到LB液体培养基中，37℃继续培养至菌液OD值在0.4-0.6之间，将菌液分为等量的四份，然后分别加入诱导剂IPTG，使其终浓度分别为0.6mmol/mL、0.8mmol/mL、1mmol/mL、1.2mmol/mL。37℃振荡培养6h，到达诱导时间后，每管各取1mL诱导菌液离心，弃上清，用50μL去离子水将沉淀重悬，再加入等体积的2×SDS-PAGE缓冲液，混匀后煮沸5min。煮沸后将样品冷却至室温，12000r/min离心1min，取20μL上清上样，根据SDS-PAGE电泳结果判断最佳的IPTG诱导浓度。重新培养阳性菌，当OD值在0.4-0.6之间时，添加IPTG使其终浓度达到最佳浓度，将菌液分为四组分别进行诱导，分别诱导2h、4h、6h、8h。诱导完成后收集菌液，制样后进行SDS-PAGE电泳，根据电泳结果确定最佳的诱导时间。2.4.2SDS-PAGE凝胶电泳将玻璃板上下左右对齐，然后固定到玻璃板固定架上，固定时注意保持玻璃板的对齐状态，防止漏胶。将制好的12%的分离胶（表1-5）加入到两玻璃板之间，距离短玻璃板大约1.5cm处停止，再缓慢加满蒸馏水，室温静置45min。待分离胶凝固后倒出蒸馏水，再用蒸馏水洗3遍，用滤纸吸收残留蒸馏水后加满制好的5%浓缩胶（表1-6），然后缓慢插入梳子，室温静置30min，待凝固后缓慢拔出梳子，用蒸馏水清洗3遍，然后取下玻璃板并将其固定在电泳装置中，短玻璃板的一面在里侧。将电泳装置安放于电泳槽中，加电泳液至电泳槽规定刻度，电泳装置中加满电泳液，除去电泳装置中电泳液的泡沫，取处理好的样品20μL加入上样孔。接通电源，调节电压至100V，当溴酚蓝指示剂到达分离胶与浓缩胶交界处时，将电压调到200V，当指示剂到达胶板底部时，停止电泳。取出玻璃板，小心取下胶板，将其置于考马斯亮蓝R250染色液中，摇床染色过夜后将凝胶置于脱色液中，多次脱色后观察分析。表1-5分离胶配制表Tab.1-5Preparationofseparationgel12%的SDS-PAGE20mLH2O6.630%丙烯酰胺混合液8.01.5mol/LTris(pH8.8)5.010%SDS0.210%过硫酸铵0.2TEMED0.00819 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达表1-6浓缩胶配制表Tab.1-6Preparationofspacergel浓缩胶5mLH2O3.430%丙烯酰胺混合液0.831.5mol/LTris(pH6.8)0.6310%SDS0.0510%过硫酸铵0.05TEMED0.0052.4.3表达蛋白的Westernblot的鉴定表达的GP5和Nsp7重组蛋白经SDS-PAGE分离后，切下含有表达蛋白的分离胶，将凝胶转移到PVDF膜上，5%的BSA封闭，以兔抗PRRSV多克隆抗体作一抗，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗，TMB显色，再进行Westernblot。1）剪下PVDF膜1张和中性滤纸6张，大小均与分离胶大小一致。先在无水甲醇中浸泡5s，再置于电泳缓冲液中浸润。2）按照从阳极到阴极安装转膜装置，转膜次序依次为：红色海绵垫（阳极）-三层滤纸-PVDF膜-目的蛋白分离胶-三层滤纸-黑色海绵垫（阴极），尽量保持各接触面没有气泡，保持湿润。湿电转膜仪电压300V，电流220mA，时间140min，在冰浴中进行。3)将PVDF膜取下，用TBST洗涤3次，每次都在摇床上漂洗10min。4）将PVDF膜浸润到15mL含有5%脱脂奶粉的TBST液中，用封口袋封闭，摇床上封闭1h。5）剪开封口袋将膜取出，用TBST洗涤3次，每次均在摇床上漂洗10min。6）一抗孵育用含有2%脱脂奶粉的TBST按1:200稀释兔抗PRRSV单克隆抗体，尽量将膜浸没在抗体中，4℃孵育过夜。7）孵育完成后用TBST洗涤3次，每次都在摇床上漂洗10min。8）二抗孵育用含有2%脱脂奶粉的TBST按1：1000稀释HRP标记的羊抗兔IgG，将膜完全浸润在抗体中，室温下孵育1h。9）同上洗涤方法洗涤3次。10)显色TMB避光显色，用超纯水终止反应，对实验结果照相保存。2.5目的蛋白的纯化按照优化后的条件进行目的蛋白的诱导表达，蛋白表达菌液离心后收集菌20 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达体，超声破碎后用0.22μm过滤器过滤细胞破碎液，保存备用。按照说明书安装纯化柱，进行蛋白的纯化。1）按照说明将纯化柱与层析系统的管道相连接，用注射器将三蒸水一滴一滴的注入到纯化柱，赶出柱中的空气以免将其引入层析系统。2）移去纯化柱出口的控速弹簧夹，并用三蒸水洗柱，3-5个柱床体积。3）用大于5个柱床体积的Bindingbuffer平衡纯化柱。1ml柱子使用1ml/min的流速，5ml柱子使用和5ml/min的流速。在最后的平衡或上样前先空白运行。4）用注射器将预先处理好的样品上到柱上。5）用Bindingbuffer清洗柱子，直到吸出液的OD值保持不变（通常需要10-15个柱体积）。提高纯化的结果可以在样品和结合缓冲液中使用咪唑。6）用Elutionbuffer进行分部或线性梯度洗脱。分部洗脱通常需要5个柱床体积左右的洗脱缓冲液。7）收集各部分的Elutionbuffer并进行SDS-PAGE电泳，收集液于-80℃保存。3结果3.1PRRSVGP5和Nsp7基因的扩增及鉴定以反转录的GP5和Nsp7的cDNA为模板进行PCR，PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，GP5可见603bp左右的条带如图1.1，Nsp7可见大小约为777bp的条带如图1.2，均与预期基因片段大小一致。图1.1GP5基因扩增产物电泳结果图1.2Nsp7基因扩增产物电泳结果M.2000bpMarker；1.扩增产物M.2000bpMarker；1.扩增产物Fig.1.1ElectrophoresisresultsofGP5amplificationFig.1.2ElectrophoresisresultsofNsp7amplificationproducts.products.M.2000bpMarker;1.AmplificationproductsM.2000bpMarker;1.Amplificationproducts21 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达3.2重组质粒pMD18-T-GP5和pMD18-T-Nsp7的筛选与鉴定将pMD18-T-GP5和pMD18-T-Nsp7质粒进行电泳鉴定和PCR鉴定，对质粒和pET28a载体分别进行EcoRⅠ和HindⅢ，BamHⅠ和HindⅢ的双酶切鉴定，酶切产物进行1.0%凝胶电泳鉴定，目的条带清晰如图1.3和图1.4。切胶回收酶切产物，回收回来的产物和双酶切回收的pET28a连接，转化到表达菌BL21（DE3）中，挑选阳性菌体培养，提取质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，结果如图1.5和图1.6。并将阳性质粒送到上海生工测序。结果表明成功构建了原核表达载体，将其命名为pET28a-GP5和pET28a-Nsp7。图1.3重组质粒pMD-18T-GP5的鉴定图1.4重组质粒pMD-18T-Nsp7的鉴定M.2000bpMarker；1.双酶切鉴定；2.PCR鉴M.2000bpMarker；1.双酶切鉴定；2.PCR鉴定定Fig.1.3IdentificationofrecombinantplasmidFig.1.4IdentificationofrecombinantplasmidpMD-18T-GP5pMD-18T-Nsp7M.2000bpMarker;1.Doubledigestion;M.2000bpMarker;1.Doubledigestion;2.PCRidentification2.PCRidentification22 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达图1.5重组质粒pET28a-GP5的鉴定图1.6重组质粒pET28a-Nsp7的鉴定M.2000bpMarker1.双酶切鉴定2.PCR鉴定M.2000bpMarker1.双酶切鉴定2PCR鉴定Fig.1.5IdentificationofrecombinantplasmidFig.1.6IdentificationofrecombinantplasmidpET28a-GP5pET28a-Nsp7M1.1kbMarkerM2.2000bpMarker1.DoubleM.2000bpMarker;1.Doubledigestion;digestion;2.PCRidentification2.PCRidentification3.3目的蛋白的诱导表达成功构建的原核表达载体转入到表达菌BL21（DE3）中，37℃下振荡培养，进行诱导条件的优化，以达到最佳的表达水平。试验表明IPTG终浓度为1.0mmoL/L，诱导时间为6h时GP5和Nsp7重组蛋白的表达量最高，如图1.7、图1.8和图1.9。23 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达图1.7GP5蛋白表达的SDS-PAGE结果M.蛋白分子量标准;1.GP5蛋白表达;2，3.空载体对照；纯化的GP5蛋白Fig.1.7WesternblotofexpressedproteinM.Standardsofproteinmolecularweight；1.ExpressedGP5protein;2，3.Emptyvector；4.PurifiedGP5protein图1.8不同IPTG浓度下Nsp7蛋白表达结果M：蛋白Marker；1：对照；2：0.6mmol/L；3：0.8mmol/L；4：1.0mmol/L；5：1.2mmol/LFig1.8ResultofNsp7indifferentdensityofIPTGM.Standardsofproteinmolecularweight;1:control;2：0.6mmol/L；3：0.8mmol/L；4：1.0mmol/L；5：1.2mmol/L24 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达图1.9不同诱导时间下Nsp7蛋白表达结果M：Marker；1：对照；2：2h；3：4h；4：6h；5：8hFig1.9ResultofNsp7indifferentinductiontimeM：Marker1:control2：2h；3：4h；4：6h；5：8h3.4重组蛋白的纯化及Westernblot按照优化的条件进行蛋白的诱导表达，收集表达菌体，超声破碎后收集上清液，按照HisTrapFF说明书进行纯化，用200mM咪唑洗脱以获得较高浓度的目的蛋白。SDS-PAGE电泳结果条带清楚，GP5蛋白大小约为25KD，Nsp7蛋白大小约为33KD，实验结果与预期结果一致。图1.10GP5表达蛋白的Westernblot结果图1.11Nsp7蛋白的Westernblot结果M.蛋白分子量标准;1.纯化的GP5蛋白M．蛋白分子量标准；1.纯化的Nsp7蛋白Fig.1.10WesternblotofexpressedGP5Fig.1.11WesternblotofexpressedNsp7proteinproteinM.Standardsofproteinmolecularweight;M.Standardsofproteinmolecularweight;1.PurifiedGP5protein1.PurifiedNsp7protein25 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达4讨论PRRSV自1987年爆发以来迅速在全球蔓延，我国在1996年首次从流产胎儿中分离出PRRSV。由于该病毒是一种具有囊膜的单股正链的RNA病毒，有较强的变异能力，给该病的控制带来了一定的难度。PRRSV的N蛋白和Nsp7蛋白由病毒基因相对保守的片段编码，在不同毒株中都有较强的免疫原性。Nsp7和N蛋白的特性决定了其在血清学检测中适合做抗体靶蛋白。接种疫苗产生的GP5蛋白，可以用来检测接种疫苗后产生抗体的滴度，判断是否达到抵御病毒攻击的保护水平，但疫苗产生的抗原不包含Nsp7蛋白，利用这点可以用来鉴别感染后产生的抗体和免疫接种后产生的抗体。重组的GP5蛋白和Nsp7蛋白可以用来判断抗体是由接种灭活疫苗引起的，还是有病毒感染引起的。表达重组的目的蛋白需要选择合适的表达系统，目前常用的表达系统主要有原核和真核表达系统。大肠杆菌表达系统是典型的原核表达系统，它的遗传背景清楚、生长繁殖迅速、操作简单、转化率高、成本低且适合大规模生产目的蛋白，本试验采用的就是大肠杆菌表达系统。pET原核表达系统是一个比较成熟且使用广泛的系统，pET系统的RNA聚合酶机制在诱导表达时，目的蛋白的表达几乎能够调用所有的细胞资源，所以目的蛋白表达产量也非常高。pET28a具有较丰富的酶切位点，便于目的基因的连接。His-Tag标签的融合表达有利于可溶性蛋白的浓缩、纯化和检测。抗原纯度的高低对ELISA检测结果有重要的影响，因此采用高效的纯化方法获得较纯的GP5和Nsp7蛋白是检测的关键。常用的纯化方法有凝胶过滤层析、疏水层析，亲和层析和离子交换层析等，其基本原理是利用蛋白的分子量大小、溶解性、电荷、酸碱性和其它分子的亲和性之间的差异进行不同蛋白的分离。本试验采用固定化金属离子亲和层析（ImmobilizedMetalionAffinityChromatography，IMAC），该方法具有配体稳定、吸附量大、洗脱温和、再生能力强、高通量、低成本等优点，通常经过一步处理就可以将待提纯的蛋白从其它的蛋白中分离出来，并且分离出的蛋白还有较高的纯度。pET28a载体上含有6个His-tag标签，在蛋白的表达中会在目的蛋白的N端整合上His-tag，重组的蛋白GP5、Nsp7就会带有His-tag。在用HisTrapFF纯化时，带有His-tag的蛋白在6M盐酸胍或8M的脲存在的情况下，可以促进蛋白的去折叠，蛋白可以在柱上重折叠，进而固定在柱上，再通过改变离子强度或者pH的方法将目的蛋白洗脱下来。26 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第一章PRRSVGP5蛋白和Nsp7蛋白的诱导表达5小结1）成功扩增出GP5蛋白和Nsp7蛋白的目的基因，且GP5蛋白的目的基因大小约为603bp，Nsp7蛋白目的基因大小约为777bp，均与预期片段大小一致。2）成功构建了重组表达质粒pET28a-GP5和pET28a-Nsp7，并成功诱导表达出重组GP5蛋白和重组Nsp7蛋白。3）利用HistrapFF蛋白纯化柱，成功纯化到重组组GP5蛋白和重组Nsp7蛋白。27 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立1实验材料纯化的GP5蛋白和Nsp7蛋白，HRP标记的羊抗猪IgG，酶标板购自耐思生物科技有限公司，标准阳性血清和标准阴性血清由本实验室保存。1.1主要溶液的配制1.1.150mMTBS称取NaCl8.7g，KCl0.2g，TrisBase6.06g，加入800mL蒸馏水溶解后，定容至1L，用6MHCl调节pH到7.0-8.0，4℃保存。1.1.2封闭液量取50mMTBS1L，加入BSA10g，磁力搅拌溶解，调节pH至8.0，2周内使用完。1.1.3洗涤液50mMTBS1L，加入Tween205mL搅拌均匀，调节pH至8.0。1.1.4包被液NaHCO33.7g，Na2CO30.6g，加蒸馏水定容到1L。2方法2.1间接ELISA检测方法的建立及优化2.1.1抗原包被浓度、血清稀释倍数的优化将纯化的GP5和Nsp7蛋白进行稀释，使其终浓度分别为3μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL。将稀释好的蛋白加到酶标板中包被，8横排，5竖排，每孔100μL，同一竖排蛋白浓度一致，加入标准血清时，同一横排加入相同稀释倍数的血清。具体操作步骤如下：1）用稀释液将纯化的蛋白进行稀释，将稀释后的蛋白加入到酶标版，每孔100μL，37℃下2h；2）用TBST洗涤3次，每次5min，加入5%的脱脂奶粉（用TBST溶解），4℃28 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立封闭过夜；3）用稀释液稀释标准阳性血清和标准阴性血清，按1：20，1：40，1：80，1：160进行稀释。4）血清稀释后加入酶标板，每孔100μL，37℃下孵育30min。TBST洗涤三次，每次5min。5）加入1：5000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG酶标二抗，每孔100μL，37℃下孵育30min。6）TBST洗涤三次，每次5min，加入TMB过氧化物溶液显色，每孔100μL，暗室静置10-30min。7）加入终止液（2MH2SO4）50μL，终止显色反应。酶标仪测定读数，保存数据。2.1.2抗原包被时间的选择将抗原稀释到最佳包被浓度并包被酶标板，37℃下分别包被1h、2h和3h。4℃下5%脱脂奶粉封闭过夜，标准阳性与标准阴性血清检测，每孔做3个重复，其它操作和抗原浓度优化一样。测定OD值，算出P/N值并确定最佳包被时间。2.1.3封闭条件的优化其他条件保持不变，用最佳抗原浓度包被酶标板，37℃下包被最佳时间，洗涤后用5%脱脂奶粉封闭，封闭条件分别为37℃1h、37℃2h，4℃封闭过夜。用标准阳性和标准阴性血清进行检测，测量OD值，选择P/N值最大的封闭时间作为最佳封闭时间。2.1.4血清反应时间的优化酶标板用最佳浓度的抗原进行包被，包被时间为优化过的时间，封闭时间为优化后的最佳时间，用标准阳性和标准阴性血清进行检测，37℃下分别孵育20min、30min和40min。再进行酶标二抗孵育，终止反应后测其OD值，取P/N值最大且阴性血清OD值最小的为最佳反应时间。2.1.5酶标二抗浓度的优化最佳抗原浓度包被酶标板，包被最佳时间，封闭最佳时间，标准阳性和标准阴性血清检测，37℃孵育最佳时间，洗涤后分别加入1：1000，1：2500，1：5000，1：7500，1：10000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG酶标二抗，37℃下孵育30min。反应终止后测量OD值，P/N值最大且阴性血清OD值最小的为最佳工作浓度。2.1.6酶标二抗孵育时间的优化抗原稀释到最佳浓度后包被酶标板，37℃下包被2h，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，标准阳性和标准阴性血清稀释到最佳倍数再进行检测，HRP标记的羊抗猪IgG酶标二抗1：5000稀释后进行孵育，37℃下分别孵育20min，30min和40min。反应终止后测量OD值，P/N值最大且阴性OD值最小的为最佳孵育时间。29 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立2.1.7特异性试验使用建立的GP5-ELISA和Nsp7-ELISA检测方法，对伪狂犬（PRV）阳性血清、猪圆环（PCV）阳性血清、猪口蹄疫（FMD）阳性血清进行检测，同时以PRRSV标准阳性和标准阴性血清为对照，确定重组抗原是否与猪的其他常见疾病有无交叉反应。2.1.8间接ELISA检测方法的建立间接ELISA条件优化后，对A、B两组血清进行检测，检测结果与IDEXX试剂盒的检测结果进行比较。A组血清32份，无PRRSV感染，没有接种疫苗。B组为待测血清样本33份。3结果3.1抗原包被浓度、血清稀释倍数的优化纯化后的GP5和Nsp7蛋白稀释成3μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL，包被酶标板，标准阳性和标准阴性血清分别按1：20、1：40、1：80、1：160进行稀释，进行ELISA检测，测量结果如表2-1。选定标准阳性血清OD值在1附近，标准阳性血清OD值与标准阴性血清OD值（P/N）最大时为最佳条件。GP5蛋白浓度为1μg/mL，血清稀释倍数在1：80时，标准阳性血清OD450nm值为0.989，最接近1，P/N值为10.30。Nsp7蛋白浓度为2μg/mL，血清1：40倍稀释，标准阳性血清OD450nm值为1.026，P/N值为10.50。表2-1GP5、Nsp7蛋白包被浓度和血清稀释倍数优化检测结果Tab.2-1theresultofGP5andNsp7correspondingtodifferentconcentrationandserumdilution血清稀释倍数GP5蛋白包被浓度（μg/mL）Nsp7蛋白包被浓度（μg/mL）（+、-）3210.50.253210.50.251：20（+）1.9831.9211.5320.9820.5231.4361.3870.9640.8340.6211：20（-）0.3120.2470.1960.190.1320.1610.1240.0850.0920.0811：40（+）1.9341.7631.2560.9250.4531.5231.0260.9160.6210.5271：40（-）0.1930.1820.1430.1260.1210.1320.0970.0820.0860.0691：80（+）1.4571.2140.9890.5260.3991.2240.8910.6260.6520.5231：80（-）0.1560.1350.0960.0830.0710.0840.0730.0640.0520.61：160（+）0.9720.9340.6280.5820.3561.2030.7810.5230.5360.4741：160（-）0.1680.1470.0880.0720.0680.0760.0680.0520.0430.03530 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立3.2抗原包被时间的选择抗原包被的目的是在最短的时间内、最大限度的将抗原结合到酶标板的固相载体上，P/N值要足够大，以便能够区别标准阳性血清和标准阴性血清。由表2-2可知，GP5和Nsp7蛋白在37℃下包被2h效果最好，P/N值分别为10.54和13.82。表2-2不同抗原表包被时间下的P/N值Tab.2-2P/Nvalueindifferentreactiontimeofcoatingantigens血清稀GP5蛋白血清稀Nsp7蛋白释倍数37℃1h37℃℃2h373h释倍数37℃℃℃1h372h373h1：80（+）0.9821.2121.0221：40（+）1.0321.3270.9251：80（-）0.0950.1150.0981：40（-）0.0850.0960.078P/N10.3410.5410.43P/N12.1413.8211.863.3封闭条件的优化脱脂奶粉中含有丰富的蛋白，封闭时这些蛋白会非特异性的结合到酶标板的固相载体上，避免抗体与固相载体的结合。本试验采用5%的脱脂奶粉进行封闭，结果如表2-3，封闭重组GP5和Nsp7蛋白均是在4℃下封闭过夜效果最好，二者的P/N值分别为10.68和10.92。表2-35%脱脂奶粉封闭不同时间的P/N值Tab.2-3P/Nvaluecorrespondingtodifferentcoatingtimeof5%skimmilkpowder血清稀封闭GP5蛋白血清稀封闭Nsp7蛋白释倍数37℃℃1h372h4℃过夜释倍数37℃℃℃1h372h4过夜1：80（+）0.8860.8940.9831：40（+）0.8970.9280.9831：80（-）0.0840.0870.0921：40（-）0.0870.0850.09P/N10.5510.2810.68P/N10.3110.8810.923.4血清反应时间的优化加入稀释后的血清，在37℃下孵育20min、30min和40min，ELISA检测，比较数据，选择P/N值较高的作为最佳反应时间。由表2-4可知，二者都是在孵育30min时效果最好，P/N值较高，分别为10.80和11.47。31 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立表2-4血清孵育不同时间的P/N值Tab.2-4P/Nvalueofdifferentserumreactiontime血清稀释GP5蛋白血清稀Nsp7蛋白倍数20min30min40min释倍数20min30min40min1：80（+）0.9620.9830.9681：40（+）1.0131.0321.0251：80（-）0.0890.0910.0931：40（-）0.0920.090.093P/N10.7910.8010.4P/N11.0111.4711.023.5酶标二抗工作条件的优化将HRP标记的羊抗猪IgG分别按1：1000、1：3000、1：5000、1：7000、1：9000进行稀释，进行间接ELISA的检测，检测结果如下表。结果表明HRP标记的羊抗猪IgG按1：5000的比例稀释时为最佳，GP5和Nsp7蛋白的P/N值分别为10.68和10.71。按照1：5000稀释进行孵育，37℃下分别孵育20min、30min和40min，加入TMB暗室显色10min，测量OD值，结果如表2-5和表2-6，表明反应时间在30min时最佳，GP5蛋白酶标二抗反应时间的P/N值为10.83，并且阴性血清的OD值为0.092；Nsp7蛋白酶标二抗反应时间的P/N值为13.69，阴性血清OD值为0.072。表2-5GP5蛋白和Nsp7蛋白酶标二抗不同稀释比例的P/N值Tab.2-5P/NvalueofdifferentdilutionrateofHRPGoat-anti-pigIgGofGP5andNsp7血清稀释GP5蛋白酶标二抗最佳稀释比例血清稀Nsp7蛋白酶标二抗最佳稀释比例倍数1：10001：30001：50001：70001：9000释倍数1：10001：30001：50001：70001：90001：80（+）1.1371.0280.9830.9650.8241：40（+）1.2321.1340.9960.9830.8991：80（-）0.1530.1320.0920.0940.0861：40（-）0.1320.1130.0930.0940.089P/N7.437.7910.6810.279.58P/N9.3310.0410.7110.4610.10表2-6酶标二抗反应不同时间的P/N值Tab.2-6P/NvalueofdifferentHRPGoat-anti-pigIgGreactiontime血清稀释GP5蛋白酶标二抗反应时间血清稀Nsp7蛋白酶标二抗反应时间倍数20min30min40min释倍数20min30min40min1：80（+）0.9230.9960.9141：40（+）0.9280.9861.0231：80（-）0.0880.0920.0931：40（-）0.0690.0720.084P/N10.4910.839.82P/N13.4213.6912.1832 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立3.6特异性试验每份血清做多个重复检测，以标准阳性和阴性血清做对照，根据待测样本血清（S）与标准阳性血清（P）的比值S/P来确定是否有交叉反应。结果表明重组抗原与PRV、PCV和FMD没有交叉反应。3.7间接ELISA检测方法的建立利用建立起来的ELISA检测方法对三组血清进行检测，其中A组32份血清的检测均为阴性，B组33份血清检测中，GP5-ELISA检测出27份阳性血清，6份阴性血清，结果如表2-6，与IDEXX相比，GP5-ELISA检测的敏感性为89.6%，特异性为75%。Nsp7-ELISA检测出28份阳性血清和5份阴性血清，结果如表2-7，与IDEXX相比，其敏感性为93.1%，特异性为75%。结果表明建立的间接ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性。表2-7IDEXX和GP5ELISA检测的比较Tab2-7.comparionofIDEXXandGP5ELISAtestsIDEXXELISA+-TGP5-ELISA+26127-336T29433表2-7IDEXX和Nsp7ELISA检测的比较Tab2-7.comparionofIDEXXandGP5ELISAtestsIDEXXELISA+-TNsp7-ELISA+27128-235T294334讨论PRRS的发病率逐年上升，有效的预防和检测该病能在最大程度上降低该病给养殖业带来的经济损失。IDEXX公司生产的ELISA试剂盒是目前商品化的检33 吉林农业大学硕士学位论文第二篇第二章PRRSV重组GP5蛋白和Nsp7蛋白ELISA检测方法的建立测试剂盒，该种产品价格较高，检测费时且需要专业人员操作。建立快速有效的检测方法对该病的预防有重要意义。在PRRSV的检测中，ELISA检测方法应用最为广泛。近年来有研究人员以重组N蛋白、重组GP5蛋白或重组Nsp7蛋白作为抗原来检测PRRSV，也取得了一定的效果。但是这些检测方法检测的都是单一的蛋白，接种灭活疫苗后也会刺激机体产生针对某一蛋白的抗体，这就给该病的检测带来了困难。本试验采用重组GP5蛋白和重组Nsp7蛋白相补充的方法来检测PRRSV。以结构蛋白GP5蛋白和非结构蛋白Nsp7蛋白为抗原建立ELISA检测方法，接种灭活疫苗后可以检测到针对GP5蛋白的抗体，野毒感染后可以检测到针对Nsp7蛋白的抗体，也能检测到GP5蛋白的抗体，Nsp7-ELISA检测阳性表明该样品已经感染PRRSV，检测阴性的样品再用GP5-ELISA检测，结果阳性说明样品已经接种过PRRSV灭活疫苗，并且可以根据抗体浓度判断接种效果，结果阴性表明样品没有接种灭活疫苗也没有感染野毒。两者相互补充能在更加有效的检测PRRSV。5小结1）建立间接ELISA检测方法时，重组GP5蛋白和重组Nsp7蛋白的最佳抗原稀释浓度分别为1μg/mL和2μg/mL，标准阳性血清和标准阴性血清的稀释倍数分别为1：80和1：40。2）抗原包被的最佳条件为37℃下包被2h。3）脱脂奶粉封闭的最佳条件是4℃下封闭过夜。4）标准阳性血清和标准阴性血清孵育30min时效果最好。5）重组GP5蛋白和重组Nsp7蛋白所用酶标二抗的最佳工作条件均为为1：5000稀释孵育30min。34 吉林农业大学硕士学位论文结论结论1.构建了原核表达载体pET28a-GP5与pET28a-Nsp7，表达、鉴定并纯化了重组GP5蛋白和Nsp7蛋白。2.建立了重组GP5和Nsp7的ELISA检测方法。3.利用所建立的ELISA方法对阳性血清进行了检测，并与IDEXXELISA试剂盒进行了比较，重组GP5和Nsp7的ELISA方法检测的敏感性分别为89.6%和93.1%，特异性均为75%。35 吉林农业大学硕士学位论文参考文献参考文献[1]DarwichL,GimenoM,SibilaM,etal.GeneticandimmunobiologicaldiversitiesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromegenotypeIstrains[J].VeterinaryMicrobiology,2011,150(1-2):49–62.[2]WangZH,CaoXH,DuXG，etal.MucosalandsystemicimmunityinmiceafterintranasalimmunizationwithrecombinantLactococcuslactisexpressingORF6ofPRRSV[J]．CellImmunol,2014,287(2):69-73.[3]ZhangX1,LiG,GaoL,MuL,etal.PositiveinductiveeffectofIL-18onvirus-specificimmuneresponsesinducedbyPRRSV-GP5DNAvaccineinswine[J]．ResVetSci.2013,94(2):346-53.[4]JankováJ,CelerV.ExpressionandserologicalreactivityofNsp7proteinofPRRSgenotypeIvirus[J]．ResVetSci.2012,93(3):1537-42.[5]RobinsonSR,AbrahanteJE,JohnsonCR,etal.PurifyingselectioninporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusORF5aproteininfluencesvariationinenvelopeglycoprotein5glycosylation[J]．InfectGenetEvol.2013,20:362-8.[6]王小敏，何孔旺，周忠涛猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离鉴定及遗传变异分析[J].华北农学报，2014，29(1):232-238.[7]RobinsonSR,FigueiredoMC,AbrahanteJE,etal.ImmuneresponsetoORF5aproteinimmunizationisnotprotectiveagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection[J]．VetMicrobiol.2013,164(3-4):281-5.[8]HuJ,NiY,MengXJ,ZhangC.etal.ExpressionandpurificationofachimericproteinconsistingoftheectodomainsofMandGP5proteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J]．JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci.2012,911:43-8.[9]安同庆，田志军,李冉，等.我国高致病性猪蓝耳病病毒的演化分析[J].中国兽医杂志,2011,47(4):3-5.[10]郎广平，郭敏，韩盈盈猪繁殖与呼吸综合征诊断方法与疫苗研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（6）：195-197.[11]DrigoM,FranzoG,BelfantiI,etal.ValidationandcomparisonofdifferentendpointandrealtimeRT-PCRassaysfordetectionandgenotypingofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.VirolMethods.2014,201:79-85.36 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吉林农业大学硕士学位论文作者简介作者简介姓名杨欢性别男民族汉籍贯河南政治面貌共青团员入学时间2012.9申请学位类别农学硕士论文答辩日期授予学位年月就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2008-2012河南科技大学动物科学与技术学院动物医学专业2012-2015吉林农业大学动物科学技术学院临床兽医学专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署名发表情况题目刊物名称（级别）署名单位发表学术论文次序(刊出时间/录用)PRRSVE蛋白的表达黑龙江畜牧兽医（核吉林农业大及检测抗体胶体金试12014.5.10心）学纸的研制猪繁殖与呼吸综合征黑龙江畜牧兽医（核吉林农业大病毒在猪呼吸道内的12014.11.10心）学免疫发病机理署名获奖名称成果级别署名单位发表情况次序项目及专利42 吉林农业大学硕士学位论文致谢致谢三年的时间说长挺长的，在这三年里自己一直在成长，收获了许多；三年的时间说短也挺短的，要毕业了，却觉得自己刚刚入学没有多久。存在这种矛盾的，我想不会只有我一个。毕业了能进入社会最大程度的展现自己的能力，但在这三年里对给过自己很多帮助的人却有些割舍不下。三年的时间已经远去，在这三年中有过快乐，也有过难过，不管怎样，过去的事情终究会埋藏在心底。回头看看这三年走过的路，发现自己在这三年里也成长了不少，不仅仅是年龄上的增加而已。在这充满成长与收获的三年末尾，谨在文章的最后对一直支持帮助我、鼓励我的老师和同学，亲人和朋友表达我发自内心深处的谢意！特别感谢我的导师崔焕忠副教授，崔老师指导我的实验设计，给我中肯的实验建议，一遍遍帮我审核论文，给了我很大的帮助与支持。在三年的学习中崔老师以身作则，每天总是第一个到实验室，做好一天的学习和实验安排，榜样的力量是无穷的，在崔老师的带领下，实验室形成了一个很好的学习和实验氛围。生活上，崔老师更是以朋友身份和大家相处，让我们彼此之间可以更好的沟通交流。崔老师学习和生活中的作风是我在以后的工作中要学习的。感谢我的师母张辉老师，张老师教会了我许许多多的实验技能，实验中遇到困难时，张老师总是能及时的给我提出改进的方案，张老师活跃的思维和严谨的工作态度都让我受益颇多。本研究是在吉林农业大学动物科技学院细胞生物学实验室完成的，感谢郑鑫老师对本研究的支持，感谢兰海楠老师、杨雨江老师对我的帮助，感谢师兄吴旻、师弟尹剑、师妹洪盼和李雨萌、同级的马思慧、吴天成和李雁强，谢谢他们在这三年里对我的帮助与支持。感谢我的家人，谢谢他们对我的理解和支持，他们是我努力的动力。杨欢2015年3月15日43