猪流行性腹泻病毒s部分基因的表达、抗体制备及间接elisa方法的建立

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1、安徽农业大学学位论文猪流行性腹泻病毒S部分基因的表达、抗体制备及间接ELISA方法的建立Expressionoffragmentalspikegeneofporcineepidemicdiarrheavirus,antibodypreparationandpreliminaryestablishmentofanindirectELISA研究生：王国松指导教师：张明教授合作指导教师：李震研究员申请学位门类级别：理学硕士专业名称：微生物学研究方向：微生物生理学所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：2015年5月独创性声明本人声明所呈交的论文是

2、我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒

3、体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年月日第一导师签名：时间：年月日1摘要猪流行性腹泻(PED)是一种急性、感染性高的肠道病毒性疾病，对新生猪仔造成很高的死亡率，猪流行性腹泻病毒（PEDV）为其致病原。PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科，α冠状病毒亚科（或属），基因组为单股正义RNA病毒，基因组大小约28kb。PEDV变异较大，其临床症状、病理变化以及流行特点都与传染性胃肠炎和轮状病毒病的十分相似。目前，PED在世界范围内广泛流行，但还没有很好的预防和诊断方法。为此本研究选择PEDVS基因的保守序列进行原核表达，制备

4、相应抗体，并初步建立一套检测PEDV抗体的间接ELISA方法。具体研究内容如下：1PEDV部分S基因的合成及重组质粒的构建通过DNAstar软件对猪流行性腹泻病毒流行毒株S基因进行序列比对与分析，选取位于502-641氨基酸位置处的S1蛋白保守序列，利用大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化，OverlapPCR合成，获得417bp基因片段，连接到克隆载体pJET/1.2-blunt上，并构建重组表达质粒pET32a-S417和pXXGST-S417。2重组质粒的表达与纯化将获得的重组表达质粒转化到BL21感受态细胞进行诱导表达，并通过割胶纯

5、化，获得重组蛋白GST-S417，分子量31kD左右，浓度0.3mg/mL左右，纯度达95%以上；通过过柱纯化，获得重组蛋白His-S417，分子量30kD左右，浓度0.1mg/mL左右，纯度达90%以上。3多克隆抗体的制备以纯化的GST-S417重组蛋白作为免疫原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，免疫量500µg/只。以纯化的His-S417重组蛋白作为包被抗原，检测免疫血清中抗体的效价，ELISA检测结果表明血清效价达1:10000以上，而且制备的多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。该研究表明所选的S蛋白区域具有一定的抗原性。4间接ELI

6、SA检测方法的初步建立包被纯化的GST-S417蛋白，摸索最佳间接ELISA条件，结果显示：包被量0.32µg/孔，血清最佳稀释比1:800，HRP标记的抗猪抗体稀释比为1:3000时，检测效果最好，阴性临界值为0.340，有良好的重复性和特异性，与市场销售的诊断试剂盒符合率较高，达72.7%，为进一步开发诊断试剂盒提供了理论和技术基础。关键词：PEDV，S蛋白，原核表达，抗体，间接ELISAIAbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED)isanacute,highlycontagiousanddevastat

7、ingviralentericdiseaseandithasahighmortalityrateinsucklingpigs.Thecausalagentisporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)belongingtotheOrderNidovirales,thefamilyCoronaviridaeandthegenusAlphacoronavirus.Itsgenomeisa28kbsingle-strandedpositivesenseRNA.PEDhasoutbrokenworldwide,butth

8、ereisstillnoeffectivemethodtodiagnosisandcontroltheseveredisease.Theaimoftheresearchwastoestabli