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《基于S蛋白检测猪流行性腹泻抗体间接ELISA方法的建立.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、河南农业科学,2013,42(8):119-123JournalofHenanAgricuhuralSciences基于S蛋白检测猪流行性腹泻抗体间接ELISA方法的建立邓祖丽颖(郑州幼儿师范高等专科学校,河南郑州450000)摘要:为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白抗体的间接ELISA方法,应用RT—PCR方法扩增PEDV河南流行毒株S基因794bp片段,将其克隆至原核表达栽体pET一32a(+),构建pET一32a—S重组质粒并转化至宿主菌BL21,在37℃条件下加入IPTG进行诱导表达,经SDS—PAGE分析显示,该蛋白以融合蛋白形式
2、高效表达,分子量约为46.9kD;Western—blot分析表明,所表达的重组蛋白具有良好的反应原性。以纯化的S蛋白为包被抗原建立检测PED抗体的间接ELISA方法,试验确定抗原最佳包被量为0.04ug/~L,血清最佳稀释度为1:1OO,HRP—IgG二抗最佳稀释度为1:2000,阳性判定标准为OD。值≥0.24。应用该方法对采自河南省不同地区23个养猪场的279份血清样本进行检测,结果显示,母猪血清样本PED抗体阳性率为97.42(227/233);育肥和保育猪血清样本阳性率为71.74(33/46)。试验结果表明,所建立的间接ELISA方法特异
3、性、灵敏性和可重复性良好,可以用于猪群PED抗体水平监测和流行病学调查。关键词:猪流行性腹泻病毒;S蛋白;原核表达;酶联免疫吸附试验中图分类号:$858.28文献标志码:A文章编号:1004—3268(2013)08—0119—05ProkaryoticExpressionofPEDVSProteinandDevelopmentofIndirectELISAforDetectionofItsAntibodyDENGZULi—ying(ZhengzhouInfantNormalSchool,Zhengzhou450000,China)Abstract:
4、Aspike(S)protein—basedELISAwasdevelopedtodetecttheantibodiesagainstporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV).The794pfragmentofSgenefromPEDVHenanisolatewasamplifiedbyRT—PCRandinsertedintotheexpressionvectorpET_32a(+).TherecombinantplasmidwasnamedaspET-32a—S.Afusionproteinwasexpressedin
5、BL21thattransfectedbypET一32a—SandinducedbyIPTG.Themolecularweightoftherecombinantproteinwasabout46.9kDanalyzedbySDS—PAGE,andtheimmunoreactionactivityoftherecombinantproteinwasconfirmedbyWestern—blot,inwhichpositiveserumagainstPEDVwasused.AnindirectELISAfordetectingantibodiesaga
6、instPEDVwasdevelopedbyusingexpressedSproteinascoatinganti—gen.TheresultsshowedthattheoptimalcoatingconcentrationforSproteinwas0.04rig/well,theserumdilutionwas1:100,andtheHRP—IgGdilutionfoldwas1:2000.Thepositivecriteri—onforthisELISAassaywasOD45o≥0.24.Foratotalof279fieldsamplest
7、ested,thepositiveratesofSOWserum,nurseryandfatteningpigserumwere97.42(227/233)and71.74(33/46),respectively.TheresultsindicatethatthisassayiSspecific,sensitiveandreproducible,whichmightbesuitablefordetectinganti—PEDVantibody.Keywords:PEDV;Sprotein;prokaryoticexpression;ELISA收稿日期
8、:2013—02—28作者简介:邓祖丽颖(196f一),女,河南郑州人,高级讲师,硕士,主要从事生物技术教学
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