禽致病性大肠杆菌phopq蛋白的表达纯化及其毒力调控分析

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1、．巧类与啤化代料：１０３６４：＇密级巧：１巧２０２２８；学学位论文禽致病性大肠杆菌ＰｈｏＰ／Ｑ蛋白的表达纯化及其毒力调控分析Ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐ，ｐＰｈｏＰ／ｒｏｔｅｉｎｓｏｎａｖｉａｎａｔｈｏｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｃｏｌｉＱｐｐｇ：王曼研究生指导教师；祁甫宗教授申请学位口类缀别；农学硕±．．医学专业名称；基础兽动物

2、病理与生物防治研究方向：所在学院：动物科技学院笞辩委员会主席：＿２０１５年６月独创性声明１；本人声明所巧么的论义是我个人化计师巧＾Ｋ进的研巧；化妓取得的研究成化。尽巧，所化，除ｆ义中特别加Ｗ标注和城谢的化知外论义中小包存巧他、ｄ巧发表或撰过的巧町化川过的材料。我究成张，化小包含为巧得女徽化化大芋或其它教行机构的学化或证向一。同Ｉ；作的问志对本研巧所做的任何扣献均ｄ化论义中化了Ｗ视的说＾化衣小／谢总；：研究牛．鞭名时１川；兴＿的ｇｕ＿＿／的关于论文使用授

3、权的说明，：本人巧午、即学校軒权保留送文胳：７邮安徽农化大学有关保留化用学化论义影的规忠汇义的结印件和磁盘，允许论义被爸阅和借閒，可凶采用印、±缩印或扫描等贷制ｒ段佔存、或编学化论义。同思安徽农业大学可用不问方乂化小同媒体发巧、化捕学化论义的全部部分内稗。文（保密的学位论在解密后应遵守此栖议）研化Ｉ：．豁名：心參—时间：＞眨巧户ｊ容１」巧－削｜｜１撰名：时问；皮年（＜〇］ＳｉＩAnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationE

4、xpression,purificationandvirulenceregulationanalysisofPhoP/QproteinsonavianpathogenicEscherichcoliAnswerer:WangManAdvisorProfessor:QiKe-zongAcademicDegree:MasterofAgricultureMajor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPathologyandBiologicalPreventionInstitut

5、e:AcademyofAnimalScienceandTechnologyJune2015国家自然科学基金项目：(31372402)《PhoP/Q对APEC关键毒力因子及β-防御素抗感染的调控研究》摘要禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC)能引起禽类高死亡率给养禽业的发展带来重大危害。存在于APEC中的PhoP/Q二元调控系统是由菌体外膜蛋白PhoQ感应外界环境变化，继而将信号传递给PhoP，PhoP能够调控病原菌毒力基因表达，这对菌体侵袭机体上皮细胞导致机体

6、致病起着关键作用。探索PhoQ介导PhoP调控的APEC毒力基因靶点，针对APEC检测受PhoP调控的外膜蛋白、内毒素等毒力相关基因，为后续进一步明确PhoP/Q调控系统对APEC毒力的影响奠定了基础。为探讨由PhoQ介导的PhoP对毒力基因的调控作用，本实验从基因调控角度入手通过禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因的原核表达获得其蛋白产物，检测受PhoP蛋白调控的毒力相关基因；同时，得到了PhoQ蛋白为实验室对PhoQ的研究提供了材料。本实验为后续进一步研究PhoP/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌毒力的调控功能

7、和作用机理提供一些参考。具体内容和结果如下：1禽致病性大肠杆菌PhoP/Q蛋白的表达根据NCBI中报道的APECphoP/Q基因编码区序列(GenBank登录号CP000468.1)，分别设计phoP(5′、3′端分别添加EcoRI和XhoI酶切位点)和phoQ引物(5′、3′端分别添加EcoRI和HindIII酶切位点，本文中所提PhoQ均为膜外区)用于扩增phoP/Q基因片段，将得到的phoP/Q基因片段克隆到PMD19-T载体上，经酶切和测序验证后分别将PMD19-T-phoP/Q和pET32a进行双酶切

8、连接，成功构建pET32a-phoP/Q原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)。将测序正确的E.coliBL21(DE3)-pET32a-phoP/Q接种于LB液体培养基，IPTG诱导表达PhoP/Q重组蛋白，SDS-PAGE检测分子量分别为42.9KDa和34.43KDa，与其理论分子量相一致。2禽致病性大肠杆菌PhoP/Q蛋白的纯化及鉴定工程菌经诱导表达，进一步证实重组的Ph