《毛竹ap2erf基因家族分析及dreb类转录因子表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号S722.3密级公开UDC学位论文毛竹AP2/ERF基因家族分析及DREB类转录因子表达研究AnalysisofAP2/ERFGeneFamilyandExpressionofDREBTranscriptFactorsinPhyllostachysedulis吴惠俐指导教师姓名李雪平副研究员申请学位级别硕士专业名称林木遗传育种研究方向竹藤遗传改良论文提交日期2015年5月8日论文答辩日期2015年6月23日学位授予日期2015年7月9日答辩委员会主席评阅人北京·中国林业科学研究院 学位论文毛竹AP2/ERF基因家族分析及DREB类转录因子表达研究学位论文作者吴惠俐指导教师姓名李雪平副研究员申请学位级别硕士专业名称林木遗传育种研究方向竹藤遗传改良论文答辩日期2015年6月23日中国·北京 DissertationfortheDegreeAnalysisofAP2/ERFGeneFamilyandExpressionofDREBTranscriptFactorsinPhyllostachysedulisCandidate:WuHuiliSupervisor:A.P.LiXuepingAcademicDegreeAppliedfor:MasterSpeciality:ForestGeneticBreedingDateofDefence:June23,2015Degree-conferring-institution:ChineseAcademyofForestry 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究Ｉ；化々化得的妍究成ｉ果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地为外，论义中小包含巧化人Ｌ巧发衣，或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究尘培养单位或其它教巧机构的学化或化Ｋ而使用过的材料－－－。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均Ｌ．乂ｎ论义中作ｒ明娩的说明并表Ｗ谢意。学位论文作者签名：仅：键年＾Ｊ１１例円期Ｊ学位论文版权使用授权书、本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留使Ｗ学位论文的规定，中固林业科学研究院有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的扭印件巧磁盘，化许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可将学位论文的全部或部分内容编入、汇编学位论义。有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：矣蓋姑导师签名：味ｆ今一円年與化年《月乂６月於鬥学位论文作者毕业联系方式工作单位：联系电话：电子邮件：通讯地址、邮编： 摘要毛竹（Phyllostachysedulis）是一个快速生长的非木质森林物种，是亚洲所有竹类植物中经济价值、生态价值和社会价值极高的竹种之一。AP2/ERF转录因子家族为植物特有的、家族成员数众多的家族，在调节植物的生长发育和响应生物与非生物胁迫过程中发挥着非常重要的作用。本论文在毛竹基因组草图数据库的基础上，对毛竹AP2/ERF转录因子家族进行了生物信息学分析，研究了DREB亚家族因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达差异，同时分离了两个DREB基因并对其功能进行了验证。主要研究结果如下：（1）本研究共确定了116个毛竹AP2/ERF转录因子。进化关系分析结果显示，这116个转录因子可被划分为3个亚家族：AP2，RAV和ERF，其中ERF亚家族转录因子又被划分为11个Group。对毛竹AP2/ERF基因的结构、内含子/外显子结构和保守基序皆进行了分析，结果表明不同亚家族和Group基因具有不同的结构特征。研究毛竹AP2/ERF基因的进化模式和分离时间发现毛竹AP2/ERF基因约在1500万年前发生了一次大规模复制事件，在1500-2300万年前毛竹和水稻的AP2/ERF基因发生了分离事件。通过对毛竹DREB亚家族基因的上游启动子区域分析，发现毛竹亚家族DREB基因的上游启动子区域存在大量与胁迫响应相关的顺式作用元件。（2）对毛竹DREB基因的表达模式分析，结果显示大多数基因在根中响应干旱、低温或盐胁迫而被强烈诱导表达，相反，叶片中大部分基因响应这三种胁迫而发挥下调表达的作用。研究发现毛竹DREB亚家族基因可能存在两个特点：一是其成员数少于水稻和拟南芥成员数，二是在响应非生物胁迫过程中其在根与叶片中的表达模式不同。（3）从毛竹中克隆了两个DREB基因，PeDREB2A和PeDREB1A（基因ID：PH01000046G1730和PH01000668G0350），基因序列CDS长度分别为795bp和825bp。这2个基因各包含一个典型的AP2/ERF结构域，分子量大小分别为28.96kDa和28.84kDa，等电点分别为9.47和5.34。RT-PCR分析显示PeDREB2A和PeDREB1A基因具有组织表达特异性，在根茎叶中均差异表达且在叶片和茎中的表达量相近。应用qRT-PCRI 方法分析显示，在叶片中，PeDREB2A转录产物在干旱和盐处理下迅速积累，分别在12h和0.5h时达到最大值，但在低温胁迫处理下表达量较低；PeDREB1A基因被低温诱导强烈上调表达，在3h时达到最大值，而在干旱和盐胁迫下表达水平低。在根中，PeDREB2A基因在干旱、低温和盐胁迫下下调表达，PeDREB1A基因表达量在三种胁迫处理下呈先上升后下降的趋势。（4）超表达PeDREB2A或PeDREB1A基因的转基因拟南芥在低温和盐胁迫培养基中表现出一定的耐寒和耐盐特征，低温处理下，转基因植株的叶片仍保持绿色，盐处理下，转基因种子发芽速度快，侧根数增多等。本研究为毛竹抗逆分子机理的研究提供了理论依据，研究结果将有助于克服毛竹栽培过程中的挑战。关键词：毛竹，AP2/ERF家族转录因子，非生物胁迫，DREBII AbstractMosobamboo(Phyllostachysedulis)isafast-growingnon-timberforestspecieswiththehighestecological,economicandsocialvaluesofallbamboosinAsia.TheAP2/ERFtranscriptionfactorfamily,oneofthelargestfamiliesuniquetoplants,performsasignificantroleintermsofregulationofgrowthanddevelopment,andresponsestobioticandabioticstresses.Inthispaper,basedonthedraftgenomeofmosobamboo,weanalyzedtheAP2/ERFgenefamily,studiedtheexpressiondifferenceofDREBtranscriptionfactorsunderdifferentabioticstresses,andisolatedtwoDREBgenesandverifiedtheirfuctions.Themainresultswereasfollows:(1)Intotal,116AP2/ERFtranscriptionfactorswereidentifiedinmosobamboo.Thephylogenyanalysesindicatedthatthe116AP2/ERFgenescouldbedividedintothreesubfamilies:AP2,RAVandERF;andtheERFsubfamilygenesweredividedinto11Groups.Thegenestructures,exons/intronsandconservedmotifsofthePeAP2/ERFgeneswereanalyzed.AnalysisoftheevolutionarypatternsanddivergenceshowedthePeAP2/ERFgenesunderwentalarge-scaleeventofcopyaround15millionyearsago(MYA)andthedivisiontimeofAP2/ERFfamilygenesbetweenriceandmosobamboowas15–23MYA.WeinvestigatedtheputativepromoterregionsofthePeDREBsanddiscoveredthatnumerousstress-relatedcis-elementsexistedinthesegenes.(2)FurtheranalysisofexpressionpatternsofPeDREBsrevealedthatmostofthesegeneswerestronglyinducedbydrought,low-temperatureand/orhighsalinitystressesinrootsand,incontrast,mostPeDREBgeneshadnegativefunctionsinleavesunderthesamerespectivestresses.Inthisstudy,thereweretwomaininterestingpoints:therewerefewermembersofthePeDREBsubfamilyinmosobamboothaninotherplantsandthereweredifferencesinDREBgeneexpressionprofilesbetweenleavesandrootstriggeredinresponsetoabioticstress.III (3)Inourstudy,twonovelDREBgenes,PeDREB2AandPeDREB1A(GeneIDNo.PH01000046G1730andPH01000668G0350),isolatedfrommosobamboobyamplifiedwithpolymerasechainreaction(PCR),wereidentifiedandcharacterized,thelengthofCDSwere795bpand825bp,respectively.ThePeDREB2AandPeDREB1AproteinswereestimatedtohaveatypicalAP2/ERFdomain,molecularweightof28.96kDaand28.84kDa,isoelectricpointof9.47and5.34,respectively.RT-PCRanalysisrevealedthatPeDREB2AandPeDREB1Aweretissue-specificgenes,expressinginleaves,youngstemsandroots,andexpressionlevelsweresimilarinleavesandyoungstems.TheqRT-PCRanalysisdisplayed,inleaves,thePeDREB2Atranscriptionlevelsrapidlyaccumulatefollowingexposuretodroughtstressandsalttreatment,peakingat12hand0.5h,respectively,butonlyverylowexpressionlevelswereobservedundercoldstress;thePeDREB1Awasstronglyrespondedtocoldstress,3hreachedtothepeak,butslightlyrespondedtodroughtstressandsalttreatment;inroots,transcriptsofPeDREB2Aweredown-regulatedunderthesethreestresstreatments,andtheexpressionofPeDREB1Awasinitiallyraised,thendroppedunderthesethreeabioticstresses.(4)OverexpressionofPeDREB2AorPeDREB1AgeneinArabidopsisshowedthatthetransgenicplantshaveseveralcharacterizationofcoldandsaltresistanceinculturemediums,forexample,thetransgenicplantsleavesstillremaingreenundercoldcondition,andthetransgenicplantseedsisspeedlygerminationandseedingshasarelativelargenumberoflateralroots.Thisstudyisafirmfoundationforrevealingthemolecularmechanismofmosobamboostresstolerance,theinformationproducedfromthisstudymaybevaluableinovercomingchallengesincultivatingmosobamboo.Keywords:MosoBamboo,AP2/ERFfamilytranscriptfactors,abioticstress,DREB.IV 目录摘要...........................................................................................................................................IABSTRACT...............................................................................................................................III第一章绪论..............................................................................................................................11.1研究背景..............................................................................................................................11.2国内外研究现状..................................................................................................................21.2.1转录因子简介..................................................................................................................21.2.2植物转录因子的结构......................................................................................................21.2.3植物转录因子的分类及其调控......................................................................................41.2.4AP2/ERF转录因子.........................................................................................................61.3研究目标和主要研究内容................................................................................................121.3.1关键的科学问题与研究目标........................................................................................121.3.2主要研究内容................................................................................................................121.4项目来源和经费支持........................................................................................................121.5技术路线............................................................................................................................13第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析......................................................142.1分析方法............................................................................................................................142.1.1毛竹AP2/ERF转录因子鉴定......................................................................................142.1.2毛竹AP2/ERF转录因子家族基因进化关系、基序和结构分析..............................142.1.3水稻和毛竹AP2/ERF家族基因的进化模式和分离时间分析..................................152.1.4毛竹DREB亚家族基因潜在启动子区域分析...........................................................152.2结果....................................................................................................................................162.2.1毛竹AP2/ERF转录因子的鉴定..................................................................................162.2.2毛竹AP2/ERF转录因子家族基因进化关系分析......................................................162.2.3毛竹AP2/ERF转录因子家族基因结构和保守基序分析..........................................17V 2.2.4毛竹AP2/ERF家族各Group的鉴定..........................................................................202.2.5毛竹AP2/ERF转录因子家族基因进化模式及分离时间分析..................................222.2.6毛竹DREB亚家族基因潜在启动子区域分析...........................................................262.3讨论....................................................................................................................................272.4小结....................................................................................................................................30第三章毛竹DREB亚家族基因表达模式分析...................................................................313.1材料与方法........................................................................................................................313.1.1植物材料........................................................................................................................313.1.2TRIZOL法提取总RNA及cDNA第一链的合成......................................................313.1.3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）................................................................................313.2结果....................................................................................................................................323.3讨论....................................................................................................................................333.4小结....................................................................................................................................35第四章毛竹PEDREB2A和PEDREB1A基因的克隆及功能验证.....................................364.1材料与方法........................................................................................................................364.1.1植物材料........................................................................................................................364.1.2目的基因克隆及转化....................................................................................................364.1.3目的基因生物信息学分析............................................................................................374.1.4目的基因组织特异性表达检测....................................................................................374.1.5目的基因胁迫响应表达模式分析................................................................................384.1.6植物表达载体的构建....................................................................................................384.1.7转基因植株转化............................................................................................................384.1.8转基因植株筛选............................................................................................................384.1.9转基因拟南芥植株检测................................................................................................394.1.10T3代转基因拟南芥纯合体植株筛选........................................................................394.1.11模拟干旱胁迫筛选抗旱转基因拟南芥株系..............................................................394.1.12盐胁迫筛选抗盐转基因拟南芥株系..........................................................................39VI 4.1.13低温胁迫筛选抗寒转基因拟南芥株系......................................................................404.2结果....................................................................................................................................404.2.1目的基因的克隆............................................................................................................404.2.2目的基因的生物信息学分析........................................................................................414.2.3目的基因的组织特异性表达检测................................................................................514.2.4干旱处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化..........................................524.2.5低温处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化..........................................524.2.6盐处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化..............................................544.2.7PeDREB2A和PeDREB1A过表达载体的构建...........................................................554.2.8转基因拟南芥纯合体株系的筛选................................................................................574.2.9转基因拟南芥胁迫响应功能验证................................................................................584.3讨论....................................................................................................................................584.4小结....................................................................................................................................63第五章结论与展望................................................................................................................645.1结论....................................................................................................................................645.2展望....................................................................................................................................65参考文献....................................................................................................................................66附录............................................................................................................................................83在读期间的学术研究..............................................................................................................105致谢..........................................................................................................................................106VII 表目录表4-1PeDREB2A和PeDREB1A蛋白氨基酸含量...............................................................43表4-2PeDREB2A和PeDREB1A蛋白序列的亚细胞定位...................................................44表B-1鉴定的121个毛竹AP2/ERF家族基因.....................................................................89表B-2毛竹AP2/ERF亚家族基因.........................................................................................93表B-3毛竹PeAP2/ERF家族转录因子保守基序（CMPes）.............................................96表B-4毛竹DREB亚家族基因启动子区域非生物胁迫相关顺式作用元件数统计........100表B-5qRT-PCR基因表达研究所用到的上游引物和下游引物........................................104VIII 图目录图1-1毛竹AP2/ERF基因家族分析及DREB类转录因子表达研究技术路线..................13图2-1毛竹AP2/ERF家族基因的无根进化树和内含子/外显子结构图.............................18图2-2拟南芥、水稻和毛竹AP2/ERF家族各亚家族以及各Group成员数比较..............19图2-3拟南芥、水稻和毛竹ERF亚家族各Group基因保守基序......................................23图2-3拟南芥、水稻和毛竹ERF亚家族各Group基因保守基序（续）..........................24图2-4拟南芥、水稻和毛竹AP2和RAV亚家族以及Soloist基因保守基序....................25图2-5从相对Ks和Ka/Ks的频率分布模式分析毛竹和水稻的AP2/ERF家族基因的Ks和Ka/Ks值................................................................................................................................26图3-1毛竹DREB亚家族基因在干旱、低温和盐处理下在叶片和根中表达量热图.......33图4-1PeDREB2A和PeDREB1A基因PCR产物电泳.........................................................41图4-2pMD18T-PeDREB2A和pMD18T-PeDREB1A双酶切电泳......................................42图4-3PeDREB2A和PeDREB1A蛋白质疏水性分析...........................................................45图4-4PeDREB2A和PeDREB1A蛋白信号肽序列预测分析...............................................46图4-5PeDREB2A和PeDREB1A蛋白磷酸化位点分布.......................................................47图4-6PeDREB2A和PeDREB1A核酸序列及其推导出的氨基酸.......................................49图4-7PeDREB2A，PeDREB1A和拟南芥DREBs基因构建的进化树...............................50图4-8PeDREB2A（A）和PeDREB1A（B）蛋白序列的AP2/ERF保守结构域氨基酸序列分别与拟南芥GroupA6和A4的氨基酸序列比对..............................................................51图4-9PeDREB2A和PeDREB1A基因的组织特异性表达...................................................52图4-1020%PEG6000不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在叶片中相对表达量......53图4-1120%PEG6000不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在根中相对表达量..........53图4-124℃不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在叶片中相对表达量..........................54图4-134℃不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在根中相对表达量..............................54图4-14250mmol/LNaCl不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在叶片中相对表达量55IX 图4-15250mmol/LNaCl不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在根中相对表达量....55图4-16pCAMBIA2300-PeDREB2A和pCAMBIA2300-PeDREB1A双酶切电泳.............56图4-17pCAMBIA2300-PeDREB2A和pCAMBIA2300-PeDREB1A表达载体框架.........56图4-18在卡纳霉素平板上筛选PeDREB2AT0代转基因拟南芥幼苗..............................57图4-19在卡纳霉素平板上筛选PeDREB1AT0代转基因拟南芥幼苗...............................57图4-20PeDREB1AT3转基因拟南芥7d大小幼苗培养基中盐胁迫处理.......................59图4-21PeDREB2AT3转基因拟南芥7d大小幼苗培养基中盐胁迫处理.......................59图4-22PeDREB2A和PeDREB1AT3代转基因拟南芥种子播种培养基中盐胁迫处理..60图4-23PeDREB1A转基因拟南芥幼苗经4℃低温胁迫处理...............................................60图4-24PeDREB2A转基因拟南芥幼苗经4℃低温胁迫处理...............................................61图A-1毛竹116个PeAP2/ERF蛋白序列的AP2/ERF保守结构域的氨基酸序列比对....83图A-2拟南芥、水稻和毛竹AP2/ERF家族结构域氨基酸序列无根进化树.....................88X 第一章绪论第一章绪论1.1研究背景毛竹（Phyllostachysedulis）是禾本科（Grammineae）竹亚科（Bambusoideae）刚竹属（Phyllostachys）多年生喜温常绿植物，毛竹主要分布于长江以南的地区，包括浙江、福建、湖南、江西、四川等20多个省市。中国是毛竹的故乡，生长着约全球85%的毛竹。它是我国栽植面积最大、分布范围最广、生长最快、应用最广泛的经济竹种，可食用，可造纸，可作为建筑、家具、农具以及工艺品用材，有着广泛的发展前景（朱石麟等，1994；江泽慧，2002；Pengetal.，2013b）。但自然界中存在各种各样的环境胁迫（生物胁迫和非生物胁迫），不仅影响毛竹的生长发育，如出笋量、竹材材质，而且限制毛竹的分布范围，我国秦岭淮河以北地区几乎无毛竹生长，这样严重限制着毛竹的经济和生态价值。水分胁迫对毛竹幼苗光合、荧光特性及水分利用效率均有影响，随着胁迫程度的增加，光合速率和蒸腾速率显著降低，从而影响毛竹幼苗的生长发育（应叶青等，2009；应叶青等，2011a）。自然低温下，毛竹1年生和2年生实生苗的耐寒性较低，随着生长时间的增加其耐寒性逐渐增强（应叶青等，2011b），但冰冻灾害对毛竹林生态系统破坏严重，如翻蔸、折断、破裂等伤害（苏文会等，2008；杨灌英等，2008；李伟成等，2008）。毛竹在高盐浓度下种子发芽率降低，幼苗外部形态特征伤害严重，甚至造成死亡（黄业伟等，2009）。因此，对毛竹抗逆性研究，培育抗逆性强的毛竹品种，具有重大的应用价值和意义。近些年来，科研工作者们在许多植物中发现了大量的AP2/ERF家族转录因子，并进行转基因以验证其功能，如拟南芥DREB2A基因转大豆中能提高其耐旱性（Engelsetal.，2013），小米SiARDP基因转拟南芥和小米中能增强其耐盐性和耐旱性（Lietal.，2014），棉花GhERF12基因转拟南芥影响其生长发育（Zhouetal.，2013）。对毛竹抗逆分子机制的研究较晚，Liu等人2011年和2012年从毛竹幼苗中分离和克隆了两个DREB基因，分别是冷胁迫响应基因peDREB1和干旱胁迫响应基因peDREB2（Liuetal.，2011，2012）；1 第一章绪论Peng等人2013年发布了毛竹基因组草图，极大的推进了毛竹分子机制的研究（Pengetal.，2013）为毛竹抗逆分子机理研究奠定了基础。本研究在毛竹基因组草图的基础上，对毛竹AP2/ERF家族转录因子进行了生物信息学分析，研究了干旱、低温和盐胁迫下毛竹DREB亚家族转录因子的表达模式，克隆了两个新的毛竹DREB基因（PeDREB1A和PeDREB2A），构建了植物表达载体，并转化了拟南芥以对目的基因进行功能验证。1.2国内外研究现状1.2.1转录因子简介转录因子即发挥正调控作用的反式作用因子，在分子生物学中，是指能够专一性结合靶基因上游特异核苷酸序列的蛋白质分子，这些蛋白质的主要功能是激活或抑制靶基因的转录，以此确保靶基因能以特定的强度、于特定时空转录表达。转录因子在基因表达过程中发挥着非常重要的作用，如染色质重组，补充或者稳定聚合酶Ⅱ转录起始复合物等。根据转录因子的不同功能，可将其划分为以下四种类型：第一类转录因子指的是激活子或抑制子，这些蛋白质结合启动子中特定的DNA序列，从而导致特定基因的调控表达；第二类转录因子指的是共激活子或者共抑制子，此类蛋白质的作用是介导特定的激活子或抑制子的转录过程，此类蛋白质本身是不能结合DNA序列的，而是通过与特定的激活子或抑制子以蛋白-蛋白互作的方式进行的；第三类包含了一般的转录因子，是聚合酶Ⅱ转录起始复合物的重要组成成分；第四类是结构转录因子，主要参与DNA的重组改造过程，如诱导DNA链弯曲以增强其他蛋白质与其启动子结合的能力（Singh，1998）。1.2.2植物转录因子的结构转录因子的功能、核定位以及与特定DNA特异瞬时的结合和表达调控作用等皆依赖于转录因子高度保守的功能结构域（MeshiandIwabuchi，1995；liuetal.，1999），通常2 第一章绪论情况下，植物转录因子包含四个功能结构域：DNA结合域（DNA-bindingdomain），转录调控域（transcriptionregulationdomain），寡聚化位点（oligomerizationsite）和核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS）。1.2.2.1DNA结合域DNA结合域（DNA-bindingdomain）指的是转录因子特异识别DNA序列的顺式作用元件，且与顺式作用元件特异结合的氨基酸序列片段，同一家族或同一类型的转录因子的DNA结合域的氨基酸残基序列是比较保守的，所以DNA结合域是转录因子功能特异性的决定区域（Huangetal.，1996；刘强等，2000）。高等植物中已被报道的转录因子的DNA结合域包括：AP2/ERF结构域（Sunetal.，2014；Lataetal.，2014）、bZIP结构域（Hwangaetal.，2014；Llorcaetal.，2014）、MADS结构域（Muiñoetal.，2014；Espinosa-Sotoetal.，2014）、MYB结构域（Yanetal.，2014；Strackeetal.，2014；Hanetal.，2014）、MYC结构域（Chicoetal.，2014；Hanetal.，2014）、WRKY结构域（Llorcaetal.，2014；Wenetal.，2014）、锌指结构域（Jiangetal.，2014；Hanetal.，2014）等。1.2.2.2转录调控域转录调控域（transcriptionregulationdomain）有两种类型，一类为转录激活区，一类为转录抑制区，多位于DNA结合区域外的30-100个氨基酸残基的位置，部分转录因子可能含有两个或两个以上转录调控域，这也是不同转录因子具有功能差异的原因之一，转录激活区大多存在于蛋白序列的N-末端区域，其富含酸性氨基酸、谷氨酰胺或脯氨酸（Yanagisawaetal.，1998）。转录因子通过激活或抑制靶基因的转录来发挥激活或抑制作用。转录因子可能通过同其他转录因子对相同的顺式作用元件竞争而发挥其抑制作用。此外，也有可能通过调控作用使转录因子的结构发生二聚化，从而掩盖其转录调控域，或者转录调控域与转录因子互作等作用机制而起着激活或抑制作用（Chernetal.，1996）。1.2.2.3寡聚化位点寡聚化位点（oligomerizationsite）就是指不同的转录因子之间借以互相起作用的功能区域，其氨基酸序列的保守性极高。大多数的寡聚化位点通过与DNA结合域相连而构建成一定的空间构象，比如，b/HLH类转录因子的寡聚化位点的结构为螺旋-环-螺旋结构，bZIP类转录因子的寡聚化位点的典型结构是一个拉链结构，MADS类转录因子的寡聚化位点的结构是由两个α-螺旋和两个β-折叠构成的（杨致荣等，2004）。3 第一章绪论寡聚化位点主要通过空间构象的变化而形成多样的转录机制，以使转录因子发挥调控目的基因表达的功能。植物转录因子通常形成同聚物或异聚物，从而影响DNA与靶基因的特异性结合、与启动子元件的亲和（Katagirietal.，1992；Guiltinanetal.，1994）以及核定位功能（Sainzetal.，1997）等。高等植物典型的转录因子大多含有寡聚化位点，但并不是所有的转录因子中都含有寡聚化位点。1.2.2.4核定位信号核定位信号区（nuclearlocalizationsignal，NLS）是转录因子中富含精氨酸（Ariginine，A）和赖氨酸（Lysine，K）残基的区域，该区域主要控制转录因子进入细胞核的过程（Imagawaetal.，2000）。水稻GT-2（Deheshetal.，1995），玉米Opaque2（Varagonaetal.，1994）等多种高等植物的转录因子的核定信号已经被鉴定出来，其在转录因子定位于细胞核并在细胞核中发挥作用具有至关重要的作用。转录因子的活性与核定位信号有着重要的联系，不同类型的转录因子其核定位信号的数量、序列及其在植物组织器官的分布存在一定的差异，比如，O2转录因子的核定位信号区存在于其他的功能区域内（刘强等，2000）。1.2.3植物转录因子的分类及其调控根据转录因子结合域的类型，植物转录因子可被划分为如下几类：bZIP（碱性亮氨酸拉链）蛋白、bHLH（碱性螺旋-环-螺旋）蛋白、homeobox蛋白、MADS-box蛋白、Myb蛋白、HSF蛋白、zine-figure转录因子、AThook转录因子、AP2/ERF转录因子等（Singh，1998；SchwechheimerandBevan，1998）。bZIPs转录因子主要调控植物中枢系统的发育和生理过程，包括形态的发生、种子的形成、非生物与生物胁迫。改变植物bZIP基因的表达模式及其活性常导致各种信号途径的激活且调控不同生理过程（Muriloetal.，2013）。bHLH转录因子主要调控植物的生长，活性物质的生物合成和响应环境变化的过程，如黄酮类、生物碱类和萜类化合物等的合成（Zhangetal.，2014），又如其对干旱胁迫的响应（Alvesetal.，2014）。Homeobox蛋白在胚胎发育早期决定真核生物细胞的分化和发育方向，为植物特有的转录因子（Chewetal.，2013）。HD-Zip（HomeodomainLeucineZipper）转录因子属于4 第一章绪论Homeobox蛋白，其包含高度保守的HD（Homeodomain）和亮氨酸拉链（Zip）元件。HD元件特异结合DNA序列，亮氨酸拉链元件调节二聚化的形成。根据蛋白结构特点，HD-Zip转录因子可被划分为四个亚家族，即HD-ZipI-IV，参与植物不同的生物过程，包括生长和发育，光形态的发生，花发育，果实的成熟，以及环境胁迫的适应响应。植物胁迫响应相关的目标基因由HD-Zip转录因子通过对外界环境变化信号和内源激素信号途径的整合而诱导表达，从而使植物对外界环境中存在的各种胁迫的适应性得到一定程度的提高（Wangetal.，2013）。基于进化的起源，MADS-box转录因子可被分为typeI和typeII。植物特有的typeIIMIKCMADSbox转录已被深入研究，其在调控植物发育过程中发挥重要的作用，如分生组织的特性，花发育时间，果实和种子的发育。相比之下，typeIMADSbox转录因子的研究就较少，长期以来未被重视。目前，大量的研究显示typeIMADSbox转录因子在植物繁殖过程中发挥重要的调控作用，尤其在决定雌配子体，胚胎和胚乳发育的过程中。这也表明typeIMADSbox转录因子对物种间生殖界线的形成有决定作用（Masieroetal.，2011）。MYB转录因子家族是一个较大的转录因子家族，参与控制多种生物程序，如响应生物和非生物胁迫、发育、分化、新陈代谢、防御等（Ambawatetal.，2013）。目前关于植物Hsfs转录因子功能的研究仍然很有限，但对不同的Hsfs转录因子的功能详加分析，发现其功能多样且在基因敲除突变体植株中其作用不可替代，且对复杂的胁迫信号和响应网络有集成作用。HsfA2和HsfA9分别说明了Hsfs转录因子具有耐热性和促进种子成熟的作用（Scharfetal.，2012）。Zine-figure转录因子是一类具有手指状结构域的蛋白质，其结构域由锌离子和数个半胱氨酸或组氨酸构成，锌离子在蛋白结构稳定和功能调节方面发挥着重要的作用。植物zine-figure转录因子参与植物重要的调控过程，如形态建成、花粉发育、胁迫响应以及胚发育等（向建华等，2012；韩莹琰等，2011）。AThook转录因子在农业生产方面发挥着巨大的作用，如增加幼苗的成活率、提高植物生物量的积累、改善植株的免疫力（Zhaoetal.，2014）。5 第一章绪论植物AP2/ERF转录因子是一个成员数众多的大基因家族，是植物特有的转录因子。AP2/ERF转录因子可参与植物生长发育、花发育、果实发育、种子发育，以及机械伤害、病菌侵害、高盐、干旱、低温等生物与非生物胁迫响应等多种生物学过程。AP2/ERF转录因子也参与多种植物激素信号转导途径，如脱落酸、水杨酸、乙烯、茉莉酸等途径，而且在逆境信号交叉途径中起连接因子的作用（张计育等，2012）。1.2.4AP2/ERF转录因子AP2/ERF转录因子家族是植物体响应胁迫表达并调控胁迫诱导目标基因表达的重要的转录因子家族之一。Jofuku（1994）等首次报道了AP2基因，含有AP2/ERF保守结合域两个，并与拟南芥花发育有关（Jofukuetal.，1994）。Ohme-Takagi（1995）等在烟草中发现了EREBP蛋白，该蛋白与乙烯响应元件结合（Ohme-Takagietal.，1995）。随后，Zhou等于1997年用西红柿抗病蛋白Pto做酵母双杂实验时，得到了三个蛋白，分别是Pti-4，Pti-5和Pti-6，每个蛋白都含有一个AP2/ERF保守结构域，与Jofuku（1994）和Ohme-Takagi（1995）的结果一致（Zhouetal.，1997）。因此，将含有AP2/ERF结构域的一类基因命名为AP2/ERF超家族基因（Akhteretal.，2011）。1.2.4.1AP2/ERF转录因子分类根据AP2/ERF转录因子所包含的AP2/ERF结构域数，及其结构域氨基酸序列的同源性，可被分为4个亚家族：AP2、RAV、ERF和soloist（Nakanoetal.，2006）。AP2亚家族蛋白通常包含两个AP2/ERF结构域，在两个结构域之间由25个保守的氨基酸残基连接（Riechmannetal.，1998；Licausietal.，2010）。AP2转录因子在调控植物生长发育过程中发挥着重要的作用，包括叶表皮细胞特性（Mooseetal.，1996）、花和胚珠的发育（Aukermanetal.，2003；Dinhetal.，2012）、小穗分生组织的决定（Chucketal.，1998）以及种子的生长（Jofukuetal.，2005；Ohtoetal.，2009）。RAV亚家族蛋白包含一个AP2/ERF结构域和一个B3结构域（Giraudatetal.，1992；Suzukietal.，1997；Kagayaetal.，1999；Huetal.，2011），在响应乙烯（Alonsoetal.，2003）、油菜素内酯（Huetal.，2004）以及生物和非生物胁迫（Sohnetal.，2006；Lietal.，2011）过程中调节靶基因的表达方面发挥极其重要的作用。ERF亚家族和soloist蛋白只包含一个AP2/ERF结构域，而ERF亚家族根据其AP2/ERF结构域的结构特点，可被划分为两6 第一章绪论个亚家族，ERF和CBF/DREB（Nakanoetal.，2006）。ERF亚家族蛋白可以识别GCC盒（AGCCGCC），在响应生物胁迫过程中发挥着特殊的作用，比如病原菌入侵和疾病刺激（Haoetal.，1998）。CBF/DREB亚家族蛋白能专性识别低温和干旱诱导响应顺式作用元件（DRE/CRT，A/GCCGAC），在响应非生物胁迫过程中调控目的基因的表达从而提高植物对非生物胁迫的耐逆性（Hongetal.，2009）。ERF亚家族结构域的第14位氨基酸和第19位氨基酸分别是缬氨酸（V）和谷氨酸（E），而CBF/DREB亚家族相应位置的氨基酸则是丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），这是ERF亚家族和CBF/DREB亚家族之间的主要区别之一（Sakumaetal.，2002）。1.2.4.2AP2/ERF保守结构域AP2/ERF保守结构域由60-70个氨基酸残基组成，其包含两个非常保守的作用元件：YRG元件和RAYD元件。YRG元件位于结构域的N-末端，由约20个氨基酸残基组成，其富含碱性氨基酸和亲水性氨基酸。由于富含碱性氨基酸的特点可推测YRG元件在DNA结合过程中的作用是使AP2/ERF转录因子直接接触DNA（Okamuroetal.，1997）。RAYD元件由约40个氨基酸残基组成，位于AP2/ERF结构域的C-末端，并包含一个由18个氨基酸残基组成的区域可形成一个双亲性的α螺旋，这个元件在结构域的结构和功能方面可能具有重要的作用（Jofukuetal.，1994；Okamuroetal.，1997）。RAYD元件可能通过α螺旋调节蛋白与蛋白之间的互作或是通过α螺旋的疏水面与DNA的大凹槽互作。DRE元件结合的AP2/ERF结构域所包含的特殊的氨基酸残基可能决定着它们之间的结合能力（Jofukuetal.，1994；Okamuroetal.，1997；Kizisetal.，2001；Sakumaetal.，2002）。在AP2亚家族转录因子中，存在两个AP2/ERF结构域，由一个25个氨基酸残基组成的序列连接这两个片段。这个连接序列在所有AP2亚家族蛋白成员中都高度保守，并且在AP2/ERF结构域功能方面发挥重要的作用，如连接序列突变将消除蛋白对DNA的结合（Klucheretal.，1996）。在第一个AP2/ERF结构域中有一个由10个氨基酸组成的插入片段，这种现象存在于特定的AP2/ERF转录因子中，如AtBBM、BnBBM和ANT等蛋白，而在其他AP2/ERF转录因子中不存在，如AP2和Gl15（Boutilieretal.，2002）。这些重要的连接序列可能最先源于DNA结合域的定位功能（Wolfeetal.，2000）。7 第一章绪论1.2.4.3AP2/ERF转录因子的功能（1）AP2亚家族转录因子功能大量研究结果指出，AP2亚家族转录因子的功能为调控植物的花发育过程，与其他花发育相关基因相互关联而调控花器官的形成与发育（Byzovaetal.2013；Lietal.，2014；Farisetal.2014）。前人在拟南芥同源异型突变体的花及其花发育相关基因的研究基础上，发现转录因子编码四类同源异型基因，A、B、C和E，以共同协作的方式控制恰当的花器官的识别。其中A类基因APETALA2（AP2）促进螺旋型1和螺旋型2花识别萼片和花瓣，且抑制螺旋型1和螺旋型2花的C类基因AGAMOUS（AG）的表达（Dinhetal.2012）。AP2转录因子通过物理地招募共抑制子TOPLESS和组蛋白脱乙酰酶HDA19来抑制目的基因的转录表达，不仅抑制C类基因的表达，也限制B类基因APETALA3和PISTILLATA以及E类基因SEPALLATA3的表达范围（Kroganetal.，2012）。从睡莲（Nymphaeasp.cv.‘YellowPrince’）中克隆的NsAP2基因，RNA原位杂交结果显示其转录产物存在于花原基的所有区域，在成花器官原基中表达量最高。花器官分化后，NsAP2在萼片和花瓣中转录产物积累量高，而在雄蕊和心皮中表达量低。超表达NsAP2转基因拟南芥花瓣增多，植株增高，说明NsAP2基因在睡莲花器官发生和促进植株高生长方面发挥作用（Luoetal.，2012）。在奇异果‘Pukekohedwarf’突变体的畸形花中检测到AP2转录产物积累增加，此畸形花的花被螺旋且延展成花瓣，与正常奇异果花相比，此畸形花花被发育过程中没有miR172积累（Varkonyi-Gasicetal.，2012）。这说明AP2基因对花器官发育的识别与miR172的表达量有着非常密切的联系。AP2转录因子不仅在花器官识别方面发挥重要的作用，且在花授粉、开花时间、穗颈节间长、种子的发育、干细胞的维持，以及控制细胞的扩张方面发挥重要的作用（Farisetal.，2014；Liuetal.，2012；Kurdyukovetal.，2014；Kuluevetal.，2012）。（2）RAV亚家族转录因子功能在拟南芥中，RAV基因在控制开花过程中发挥着很重要的调控作用（Luisetal.，2014）。拟南芥TEM1（TEMPRANILLO1）和TEM2基因属于RAV亚家族转录因子基因，其作用主要是通过负调控两条分子成花途径的产物以推迟开花，这两条途径分别是：FLOWERINGLOCUST（FT）途径和赤霉素途径。通过这两个途径，TEM1和TEM2即可防止植株提早开花，也能抑制成花诱导，待植株营养储量足够确保后代正常生存时才会诱导植株开花（Fornaraetal.，2010；Wellmerand8 第一章绪论Riechmann，2010；CastillejoandPelaz，2008；Osnatoetal.，2012）。控制植株开花并不是RAV转录因子唯一的功能，此亚家族基因在植物其他发育方面也发挥着一定的功能，如树芽的形成和叶片的衰老，也可能调节植株的正常生长，还可响应生物胁迫和非生物胁迫（Luisetal.，2014；Wooetal.，2010）。拟南芥RAV1，RAV1L和RAV2三个基因突变体植株在生长发育早期促进生长，而RAV1超表达植株对ABA不敏感且生长受到严重的抑制，呈半矮生状。在干旱条件下，RAVs超表达植株蒸腾失水量显著高于野生型植株。在盐胁迫环境下，RAVs超表达株系种子发芽率比野生型种子低，然而，ravs突变体植株则促进种子的萌芽（Fuetal.，2014）。这些结果表明RAVs基因在植株生长和非生物胁迫（干旱和盐）过程中起多功能负调控子的作用，其负调控作用可能通过不依赖ABA途径进行的。青枯病即细菌性枯萎病，是全世界最严重的细菌性疾病，番茄（Solanumlycopersicum）SlERFs基因在AtCBF1和PR基因之间通过SlRAV基因介导发挥中间转录因子的作用，从而增强西红柿青枯病抗性（Lietal.，2011）。大豆（Glycinemax）GmRAV基因超表达转基因烟草的细胞分裂素信号途径相关表现增多，包括植株矮小，抑制顶端优势，寿命延长，侧芽增多，叶片小且深绿色，抑制根系生长，抑制长日照和短日照开花，以及改变对昼长的敏感性。反之，沉默GmRAV基因植株则表现出相反的表型（Zhaoetal.，2012）。由此可推断出GmRAV基因基因在细胞分裂素和光周期信号途径中发挥着关键的作用，从而调控植株的发育过程。（3）ERF亚家族转录因子功能ERF亚家族转录因子可被分为两个亚家族，ERF和CBF/DREB。其中ERF亚家族转录因子在植物响应生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥极其重要的作用，通过响应胁迫诱导下游胁迫相关基因的表达或依赖或不依赖植物激素信号转导途径提高植物的抗逆性。番茄Pti5基因通过不依赖乙烯信号转导途径抵御蚜虫的伤害（Wuetal.，2015）。拟南芥在遭受鳞翅类昆虫的幼虫侵害后，一系列ERF转录因子基因大量表达（Rehrigetal.，2014）。小麦（Triticumaestivum）TaPIE1基因通过激活下游乙烯信号转导途径中防御和胁迫相关基因的表达来抵御小麦纹枯病和冰冻胁迫（Zhuetal.，2014）。辣椒（Capsicumannuum）感染青枯病后CaERF5基因被诱导大量表达，在植物抵抗青枯病感染过程中发挥正调控的作用（Laietal.，2014）。大麦（Hordeumvulgare）中WRKY和ERF基因可能共同参与细菌防御反应，而其防御过程与水杨酸无关9 第一章绪论（Deyetal.，2014）。烟草（Nicotianatabacumcv.XanthiNN）N基因可抵御烟草花叶病毒（TMV），NtERF1-1基因在烟草感染烟草花叶病毒后表达量上调，据此可推断出NtERF1-1基因可能参与N基因和烟草花叶病毒之间互相作用诱导防御响应的信号转导途径（Gaoetal.，2014）。大量研究表明，ERFs基因响应干旱、低温、盐和各种植物激素大量表达，如苜蓿（Medicagosativa）MsERF8响应上述胁迫表达（Chenetal.，2012），小麦TaERF3基因在盐和干旱胁迫条件下发挥正调控的作用（Rongetal.，2014），番茄Sl-ERF.B.3基因受低温、高温和水淹胁迫诱导表达，而在盐和干旱胁迫下发挥负调控的作用（Klayetal.，2014），橡胶树（Heveabrasiliensis）HbERF1基因受ABA、MeJA、SA和ethylene（ETH）激素的诱导，是乙烯响应基因和耐旱性基因的正调控子（Anetal.，2014），拟南芥RAP2.12基因在低氧环境下可被诱导表达（Kosmaczetal.，2014），辣椒CaERF5基因在青枯病感染、水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯胁迫处理下诱导表达（Laietal.，2014），硬质小麦（TriticumturgidumL.subsp.durum）TdERF1基因受盐胁迫、ABA、乙烯、植物生长激素和水杨酸调控，可能在植物激素信号途径交汇处发挥作用（Makhloufietal.，2014）。ERFs基因不仅通过分子机制调控植物的耐逆性，也通过生理生化物质的变化调控植株的耐逆性和生长（Huetal.，2014；Sunetal.，2014；Wangetal.，2014）。还有研究表明ERFs基因在花脱落前和花脱落时的花梗离层区发挥着重要的转录调控作用（Nakanoetal.，2014）。CBF/DREB转录因子的主要功能是响应非生物胁迫而大量积累，如抗旱、抗寒、抗高温和抗盐碱等。新疆野苹果（Malussieversii）MsDREB2C基因是组成型表达基因，受干旱、低温、高温、盐和ABA诱导高表达（Zhaoetal.，2013）。独行菜属兰蒂（LepidiumlatifoliumL.）LlCBF基因在高盐、干旱和低温胁迫下发挥正调控的作用（Akhtaretal.，2013）。栽培小麦RcDREB1基因可被高盐、干旱、重金属（CdCl2）和低温诱导上调表达，但在盐胁迫下显著上调表达（Zhaoetal.，2013）。小麦的三个祖先A、B和D基因组的Dreb2基因被不同程度的干旱胁迫诱导表达（Tavakoletal.，2014）。油菜（BrassicacampestrisL.）DREB2A基因响应干旱、盐和低温三种胁迫诱导表达量增加（Alizadehetal.，2014）。河北杨（PopulusXhopeiensisHu&Chow）PhCBF4a和PhCBF4b基因主要被干旱、低温和高盐诱导上调表达（Wangetal.，2014）。生菜（Lactucasativa）LsDREB2A基因在高渗和高盐胁迫处理下基因表达量显著增加，而在低温、高温和ABA处理下表达10 第一章绪论量不变化（Kudoetal.，2014）。构树（Broussonetiapapyrifera）BpDREB2基因受干旱和高盐诱导显著表达，但在ABA和低温胁迫下表达量变化不显著（Sunetal.，2014）。野牛草（Buchloedactyloides）BdDREB2基因响应高盐和干旱胁迫诱导表达（Zhangetal.，2014）。沙漠大豆（Eremospartonsongoricum）EsDREB2B基因的转录产物被各种非生物胁迫诱导积累，包括干旱、盐、低温、高温、重金属、机械伤害、氧化胁迫和外源ABA处理（Lietal.，2014）。CBF/DREBs基因在胁迫条件下表达量增加，激活下游胁迫相关基因的表达，促进植株的抗胁迫生理变化，从而提高植株的抗逆性。如多汁的盐生有腕莲子（SucculentHalophyteSalicorniabrachiata）SbDREB2A转基因烟草在高渗透胁迫下种子萌芽力和生长状况佳，表现出含水量高，膜稳定性强，电解质渗漏少。其转基因植株叶绿素含量高，水分利用效率和光和效率增加，脯氨酸含量升高，MDA和H2O2含量降低。应用qRT-PCR方法检测转基因植株在非生物胁迫下DREB转录因子下游热激基因（Hsp18，Hsp26和Hsp70），转录因子基因（AP2domaincontainingTF，HSF2和ZFP），信号转导基因（PLC3和Ca2+/calmodulin）和脱水基因（ERD10B，ERD10D和LEA5）的表达量都非常高（Guptaetal.，2014）。类似的功能也存在于以下植株中，包括花生（Arachishypogaea）、野牛草、富士苹果、甘蔗（Saccharumsinense）、拟南芥、大豆、土豆（Solanumtuberosum）、新疆野苹果等（Bhatnagar-Mathuretal.，2014；Zhangetal.，2014；Xueetal.，2014；Reisetal.，2014；Alizadehetal.，2014；Xuetal.，2014；Jiangetal.，2014；Bouazizetal.，2014；Zhaoetal.，2013）。植株受到非生物胁迫时，某些CBF/DREB基因在某些组织表达水平变化呈昼夜周期变化（Artlipetal.，2013；Marcolino-Gomesetal.，2013）。（4）Soloist转录因子功能Soloist是AP2/ERF转录因子家族的孤儿基因，在大多数植物中只有一个成员，如拟南芥，水稻等。拟南芥Soloist基因At4g13040在茉莉酸甲酯生物合成中起着正调控的作用，在茉莉酸甲酯积累的上游途径发挥作用（Girietal.，2014）。目前关于AP2/ERF家族Soloist基因功能的研究还很少。11 第一章绪论1.3研究目标和主要研究内容1.3.1关键的科学问题与研究目标关键的科学问题：探讨胁迫条件下毛竹的抗逆分子机制。研究目标：分离毛竹中编码胁迫响应蛋白的基因，并研究胁迫响应基因的功能。1.3.2主要研究内容（1）毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析；（2）毛竹DREB亚家族基因表达模式分析；（3）毛竹PeDREB1A和PeDREB2A基因的克隆及功能验证。1.4项目来源和经费支持本研究得到以下项目支持：（1）国家863项目子课题“毛竹功能基因组学研究””（2013AA102607-4）；（2）国家林业局948项目“RNAi干扰竹子功能基因研究应用技术引进”（2014-4-74）；（3）国际竹藤中心基本科研业务费重点项目（1632011004）。12 第一章绪论1.5技术路线图1-1毛竹AP2/ERF基因家族分析及DREB类转录因子表达研究技术路线Fig.1-1IndexSystemforAnalysisofAP2/ERFGeneFamilyandExpressionofDREBTranscriptFactorsinPhyllostachysedulis13 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析2.1分析方法2.1.1毛竹AP2/ERF转录因子鉴定以拟南芥和毛竹AP2/ERF蛋白序列为种子序列，在毛竹基因组序列网站（http://www.ncgr.ac.cn/bamboo）（Pengetal.，2013a）和NCBI数据库网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）中搜索毛竹基因组中所有含有AP2/ERF结构域的基因。将已查找到的AP2/ERF基因又作为索引序列在多种数据库中进行确认，以确保不遗漏任何一个AP2/ERF基因。所有符合要求的序列皆经过Pfam数据库（http://pfam.janelia.org/）（Puntaetal.，2012）、SMART数据库（http://smart.embl-heidelberg.de/）（Letunicetal.，2012）和NCBI的保守结构域数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）（Marchler-Baueretal.，2011）进行分析，以除去不含有AP2/ERF保守结构域的基因。应用ExPASy软件（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）确定AP2/ERF基因的CDS长度，编码氨基酸长度，分子量（MW）以及等电点（pI）。应用Softberry软件（http://linux1.softberry.com/）预测AP2/ERF基因的亚细胞定位情况。拟南芥AP2/ERF基因来自于拟南芥TAIR数据库（http://www.arabidopsis.org/），水稻AP2/ERF基因来自于密歇根州立大学MSU数据库和水稻基因注释项目数据库（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）。2.1.2毛竹AP2/ERF转录因子家族基因进化关系、基序和结构分析拟南芥、水稻和毛竹AP2/ERF转录因子的蛋白序列比对通过ClustalW1.83软件构建并在BioEdit软件中生成。拟南芥、水稻和毛竹AP2/ERF基因的无根进化树以及毛竹AP2/ERF基因的无根进化树都通过MEGA6.0软件（http://www.megasoftware.net/）（Tamuraetal.，2011）通过邻接法（NJ）构建（参数是Poissioncorrection，pairwisedeletion14 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析andbootstrap（1,000replicates；randomseeds））。AP2/ERF家族转录因子的聚类分析方法为Nakano等人报道的方法（Nakanoetal.，2006）。通过MEME网站（http://meme.sdsc.edu/meme/meme.html）（suiteversion4.9.1）鉴定AP2/ERF家族基因的保守基序（参数是optimumwidth10–200aminoacids，anynumberofrepetitionsofamotif，maximumnumberofmotifssetat25）（Chuetal.，2011；Baileyetal.，2006）。毛竹AP2/ERF转录因子家族基因结构分析是通过基因结构分析网站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）基于基因CDS序列和相应基因的基因组序列比对进行的，在基因组数据库中内含子嵌插在两个外显子中间。2.1.3水稻和毛竹AP2/ERF家族基因的进化模式和分离时间分析水稻和毛竹AP2/ERF家族的直系同源基因对和毛竹AP2/ERF家族的旁系同源基因对均应用软件ClustalW1.83进行蛋白序列比对。应用DnaSP（version5.10.1）（Libradoetal.，2009；Rozasetal.，2009）软件计算复制基因对之间的同义替换（Ks）和非同义替换（Ka）的值来评估基因重复事件的发生，同源基因的分离以及基因复制的选择压力。Ks值被认为是评估基因对重复事件发生时间的重要值，通过公式T=Ks/2λ来推算重复事件的发生时间，假定水稻和毛竹的时钟值（λ）均为6.5×10-9替换/同义替换/每年（Pengetal.，2013；Zhangetal.，2011；Caoetal.，2011）。2.1.4毛竹DREB亚家族基因潜在启动子区域分析找出毛竹DREB亚家族基因的转录起始位点上游2000bp序列，也就是潜在启动子区域，应用PLACE网站（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）（Higoetal.，1999）分析其中的顺式作用元件。15 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析2.2结果2.2.1毛竹AP2/ERF转录因子的鉴定在毛竹基因组中共获得了121个可能的AP2/ERF转录因子，它们皆包含一个或两个完整或不完整的AP2/ERF保守结构域。通过应用在线生物信息分析软件，分析和预测了各转录因子的基因长度、氨基酸残基数、分子量大小（MW）、等电点（pI）和亚细胞定位预测等信息，结果见表B-1。在121个AP2/ERF转录因子中，基因长度从309bp（PH01000069G0560）到1926bp（PH01001338G0140）不等；分子量最小的基因是PH01000069G0560，其大小为11.15kDa，分子量最大的基因为PH01001338G0140，大小为64.71kDa；等电点范围从4.45（PH01002652G0240）到11.07（PH01002393G0230）。通过亚细胞定位预测，发现119个基因可能定位于细胞核，2个基因（PH01003811G0100和PH01000443G0450）可能定位于叶绿体中。然而，在这121个转录因子基因中有5个基因（PH01000303G0100，PH01000028G1600，PH01002652G0240，PH01004233G0070和PH01195697G0010）由于含有一个非常短的AP2/ERF保守结构域而导致不能构建进化树，所以这5个基因不做进一步的分析。因此我们仅对116个AP2/ERF转录因子基因进行进化关系分析，本文中用基因组ID来表示基因名。2.2.2毛竹AP2/ERF转录因子家族基因进化关系分析为了确定毛竹116个AP2/ERF转录因子家族基因间的进化关系，对116个转录因子的AP2/ERF结构域氨基酸序列进行多序列比对，结果如图A-1。比对结果发现在116个AP2/ERF结构域氨基酸序列中存在17个保守氨基酸残基，包括4G，12G，18I，31L，32G，34T，41A，42A，44A，45Y，55D，57A，58A，63G，66A，72N和73F，这些氨基酸残基的保守比达到85%以上。对多序列比对结果分析，发现80个转录因子属于ERF亚家族转录因子，28个属于AP2亚家族转录因子，7个属于RAV亚家族转录因子，1个基因自成一族。由于这80个转录因子只包含一个AP2/ERF结构域且其同源性较高，所以将其划分为ERF亚家族转录因子。PH01000320G0460，PH01003811G0100和16 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析PH01004434G0040这三个蛋白，在其AP2/ERF结构域的C末端区域氨基酸序列与保守序列的同源性相对较低，故将其分类到GroupVI-L。在116个蛋白序列中有17个蛋白包含两个AP2/ERF结构域，其属于AP2亚家族成员。然而有11个蛋白虽只包含了一个AP2/ERF结构域，但其与AP2亚家族蛋白同源性极高，因此这11个蛋白也为AP2亚家族成员。从图中我们可以看到，其中有7个转录因子包含1个AP2/ERF结构域和1个B3结构域，所以将其归类为RAV亚家族转录因子。根据上述多序列比对结果，构建了一个由116个毛竹AP2/ERF转录因子的结构域氨基酸序列组成的无根进化树（如图2-1A），以及一个由135个拟南芥AP2/ERF，147个水稻AP2/ERF和116个毛竹AP2/ERF转录因子结构域氨基酸序列构成的无根进化树（如图A-2）。根据两个进化树关系分析，明确区分了AP2亚家族、RAV亚家族、GroupI–VI、VI–L和VII–X以及孤儿基因。GroupI–VI、VI–L和VII–X的成员数可见图2-2和表B-2。根据毛竹AP2/ERF基因内含子和保守基序的存在和位置对ERF亚家族Group进行分类分析，具体介绍请见2.2.4。在对毛竹AP2/ERF转录因子家族分类分析时，发现其可能存在以下四个特点：（1）毛竹AP2/ERF转录因子中可能不存在GroupIa，IIc，Vb，IXa和Xc成员；（2）毛竹AP2/ERF转录因子中GroupIIId，VIIa，VIIIa和Xb的成员数多于拟南芥和水稻同Group成员数，而其他Group成员数均低于拟南芥和水稻同Group成员数；（3）GroupVIIb存在于毛竹和水稻中，而GroupIIIa和Xb-L可能特异存在于拟南芥中；（4）毛竹中没有发现GroupXI–XIV，这些Group可能只存在于水稻中（见图2-2和表B-2）。2.2.3毛竹AP2/ERF转录因子家族基因结构和保守基序分析为了更深入的了解毛竹AP2/ERF基因的结构多样性，进一步分析了所有AP2/ERF基因内含子/外显子的分布。AP2亚家族成员（PH01004181G0030除外）包含1-9个内含子，孤儿基因包含4个内含子，大多数的GroupVII基因包含一个或两个内含子，然而，毛竹AP2/ERF家族其它亚家族或Group基因几乎不含有内含子（见图2-1）。为了鉴定毛竹AP2/ERF家族潜在的保守基序，分析了毛竹AP2/ERF家族蛋白序列及其与之同源的水稻和拟南芥AP2/ERF蛋白序列全长，包含AP2/ERF基因的所有同源进化枝请见图2-317 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析图2-1毛竹AP2/ERF家族基因的无根进化树和内含子/外显子结构图Fig.2-1Unrootedphylogenetictreeandexons/intronsofmosobambooAP2/ERFfamilygenes18 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析图2-2拟南芥、水稻和毛竹AP2/ERF家族各亚家族以及各Group成员数比较Fig.2-2ComparisonofSubgroupsizebetweenAP2/ERFfamiliesinmosobamboo,Arabidopsisandrice.注：AtAP2/ERF，OsAP2/ERF和PeAP2/ERFgenes分别表示的是拟南芥、水稻和毛竹的AP2/ERF基因。AtAP2/ERF,OsAP2/ERFandPeAP2/ERFgenesaretheAP2/ERFgenesinArabidopsis;riceandmosobamboo,respectively.和图2-4。不同亚家族或不同的Group所包含的保守基序不同，包括基序数量和基序保守序列。比如，CMPeII-4，CMPeIII-8，CMPeIII-12和CMPeVII-3基序为LWSY基序，分别存在于GroupIIb，IIId，IIIc和VIIa蛋白序列中。CMPeIII-5和CMPeVIII-3两个基序分别存在于IIId，IIIc和VIIIa三个Group中，这两个基序属于ERF相关联的两亲性抑制子基序（EAR基序），其序列为LxLxLxLPP，位于基因氨基酸序列的C末端。CMPeVI-4，CMPeVII-6和CMPeIX-4基序被鉴定为假定的磷酸化位点序列，在GroupVI，VIIa和IXb中保守存在。CMPeX-3基序是一个独特的基序，包含一段特殊的保守序列Cx2Cx2Cx2~4C，存在于GroupXb基因的N末端区域。CMPeA-6基序存在于AP2亚家族的四个蛋白序列中，PH01001341G0150，PH01002603G0280，Os12g03290和Os11g03540。CMPeR-8基序只存在于RAV亚家族的三个蛋白质中，PH01000015G1290，PH01000281G0890和PH00101568G0220。毛竹PeAP2/ERF家族基因PH01001018G0090和水稻OsAP2/ERF家族基因Os02g29550的同源性高于拟南芥AtAP2/ERF家族基因AT4G13040。基序序列及详情请见图2-4和表B-3。19 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析2.2.4毛竹AP2/ERF家族各Group的鉴定本文结合Nakano等人（Nakanoetal.，2006）报道的拟南芥AP2/ERF家族和水稻AP2/ERF家族各Group的特征，分析毛竹AP2/ERF家族各Group的特征。AP2和RAV亚家族的特征已于2.2.2介绍，此处不赘述。接下来针对ERF亚家族的11个Group的特征进行进一步的分析。GroupI包含两个基因，皆为SubgroupIb基因，与SubgroupIb基因AT1G64380和Os05g49700具有高同源性（见图2-3）。GroupII被分为两个Subgroup，IIa和IIb，没有IIc基因（见图2-3）。基序分析显示CMPeII-4基序为LWSY基序，位于蛋白序列的C末端—这个序列与Nakano等人（Nakanoetal.，2006）报道的存在于SubgroupIIb的CMII-3基序类似。SubgroupIIa基因Os04g55520和Os06g07030与PH01002393G0230基因聚类为一支，意味着PH01002393G0230基因属于SubgroupIIa成员。GroupIII共包括四个Subgroup，IIIb，IIIc，IIId和IIIe（见图2-3）。SubgroupIIIc转录因子，PH01000131G1240和PH01001480G0400，包含三个保守基序，CMPeIII-4，CMPeIII-9和CMPeIII-12，其中CMPeIII-4和CMPeIII-9基序与位于AP2/ERF结构域两侧的CMIII-3基序的区域I和区域II类似（Nakanoetal.，2006），CMPeIII-12基序已被鉴定为LWSY基序。尽管PH01000017G0950蛋白所包含的基序与上述两个蛋白的不同，但是这三个基因皆不含内含子且聚类为一支，故这三个蛋白可归为一个Subgroup，即IIIc。CMPeIII-5（EAR基序）和CMPeIII-8基序与CMIII-6和CMIII-7基序相似，这两个基序包含于SubgroupIIId，所以包含CMPeIII-5和CMPeIII-8基序的转录因子可分类为GroupIIId成员，根据进化树进一步分析表明SubgroupIIId包含10个蛋白。PH01003475G0200和PH01000124G0270蛋白聚类为一个分支，且包含相同的基序，所以被归类为SubgroupIIIe成员。通过同样的方法，PH01001205G0030蛋白分类为SubgroupIIIb成员。GroupIV分为两个Subgroup，IVa和IVb（见图2-3）。CMPeIV-2和CMPeIV-4基序与CMIV-1和CMIV-2基序相似，这两个基序保守存在于拟南芥和水稻SubgroupIVa蛋白序列的N末端；然而PH01000098G1180和PH01003928G0080这两个蛋白包含CMPeIV-2和CMPeIV-4基序，所以被分类为SubgroupIVa成员。根据进化树和其他保守基序分析，表明本Group其余的蛋白属于SubgroupIVb成员。根据Nakano等人的分类方法，GroupI-IV蛋白属于20 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析CBF/DREB亚家族蛋白，此亚家族蛋白在Sakuma等人的研究中被报道，在本研究中此分类方法也同样适应（Nakanoetal.，2006；Sakumaetal.2002）。在本研究中，共有27个蛋白属于CBF/DREB亚家族成员。ERF亚家族基因可被分为两个亚家族：CBF/DREB和ERF。GroupV，VI，VI–L和VII–X基因都属于ERF亚家族成员。GroupV只有一个基因PH01000791G0820，这个基因含有两个保守基序，CMPeV-2和CMPeV-3，经鉴定其与SubgroupVa的两个基序CMV-1和CMV-2相似（Nakanoetal.，2006），所以PH01000791G0820基因分类为SubgroupVa成员（见图2-3）。GroupVI蛋白序列的N末端区域包含两个保守基序，CMPeVI-3和CMPeVI-5，经分析其与CMVI-1和CMVI-2保守基序序列相似，且groupVI基因不含有内含子（见图2-1和图2-3）。PH01000320G0460，PH01003811G0100和PH01004434G0040三个蛋白序列包含一个保守基序CMPeVI-L-2，位于AP2/ERF结构域外N末端区域，与保守基序CMPeVI-3相似，因此这三个蛋白可分类为SubgroupVI–L成员（见图2-3）。GroupVII可被分为两个Subgroup，VIIa和VIIb（见图2-3）。GroupVII中的17个蛋白序列包含4个基序，其中CMPeVII-2，CMPeVII-3和CMPeVII-4这三个保守基序分别与CMVII-1，CMVII-5和CMVII-6基序相似，且这些基序包含于水稻GroupVIIa蛋白序列中。在这17个蛋白序列中有14个基因包含一个或两个内含子（见图2-1），这种现象也存在于拟南芥和水稻GroupVIIa基因中。在上述分析的基础上，可将这17个转录因子分类为GroupVIIa成员。PH01001704G0270基因与Os09g11460基因具有较高的同源性，且Os09g11460基因为SubgroupVIIb成员，所以PH01001704G0270基因也可被分类为SubgroupVIIb成员。GroupVIII可被分为两个Subgroup，VIIIa和VIIIb（见图2-3）。SubgroupVIIIa蛋白序列包含两个保守基序，CMPeVIII-3和CMPeVIII-4，经分析其与SubgroupVIIIa的两个保守基序CMVIII-1和CMVIII-2相似。PH01000069G0560蛋白序列在AP2/ERF结构域外没有保守基序且包含两个内含子（见图2-1），所以将其划分为SubgroupVIIIb成员。GroupIX包含两个Subgroup，IXb和IXc（见图2-3）。PH01000171G0880和PH01002571G0300蛋白序列有两个保守基序，CMPeIX-4和CMPeIX-5，CMPeIX-4基序序列与CMIX-5和CMIX-6基序同源性高，CMPeIX-5基序序列与CMIX-2基序同源性高，CMIX-2，CMIX-5和CMIX-6基序保守存在于SubgroupIXb蛋白中，所以PH01000171G0880和21 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析PH01002571G0300这两个蛋白可被划分为SubgroupIXb成员。基序CMPeIX-2和CMPeIX-3保守存在于PH01001229G0220，PH01000085G0010和PH01001938G0330这三个蛋白序列中，结合拟南芥和水稻基因的分析，可将这三个蛋白归类为SubgroupIXc成员。GroupX包含两个SubgroupXa和Xb（见图2-3）。PH01001490G0850，PH01000493G0150，PH01000559G0630，PH01000173G0700和PH01000437G0390，这五个蛋白包含两个保守基序，CMPeX-3和CMPeX-4。基序CMPeX-3位于蛋白序列的N末端区域，与拟南芥和水稻SubgroupXb蛋白的保守基序CMX-2同源性高，所以这五个蛋白可被划分为SubgroupXb成员。通过进化树和保守基序CMPeX-2的存在，可将PH01000004G0570，PH01001201G0350和PH01002648G0300这三个蛋白分类为SubgroupXa成员。2.2.5毛竹AP2/ERF转录因子家族基因进化模式及分离时间分析在比较基因组学中，基于亲缘关系和双向最佳命中的方法是确定可能的旁系同源基因或直系同源基因非常常见的策略。通过这两种策略，获得了77对毛竹AP2/ERF旁系同源基因和86对毛竹AP2/ERF和水稻AP2/ERF直系同源基因。最近的基因重复事件在基因家族成员快速增长和基因进化方面扮演非常重要的作用，导致不同物种中存在大量的旁系同源基因对（Cannonetal.，2004）。大规模的重复事件定义为基因同步复制。非同义替代率（Ka）和同义替代率（Ks）是一项探究基因复制后分离机制的措施。假设一个分子钟，这些复制基因的同义替换率（Ks）在时间上是一致的，然而，替换率在不同基因中是多样的（Shiuetal.，2004）。为了计算毛竹与水稻两个物种之间的分离时间，我们应用相对的Ks值来代替时间，相对Ks值的频率分布获得于毛竹和水稻的直系同源基因对和旁系同源基因对，结果如图2-5。毛竹旁系同源基因对的相对Ks分布峰值在0.2作用，表明大规模复制事件大约发生在1500万年前。毛竹和水稻直系同源基因对的相对Ks峰值分布于0.3-0.4，意味着这两个物种的AP2/ERF基因分离时间为1500-2300万年前。有研究报道毛竹与水稻基因组分离时间为700-1500万年前（pengetal.，2013a），与本研究分离时间相比较，表明AP2/ERF家族基因在水稻和毛竹基因组分离之前已进行基因分离。我们也分析了毛竹旁系同源基因对的相对Ka/Ks值，其相对Ka/Ks值主要分布于22 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析图2-3拟南芥、水稻和毛竹ERF亚家族各Group基因保守基序Fig.2-3GenemotifswithineachGroupoftheERFsubfamilyinmosobamboo,Arabidopsisandrice23 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析图2-3拟南芥、水稻和毛竹ERF亚家族各Group基因保守基序（续）Fig.2-3GenemotifswithineachGroupoftheERFsubfamilyinmosobamboo,Arabidopsisandrice(continue)24 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析图2-4拟南芥、水稻和毛竹AP2和RAV亚家族以及Soloist基因保守基序Fig.2-4GenemotifswithintheAP2subfamilyandtheRAVsubfamilyorsoloistgenesinmosobamboo,Arabidopsisandrice0.3-0.5（见图2-5），然而，毛竹和水稻直系同源基因对的相对Ka/Ks值主要分布于0.3-0.4（见图2-5）。有研究报道，当Ka/Ks值为1时意味着中性选择，大于1时为正选择，小于25 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析1时为净化选择（Lynchetal.，2000；Wagneretal.，2002）。因此，本研究结果显示在毛竹基因组中AP2/ERF基因以及毛竹与水稻基因组中AP2/ERF基因都为净化选择。图2-5从相对Ks和Ka/Ks的频率分布模式分析毛竹和水稻的AP2/ERF家族基因的Ks和Ka/Ks值Fig.2-5KsandKa/KsvaluedistributionsoftheAP2/ERFgenesinthegenomesofriceandmosobambooviewedthroughthefrequencydistributionofrelativeKsandKa/Ksmodes注：Pe和Os分布代表毛竹和水稻AP2/ERF家族基因。PeandOspresentfortheAP2/ERFfamilygenesinmosobambooandrice.2.2.6毛竹DREB亚家族基因潜在启动子区域分析顺式作用元件在决定基因组织特异性表达或胁迫响应表达模式方面发挥着非常重要的作用（Saeedetal.，2006），基因响应胁迫诱导表达与其启动子区域的顺式作用元件密切相关（Leetal.，2012；Waltheretal.，2007）。顺式作用元件位于基因上游2000bp基因组序列中，并且在与目标基因结合方面起着决定性的作用。为了更深入的了解毛竹DREB亚家族基因的转录调控机制和潜在的功能，所以分析了毛竹DREB亚家族基因的26 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析转录起始位点上游2000bp的潜在启动子区域，来鉴定其潜在的与胁迫响应相关的顺式作用元件（Fangetal.，2008），结果发现其存在大量的与非生物胁迫相关的顺式作用元件（表B-4），其中包括与干旱胁迫相关的顺式作用元件S000176和S000415，与盐胁迫相关的顺式作用元件S000453，与高温胁迫相关的顺式作用元件S00030，与低温胁迫相关的顺式作用元件S000407以及与创伤胁迫相关的顺式作用元件S000457，这表明毛竹DREB亚家族基因可响应非生物胁迫并提高毛竹非生物胁迫耐逆性的潜在功能。比如，PH01000343G0830包含24个干旱胁迫相关的顺式作用元件S000415，PH01001205G0030包含34个低温胁迫相关的顺式作用元件S000407，PH01002279G0250包含24个干旱胁迫相关的顺式作用元件S000415和34个低温胁迫相关的顺式作用元件S000407。2.3讨论AP2/ERF家族是最大的植物转录因子家族之一，参与植物的生长发育，响应生物和非生物胁迫。尽管AP2/ERF家族在许多物种中已经被研究，但是本研究是首次依据毛竹基因组数据库鉴定和分析AP2/ERF家族。在本研究中发现，毛竹AP2/ERF家族可能包含比其他禾本科植物更少的AP2/ERF转录因子，如水稻（Oryzasativa）包含165个OsAP2/ERF转录因子（Rashidetal.，2012；Dietzetal.，2010），玉米（Zeamays）包含194个ZmAP2/ERF转录因子，高粱（Sorghumbicolor）包含126个SbAP2/ERF转录因子（Yanetal.，2013），而毛竹包含116个AP2/ERF转录因子。目前研究表明，来自毛竹和水稻基因组的数据不仅强化了全基因组复制事件的发生，也支持了毛竹的祖先为四倍体植株（Pengetal.，2013a）。毛竹基因组有24对染色体（Chenetal.，2003）（2n=48），是水稻的两倍。虽然毛竹和水稻这两个物种间的关系尚不明确，但是众所周知，与水稻基因模块相比，毛竹携带两个复制的基因模块（Pengetal.，2013a）。毛竹AP2/ERF家族基因数为什么比水稻少的原因尚不明确，这可能是由于毛竹在全基因组复制事件后经历了近代大规模的基因丢失事件。AP2/ERF家族转录因子蛋白结构分析结果显示AP2和RAV两个亚家族转录因子包含两个DNA结合域，相反，ERF亚家族只包含一个DNA结合域，这表明AP2和RAV27 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析两个亚家族成员具有相对复杂的结构。在116个毛竹AP2/ERF基因中有52个基因含有内含子，与其他物种类似，如145个拟南芥AP2/ERF基因中有23个基因含有内含子，114个蓖麻（RicinuscommunisL.）AP2/ERF基因中有35个基因含有内含子—保守内含子位点的存在暗示着内含子进化先于基因复制事件。目前一项研究表示更早的增加内含子或DNA保守结构域可能影响假定祖先HNH核酸内切酶基因的复制能力，或者更长的基因片段也会使转录和复制事件更少发生，这也就是为什么AP2和RAV亚家族基因成员数少的原因（Magnanietal.，2004）。保守基序是一段具有各种生物学功能的保守氨基酸序列，可参与转录激活、蛋白-蛋白互作、核定位等生物学过程（Nakanoetal.，2006）。同一亚家族或Subgroup蛋白序列可能具有相似的基序和功能。拟南芥和毛竹AP2/ERF家族蛋白的多种保守基序已经被鉴定（Nakanoetal.，2006），所以本研究将比对拟南芥和水稻AP2/ERF的保守基序来分析鉴定毛竹各group的保守基序。SubgroupIIb，IIIc，IIId和VIIa蛋白在C末端有一个LWSY基序，LWSY基序在高粱ERF亚家族的A-3，A-5和B-2group中被鉴定（Caoetal.，2011），其可能参与植株抗寒性（Jinetal.，2008）。EAR基序通过激活转录抑制子来维持胁迫响应（Kagaleetal.，2011），比如，包含EAR基序的Zat7（AT3G46090）蛋白在拟南芥响应盐胁迫过程中发挥重要作用（Ciftci-Yilmazetal.，2007），RAP2.1在抵御低温和干旱胁迫过程中发挥重要的作用（Dongetal.，2010）。在毛竹SubgroupIIId，IIIc和VIIIa，蛋白序列中包含EAR基序，这意味着这些Subgroup蛋白可能在抵御非生物胁迫过程中发挥作用。在本研究中，CMPeVI-4，CMPeVII-6和CMPeIX-4这三个保守基序与假定磷酸化位点相关，分别保守存在于SubgroupVI，VIIa和IXb蛋白中。CMPeVI-4/SP（T/V）SVL基序被鉴定存在于毛竹所有的SubgroupVI蛋白中。SP（T/V）SVL基序存在于约一半的植物CRF蛋白中，其预测功能为假定的MAP激酶磷酸化位点。有趣的是，大约一半的包含此基序的基因在细胞分裂素处理或细胞分裂素突变体中表达量发生变化（Nakanoetal.，2006；Rashotteetal.，2010），表明SP（T/V）SVL基序在响应细胞分裂素过程中发挥重要的作用。CMPeX-3基序包含一段独特的保守序列，Cx2Cx4Cx2~4C，存在于SubgroupXb蛋白的N末端区域。目前关于半胱氨酸（Cys）重复序列的研究表示，这重复序列可能是一个锌指结构域，具有响应非生物胁迫的功能。水稻锌指蛋白28 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析OSISAP1，包含一段半胱氨酸重复序列，Cx2~4Cx9~12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC，OSISAP1蛋白在转基因烟草中超表达，可增强转基因种子在萌发或幼苗阶段的耐低温性、耐旱性和耐盐性（Mukhopadhyayetal.，2004）。SubgroupIIIb和IIIc以及PH01000017G0950蛋白中的CMPeIII-2基序被鉴定其含有三个保守氨基酸残基模块：LPRP、D[I/V]QAA或DIR[R/A]、LNFP。这三个模块在拟南芥CIPK12（Albrechtetal.，2001），ERF037（Quetal.，2006），DREB1C和DREBG（Fengetal.，2005），ARF19（Hagenetal.，2002）等蛋白中必不可少。转录因子N-末端的碱性氨基酸序列常被定义为核定位信号区（Congetal.，2008；Chuetal.，2014）。两个富含碱性氨基酸的序列KRRKRxEGKHP和KR[K/R]HS[I/K]RKRRKGKK，分别命名为CMPeIII-4和CMPeIX-6基序，其可能在groupIII和IX中发挥核定位信号的功能。有研究报道富含酸性氨基酸、谷氨酰胺（Gln）、脯氨酸（Pro）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）的氨基酸序列常为转录激活域（Liuetal.，1999），在本研究中，发现某些基序氨基酸序列富含丝氨酸，如CMPeIII-7和CMPeIX-6。研究毛竹和水稻基因的共线性，不仅支持了全基因组复制事件的发生，也支持了毛竹的祖先为四倍体，如近代全基因组复制事件与多倍体事件相关联（Pengetal.，2013a）。近代复制事件在加速基因家族的扩增和进化方面发挥重要的作用，这导致不同物种间产生许多旁系同源基因对（Cannonetal.，2004）。大规模复制事件被定义为基因同时复制事件。Ka和Ks是探索基因分离后复制机制的方法。假定一个分子钟，其复制事件的Ks值应该随着时间的变化是不变的。然而，基因之间的实际值是变化的（Shiuetal.，2004）。为了更好的解释进化模式，估计的进化率是非常有用的（Caoetal.，2011）。为确定不同家系的相对分散度，估算了直系同源基因对Pe–Os和旁系同源基因对Pe–Pe的Ks和Ka值。先计算每个基因对的Ks值，然后用来计算重复事件的近似值（T=Ks/2λ），其中水–9稻和拟南芥的λ值为6.5×10（Zhangetal.，2011；Pengetal.，2013a）。我们估算水稻和毛竹的分离时间在1500-2300万年前，毛竹基因大规模复制事件发生在1500万年前。基因分析和基因共线性分析结果表明毛竹全基因组复制发生在700-1200万年前（Pengetal.，2013）。如果物种家系的Ka/Ks值高就意味着这些基因经历了强烈的选择压力。如果Ka/Ks=1则意味着很少或没有选择压力，如果Ka/Ks<1则表示为自然的净化选择（Lynch29 第二章毛竹AP2/ERF家族转录因子生物信息学分析etal.，2000；WagnerA，2002）。本研究中，Pe–Os基因的Ka/Ks值为0.3-0.4，Pe–Pe基因的Ka/Ks值为0.3-0.5，意味着这些基因均为净化选择。2.4小结通过生物信息学分析软件对毛竹AP2/ERF家族转录因子的分析，得到以下结论：（1）在毛竹基因组中共鉴定出121个AP2/ERF基因，其中5个基因包含的AP2/ERF结构域非常短，所以本研究针对其于116个基因进行生物信息学分析。（2）进化关系分析结果表明，116个PeAP2/ERF基因可被分为3个亚家族：AP2、RAV和ERF，其中ERF亚家族又可被分为11个Group。各亚家族成员数为：28个AP2基因，7个RAV基因，80个ERF基因，1个孤儿基因。（3）基因内含子/外显子结构分析结果显示，52个毛竹AP2/ERF基因含有内含子，这些基因主要为AP2亚家族基因和大部分GroupVII基因。AP2/ERF基因保守基序分析结果显示，存在于拟南芥和水稻不同亚家族和Subgroup基因中的基序在毛竹种也存在。（4）进化模式和分离时间分析显示，毛竹AP2/ERF家族基因在1500万年前经历了一次大规模复制事件，毛竹和水稻的AP2/ERF家族基因分离时间在1500-2300万年前。（5）毛竹DREB基因启动子区域分析发现，在这些基因中存在大量与干旱、低温、盐等非生物胁迫相关的顺式作用元件。30 第三章毛竹DREB亚家族转录因子表达模式分析第三章毛竹DREB亚家族基因表达模式分析3.1材料与方法3.1.1植物材料毛竹种子采集于广西省桂林市。将单株采集的种子置于有湿润滤纸的培养皿中，温度为25℃，暗培养催芽。一周后，将幼苗转移到蛭石基质的塑料小花盆中，每周浇一次营养液，光暗周期时间分别是16/8h，白天和晚上温度分别是25/18℃，湿度为80%。培养时间为3个月。用20%PEG-6000溶液浇灌在培养基质上进行干旱胁迫处理，用250mmol/LNaCl溶液浇灌在培养基质上进行盐胁迫处理，低温处理是将毛竹幼苗置于4℃恒温培养箱中培养且其他培养条件不变。分别于处理后0h，0.5h，3h，6h，12h和24h六个时间点取毛竹幼苗的根和叶，液氮速冻后放于-80℃低温冷藏备用。3.1.2TRIZOL法提取总RNA及cDNA第一链的合成应用TRIZOL法（Invitrogen，Germany）提取总RNA，并用RNase-freeDNaseI（Promega，Madison，WI，USA）消化所有基因组DNA。通过1%琼脂糖电泳和NanoDrop8000（NanoDrop，ThermoScientific）检测总RNA的质量，并用安捷伦2100生物分析仪（美国）检测总RNA的完整性及浓度。取2µl总RNA，DNA酶，M-MLV反转录酶等试剂混合体系为20µl，合成cDNA第一链，并用1%琼脂糖电泳和NanoDrop8000（NanoDrop，ThermoScientific）检测cDNA的质量。3.1.3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）应用SYBRHPremixEXTaqTM试剂盒（Roche，USA），LightCycler480HSystem（Roche，USA）仪器进行qRT-PCR实验，分析毛竹PeDREB转录因子亚家族基因在干旱、31 第三章毛竹DREB亚家族转录因子表达模式分析低温、高盐胁迫下的表达模式。反应体系为20µl，包括：正向和反向引物各0.4µl（10mmol/L），cDNA2µl（20ng），SYBRGreenIMaster试剂10µl，加ddH2O至终体积。目的基因扩增反应条件为：95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s。数据分析用的是罗氏分析软件。各基因相应的表达结果应用Cluster3.0软件聚类并在JAVATreeview软件中生成。应用在线引物设计软件3.0（http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）设计qRT-PCR特异反应引物，见表B-5。液泡膜内嵌蛋白41基因（TIP41）为内参基因，引物见表B-5。3.2结果目前大量研究结果显示，许多植物的DREB亚家族转录因子参与非生物胁迫响应，如干旱、低温和高盐，同时也能提高其转基因植株的抗逆性（Dubouzetetal.，2003；Qinetal.，2004；Julianaetal.，2013）。理论上，毛竹的DREB亚家族基因同样能响应各种非生物胁迫，因为毛竹DREB亚家族基因上游启动子区域存在许多与胁迫诱导相关的顺式作用元件。本研究应用qRT-PCR分析了24个毛竹DREB基因在干旱、低温和高盐胁迫下的表达模式（由于PH01000343G0780、PH01003107G0070和PH01003928G0080这三个基因无法获得特异引物，故不能进行qRT-PCR）。通过聚类方法分析各个DREB基因在不同胁迫下表达量变化倍数的log2值，24个DREB基因可被划分为六个聚类支，也就是聚类支I–VI（见图3-1）。聚类支I有两个成员，一个成员属于SubgroupIIId，一个成员属于SubgroupIIIe，它们在叶片中响应低温胁迫上调表达，响应干旱和盐胁迫下调表达，但是在根中响应三种胁迫上调表达。聚类支II包含2个SubgroupIIb基因、3个SubgroupIIId基因、1个SubgroupIIIc基因和1个SubgroupIVb基因，这七个基因在叶片中响应干旱、低温和高盐胁迫发挥下调表达的作用，而在根中却强烈的上调表达。聚类支III包含1个IIa基因、1个IIIc基因、2个IIId基因和1个IIIe基因。其中，PH01000131G1240基因的表达量在叶片中响应盐胁迫先上升，在12h后下降，在根中响应干旱胁迫持续上调表达；PH01003475G0200基因在根中响应干旱胁迫持续上调表达，而在根中响应低温和盐胁迫表达量先升高后降低；PH01000668G0350和PH01001480G0400基因在叶片中响32 第三章毛竹DREB亚家族转录因子表达模式分析应干旱和低温胁迫诱导表达，在根中响应三种胁迫上调表达。PH01002293G0230基因的表达水平在叶片中响应干旱胁迫呈先降低后升高的趋势，在根中响应三种胁迫几乎上调表达。聚类支IV包含1个Ib基因、2个IIId基因和1个Iva基因，这四个基因在叶片响应干旱胁迫和根中响应盐胁迫下调表达，在叶片中响应低温胁迫下调表达，在叶片中响应盐胁迫上调表达（PH01000242G1390基因除外），在根中响应干旱胁迫上调表达。聚类支V包含2个IIId基因和1个IVb基因，这三个基因在叶片和根中响应三种胁迫下调表达或表达量变化少。聚类支VI包含1个Ib基因和2个IVb基因，这三个基因在叶片中响应三种胁迫上调表达，在根中响应三种胁迫轻微下调表达。图3-1毛竹DREB亚家族基因在干旱、低温和盐处理下在叶片和根中表达量热图Fig.3-1.Heatmapofthereal-timequantitativePCR(qRT-PCR)analysisresultsofDREBsubfamilygenesinleavesandrootsunderdrought,low-temperatureandhighsalinitytreatments注：L-drought，L-cold和L-salt分别指的是毛竹DREB亚家族基因在干旱、低温和盐处理下在叶片中的表达模式，而R-drought，R-cold和R-salt指的是在根中的表达模式。L-drought,L-coldandL-saltaretheexpressionpatternsofDREBsubfamilygenesinmosobamboounderthedrought,low-temperatureandsalinitytreatmentsinleaves,andR-drought,R-coldandR-saltaretheexpressionpatternsinroots.3.3讨论本研究中，毛竹基因组中含有27个DREB基因，与57个拟南芥DERB基因数和52个水稻DREB基因数相比，毛竹DREB亚家族基因数较少。毛竹DREB亚家族中不存在33 第三章毛竹DREB亚家族转录因子表达模式分析SubgroupIa，IIc和IIIa基因，SubgroupIIa和IIIb中各有1个基因，SubgroupIb，IIb，IIIe和Iva中各有2个基因。目前，SubgroupIa基因的功能是未知的。拟南芥SubgroupIb基因，RAP2.4和RAP2.4B，在茎和根中表达量高，且响应干旱、低温和渗透胁迫诱导不同程度的表达。然而，RAP2.4B在干种子中特异高表达且被高温诱导表达，RAP2.4在盐胁迫下特异高表达（Raeetal.，2011），表明SubgroupIb基因可能在不同组织和不同非生物胁迫下发挥作用。如PeDREB2A（PH01000046G1730）基因（Wuetal.，2014）在叶片中被干旱和盐胁迫强烈诱导上调表达，而在低温胁迫下诱导轻微上调表达。SubgroupIIa基因RAP2.1（At1g46780），其转基因拟南芥通过ABA不依赖途径参与干旱和低温胁迫响应过程（Dongetal.，2010）。SubgroupIIb基因OsDERF1（Os08g35240），其转基因水稻对乙烯的合成和耐旱性发挥负调控的作用（Wanetal.，2011）。SubgroupIIc基因SERF1（Os05g34730）在盐和H2O2胁迫下于根中诱导特异表达（Schmidtetal.，2013）。GroupII中的基因具有参与不同的信号转导途径和响应非生物胁迫的功能。在本研究中，虽没有SubgroupIIc基因，但是IIa基因在叶片中响应干旱胁迫诱导表达，在根中响应干旱和低温胁迫诱导强烈上调表达，响应盐胁迫诱导轻微上调表达，IIb基因在根中和叶片中响应三种胁迫相对表达量非常高。SubgroupIIIc基因，也就是DREB1s基因，是一个特殊的已被大量研究的Subgroup，如拟南芥AtDREB1转录因子主要响应低温胁迫（Ruellandetal.，2013）。由DREB1s基因诱导并调控的分子机制和生理响应在单子叶植物中是相同的（Sakumaetal.，2002；Itoetal.，2006；Dubouzetetal.，2003；Liuetal.，2013）。然而，在本研究中，毛竹只有3个SubgroupIIIc基因，它们在干旱、低温和盐胁迫下具有多种功能。为什么毛竹拥有比拟南芥和水稻更少的DREB1s基因的原因尚未可知。毛竹SubgroupIIId的成员数是所有Subgroup中成员数最多的，几乎所有的IIId基因都参与干旱、低温和盐胁迫响应，尤其在根中，PH01003772G0180基因除外（PH01003772G0180基因不响应三种胁迫）。PH01000668G0350基因，也就是PeDREB1A，在叶片中响应干旱和低温胁迫相对表达量低，在根中响应三种胁迫诱导强烈上调表达（Wuetal.，2014）。某些其他物种的SubgroupIIId基因可能具有组成型表达特点或参与非生物胁迫响应，如，OsDREB4-2基因被干旱和盐胁迫诱导表达，OsDREB4-1基因则为组成型表达（Tianetal.，2005）。GroupIV基因被命名为DREB2s基因，尽管研究报道大部分的DREB2s基因参与34 第三章毛竹DREB亚家族转录因子表达模式分析干旱和高温的响应（Ruellandetal.，2013）；然而，它们可能还具有更多的功能，如拟南芥DREB2A基因参与干旱、盐和高温胁迫响应（Reisetal.，2014）。AtDREB2C基因超表达拟南芥植株皆干旱胁迫敏感，却耐低温和高温（Leeetal.，2010）。拟南芥GroupIV转录因子的功能与毛竹中是一致的，包括响应干旱、低温和盐胁迫功能。Liu等人克隆并研究了PeDREB1（PH01003928G0080其表达模式在本研究中未被研究）和PeDREB2（PH01000098G1180）基因的表达模式，PeDREB1在干旱胁迫下其表达量迅速积累，PeDREB2在干旱和盐胁迫下诱导表达（Liuetal.，2011；Liuetal.，2012）。本研究结果表明大多数的毛竹DREB基因在根中响应干旱、低温和盐胁迫上调表达，说明它们在毛竹根响应非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。3.4小结通过qRT-PCR的方法研究了24个毛竹DREB基因在干旱、低温和盐胁迫下的表达模式变化，结果发现大部分的DREB基因在叶片中响应三种胁迫发挥下调表达的作用，而在根中发挥上调表达的作用。PeDREB2A（PH01000046G1730）基因在叶片中响应干旱和盐胁迫强烈上调表达，而响应低温胁迫下轻微上调表达。PeDREB1A（PH01000668G0350）基因在叶片中响应干旱和低温胁迫相对表达量低，而在根中响应三种胁迫相对表达量高。35 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证4.1材料与方法4.1.1植物材料4.1.1.1毛竹实生苗植物材料请见第三章3.1.1。4.1.1.2拟南芥植物材料拟南芥（Arabidopsisthaliana）为Columbia-0野生型，本实验室保存，于人工气候箱培养，光暗周期为16/8h，白天和夜晚温度分别是24℃和18℃，相对湿度均为80%。每周补充营养液，待盛花期时进行转化。4.1.2目的基因克隆及转化应用Invitrogen公司的TrizolReagent提取三个月大小的毛竹实生苗叶片总RNA，cDNA第一链的合成采用Promega公司的反转录试剂盒（Reversetranscriptionsystem，A3500），反转录产物液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱，备用。根据毛竹基因组数据库中2条DREB基因的CDS序列，通过引物设计软件Primer3设计PCR特异扩增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。因构建植物表达载体的需要，上游引物5'端加BamHI酶切位点，下游引物5'端加HindIII酶切位点。克隆引物为PeDREB2A-BamHI-F（5'-ATGGATCCATGGACGACAGCCTCCGCACA-3'）和PeDREB2A-HindIII-R（5'-GCAAGCTTCTAGAAGTTAAGCATCTCCCA-3’），PeDREB1A-BamHI-F（5'-GCGGATCCATGGAAGCAGACGCAAGCCAT-3'）和PeDREB1A-HindIII-R（5'-TAAAGCTTCTACTCGGCCCACAAGAGT-3’）。通过RT-PCR反应扩增目的基因，条件为：95℃预变性5min，然后94℃30s，60℃40s，72℃1min，共35个循环，再72℃延伸10min。反应产物进行凝胶电泳分析后，应用QIAGEN公司36 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证的胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的DNA片段连接到pMD18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌（Esherichiacoli），经过蓝白斑筛选，获得阳性克隆质粒，BamHI和HindIII双酶切检测并送生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司测序。将正确的重组质粒分别命名为pMD18T-PeDREB2A和pMD18T-PeDREB1A。4.1.3目的基因生物信息学分析用ProtParam软件（http://web.expasy.org/protparam/）对基因的分子量、等电点和不稳定系数等进行预测，使用Softberry的ProtComp9.0预测转录因子亚细胞定位，SMART工具查询目的基因氨基酸序列的保守结构域及位置，ProtScale程序进行亲疏水性分析（http://web.expasy.org/protscale/），用SignalP4.1Server软件检测是否存在信号肽序列（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），用NetPhos2.0Server推测其磷酸化位点（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/），用ProtFun软件预测目的基因编码蛋白的功能（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/），应用DNAMAN软件分析PeDREB2A和PeDREB1A核酸序列及其推导出的氨基酸序列。通过拟南芥基因组数据库TRIA（http://www.arabidopsis.org/）获得拟南芥DREB家族基因的蛋白序列，用ClustalX1.83软件对PeDREB2A、PeDREB1A以及拟南芥DREBs基因的氨基酸序列全长进行多序列联配，并用MEGA6.0软件构建进化树，分析其进化关系。4.1.4目的基因组织特异性表达检测按照1.2.1方法获得3个月大小并生长一致的毛竹实生苗的叶片、幼茎和根的总cDNA，利用克隆引物PeDREB2A-BamHI-F和PeDREB2A-HindIII-R，PeDREB1A-BamHI-F和PeDREB1A-HindIII-R，采用RT-PCR法测定PeDREB2A和PeDREB1A基因在叶片、幼茎和根中的表达量，以毛竹TIP41基因（Fanetal.，2013）作为内参基因，其引物为TIP41-F（5'-AAAATCATTGTAGGCCATTGTCG-3’）和TIP41-R（5'-ACTAAATTAAGCCAGCGGGAGTG-3’），PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。37 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证4.1.5目的基因胁迫响应表达模式分析实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法请见第三章3.1.3。目的基因响应胁迫后相对表达量变化倍数图通过Origin8作图软件生成。4.1.6植物表达载体的构建用BamHI和HindIII双酶切pMD18T-PeDREB2A和pMD18T-PeDREB1A重组质粒，同时用BamHI和HindIII双酶切pCAMBIA2300-CaMV35S植物表达载体，经1%琼脂糖凝胶纯化及回收后，连接目的片段与表达载体片段，构建重组质粒。经双酶切验证和测序检测，将正确的阳性克隆质粒命名为pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB2A和pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB1A.4.1.7转基因植株转化应用电击转化法将pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB2A和pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB1A两个重组质粒转化GV3101根癌农杆菌，经含100mg/L卡那霉素的YEP固体培养基筛选，挑选单菌落进行菌斑PCR鉴定，获得含有目的基因的阳性根癌农杆菌菌株，应用农杆菌浸染法介导拟南芥转化。农杆菌浸染液配方如下：试剂质量/体积Ms盐2.2g蔗糖50g0.2%silwetL-770.2ml去离子H2O至体积为1LPH5.7~5.84.1.8转基因植株筛选将T0代的拟南芥种子经70%的酒精消毒5min后，再用2.6%浓度的次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水清洗3-5遍。在含有卡那霉素（100mg/L）抗性的1/2MS培养基上播种消毒后的种子，经4℃低温春化2d后在人工气候培养箱中培养10d左右，正38 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证常生长的绿色幼苗即是阳性植株。将阳性植株移栽至土壤中栽培，待成熟后单株收取T1代种子。应用同样的方法筛选T1代种子，统计T1代各株系阳性植株与非阳性植株的比例，并将比例约为3:1的株系的阳性植株（5株）移栽至土壤中，即获得T2代转基因幼苗。4.1.9转基因拟南芥植株检测待T2代转基因植株幼苗长至10片叶大小时，应用TRIZOL法提取转基因植株叶片的总RNA，cDNA第一链的合成采用promega反转录试剂盒完成，用于RT-PCR检测。4.1.10T3代转基因拟南芥纯合体植株筛选分株系和单株收取T2代转基因拟南芥种子，种子放置一周左右，待种子干燥后，每单株选取100粒左右的种子种于含有卡那霉素（100mg/L）的1/2MS平板上。置于光照培养箱中，培养1周左右，观察阳性植株数量。如果所有幼苗均为阳性植株，则此单株为纯合体植株。4.1.11模拟干旱胁迫筛选抗旱转基因拟南芥株系将高温高压灭菌后尚未凝固的1/2MS培养基25ml缓缓倒入已消毒的铺有纱布的圆形培养皿中，待凝固后播种已消毒的种子，播种后4℃低温处理2d，光照培养箱中培养7d后做模拟干旱处理。此过程在无菌操作台中操作，首先用无菌的镊子夹起纱布一侧，然后用移液枪将10ml不同浓度的PEG8000溶液（0%、10%、20%和30%）沿培养皿边缘加入，然后放下纱布，轻轻转动培养皿，从而使PEG8000溶液分布均匀，用封口膜封口后于光照培养箱中培养，实时观察并记录拟南芥幼苗在胁迫下的表型变化并拍照（张依章等，2006）。4.1.12盐胁迫筛选抗盐转基因拟南芥株系配制1/2MS培养基，在培养基中加入NaCl，其浓度为：0，50，100，200mmol/L。培养基灭菌后，每个方形培养皿中倾入12ml培养基，冷凝待用。将4-6d大小的转基因39 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证拟南芥和WT拟南芥幼苗转移到不同浓度的盐胁迫培养基上，垂直放置于光照培养箱中培养。每天观测其生长形态变化并拍照记录。另将已灭菌的纯合体T2代转基因拟南芥种子和WT拟南芥种子，播种于浓度为100mmol/L的盐胁迫培养基上，4℃低温春化处理2d，垂直放置于光照培养箱中培养，观察种子的发芽速率和幼苗的生长状况，记录并拍照。4.1.13低温胁迫筛选抗寒转基因拟南芥株系配制1/2MS培养基，培养基冷凝后播种已灭菌的纯合体T2代转基因拟南芥种子和WT拟南芥种子，4℃低温春化处理2d，光照培养箱中培养10-12d后，置于4℃光照培养箱中低温培养。实时记录拟南芥幼苗在低温胁迫条件下的表型变化并拍照。4.2结果4.2.1目的基因的克隆用PeDREB2A-BamHI-F和PeDREB2A-HindIII-R，PeDREB1A-BamHI-F和PeDREB1A-HindIII-R两对引物分别进行PCR扩增反应，PCR反应产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，EB显色后，在750-1000bp之间各有一条清晰的亮带（图4-1），与目的基因片段大小相符，切胶回收，回收产物与pMD18-Teasy载体连接，提取阳性克隆质粒，经BamHI和HindIII双酶切后得到的片段大小与PCR产物大小相吻合（图4-2）。测序后序列比对结果显示插入片段的长度分别为795bp和825bp，与毛竹基因组数据库中目的基因的长度及氨基酸序列完全符合，证明已获得2条DREB基因，并命名为PeDREB2A和PeDREB1A基因。目前，已经克隆的毛竹DREB基因有PeDREB1（Liuetal.，2012）和PeDREB2（Liuetal.，2011），其长度分别为681bp和834bp，可推断本研究克隆的基因未被报道过。40 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-1PeDREB2A和PeDREB1A基因PCR产物电泳Fig.4-1ElectrophoresisofPCRproductsforPeDREB2AandPeDREB1Agenes注：A是PeDREB2A基因PCR产物电泳，B是PeDREB1A基因PCR产物电泳。M泳道为DL2000，泳道1、2、3为以cDNA为模板的PCR产物电泳，泳道4为以ddH2O为模板的PCR产物电泳。Note:A.theElectrophoresisofPCRproductsforPeDREB2Agenes,B.theElectrophoresisofPCRproductsforPeDREB1Agenes.MisMarkermoleculeDL2000;Lane1,2,3arethePCRproduc-tsbasedoncDNAtemplate,Lane4isthePCRproductsbasedonddH2O.4.2.2目的基因的生物信息学分析根据ProtParam软件预测PeDREB2A蛋白分子量为28.96kDa，分子式为C1263H2003N379O388S8，等电点为9.47；带负电荷的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）残基总数为28，带正电荷的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）残基总数为35；不稳定系数为60.77，此蛋白为不稳定蛋白（稳定系数为40以下的蛋白为稳定蛋白）；理论推导半衰期大约为30h；脂肪系数为69.62。在推导的PeDREB2A蛋白的氨基酸组成中，含量较高的氨基酸有：Ala（13.3%）、Ser（11.0%）、Arg（10.2%）、Leu（8.3%），不含Ply和Sec，如表4-1所示。PeDREB1A蛋白分子量为28.84kDa，分子式为C1242H1938N368O414S6，等电点为5.34；带负电荷的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）残基总数为36，带正电荷的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）残基总数为28；不稳定系数为65.88，此蛋白为不稳定蛋白（稳定系数为40以下的蛋白为稳定蛋白）；理论推导半衰期大约为30h；脂肪系数41 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证为58.72。在推导的PeDREB1A蛋白的氨基酸组成中，含量较高的氨基酸有：Ala（17.9%）、Ser（14.2%）、Glu（7.7%）、Pro（7.7%），不含Ply和Sec，如表4-1所示。图4-2pMD18T-PeDREB2A和pMD18T-PeDREB1A双酶切电泳Fig.4-2Electrophoresisofthedoubleenzyme-digestedpMD18T-PeDREB2AandpMD18T-PeDREB1A注：A是pMD18T-PeDREB2A双酶切产物电泳，B是pMD18T-PeDREB1A双酶切产物电泳。M.DL10000；泳道1为PCR回收产物，泳道2为重组质粒，泳道3、4、5为质粒酶切产物。Note：AistheElectrophoresisofthedoubleenzyme-digestedpMD18T-PeDREB2A,BistheElectrophoresisofthedoubleenzyme-digestedpMD18T-PeDREB2A.MisMarkermoleculeDL10000;Lane1istherecycledproductofPCR,Lane2istheplasmid,Lane3,4,5arethedoubleenzyme-digestedproductsofplasmid.通过Softberry的ProtComp9.0分析PeDREB2A和PeDREB1A蛋白序列的亚细胞定位，如表4-2所示。分析结果显示，PeDREB2A和PeDREB1A蛋白定位于细胞核的积分都为9.92，其余部位均低于0.06，从而可推断这两个蛋白定位于细胞核。亚细胞定位预测表明这两个基因均定位于细胞核，与转录因子定位于细胞核发挥作用的研究一致（Liuetal.，2012；程占超等，2013）。用在线ProtScale程序进行蛋白序列的亲疏水性分析，如图4-3所示，可推导出这两个蛋白皆为亲水性蛋白。通过CBS的TMHMM对PeDREB2A和PeDREB1A蛋白信号肽位点进行预测，结果如图4-4所示。图中S-score表示氨基酸序列中每个氨基酸残基位于信号肽的可能性，值42 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证越大代表对应氨基酸残基位于信号肽区的可能性越高。C-score是切割位点的可能性评分，评分越高代表切割的概率越高。Y-score是S-score和C-score的综合得分，得分越高表示是信号肽位点的可能性越大。由图可知，C-score分别在33位氨基酸和34位氨基酸处有明显落差，S-score和Y-score也有明显的峰值，从而推测，PeDREB2A和PeDREB1A蛋白可能含有跨膜信号肽区域。用NetPhos2.0Server预测PeDREB2A和PeDREB1A蛋白的磷酸化位点，结果如图4-5所示，PeDREB2A蛋白含有19个丝氨酸、1个苏氨酸、1个络氨酸，这21个氨基酸残基主要集中在10-50bp，60-80bp，120-150bp，210-240bp这四个氨基酸序列区域，由此可推测此基因的磷酸化位点位于此四个区域，在210-240bp区域分布最多，说明此处是磷酸化位点的可能性最大；PeDREB1A蛋白含有27个丝氨酸，2个苏氨酸，1个络氨酸，这30个氨基酸残基除在0-40bp区域分布最多外，在50-150bp，170-180bp，200-210bp三段氨基酸序列中也有分布，可预测PeDREB1A蛋白的磷酸化位点在0-40bp处的可能性最大，在其他部位的概率较低。表4-1PeDREB2A和PeDREB1A蛋白氨基酸含量Tab.4-1PredictionofPeDREB2AandPeDREB1Aproteins’aminoacidcontentsAB氨基酸数百分比氨基酸数百分比氨基酸数百分比氨基酸数百分比组成量（%）组成量（%）组成量（%）组成量（%）Ala(A)3513.3%Ile(I)51.9%Ala(A)4917.9%Ile(I)41.5%Arg(R)2710.2%Leu(L)228.3%Arg(R)165.8%Leu(L)186.6%Asn(N)62.3%Lys(K)83.0%Asn(N)62.2%Lys(K)124.4%Asp(D)124.5%Met(M)51.9%Asp(D)155，5%Met(M)31.1%Cys(C)31.1%Phe(F)72.7%Cys(C)31.1%Phe(F)72.6%Gln(Q)93.4%Pro(P)197.2%Gln(Q)93.3%Pro(P)217.7%Glu(E)166.1%Ser(S)2911.0%Glu(E)217.7%Ser(S)3914.2%Gly(G)155.7%Thr(T)155.7%Gly(G)165.8%Thr(T)114.0%His(H)31.1%Trp(W)51.9%His(H)62.2%Trp(W)72.6%Tyr(Y)83.0%Val(V)155.7%Tyr(Y)80.7%Val(V)93.3%注：A：PeDREB2A蛋白氨基酸含量；B：PeDREB1A蛋白氨基酸含量Note：A:ThetableofPeDREB2Aprotein’saminoacidcontent;B:ThetableofPeDREB1Aprotein’sacidcontent43 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证表4-2PeDREB2A和PeDREB1A蛋白序列的亚细胞定位Tab.4-2PredictionofPeDREB2AandPeDREB1Aproteins’subcellularlocalizationsALocationweightsLocDBPotLocDBNeuralNetsPentamersIntegralNuclear03.02.85.969.92Plasmamembrane000.0600.00Extracellular00000.00Cytoplasmic000.1200.06Mitochondrial0000.420Endoplasm.retic.00000Peroxisomal000.0100Golgi00000.01Chloroplast00000Vacuolar00000.01BLocationweightsLocDBPotLocDBNeuralNetsPentamersIntegralNuclear03.02.856.069.92Plasmamembrane00000.00Extracellular00000.00Cytoplasmic000.1000.02Mitochondrial0000.010.03Endoplasm.retic.00000Peroxisomal000.0400Golgi00000Chloroplast0000.030Vacuolar00000.03注：A：PeDREB2A蛋白序列的亚细胞定位表；B：PeDREB1A蛋白序列的亚细胞定位表Note:A:ThescoretableofPeDREB2Aprotein’ssubcellularlocalization;B:ThescoretableofPeDREB1Aprotein’ssubcellularlocalization。44 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-3PeDREB2A和PeDREB1A蛋白质疏水性分析Fig.4-3PredictionofPeDREB2AandPeDREB1Aproteins’hydrophobicities.注：A:PeDREB2A蛋白质疏水性分析TheanalysisofPeDREB2Aprotein’shydrophobicity;B:PeDREB1A蛋白质疏水性分析TheanalysisofPeDREB1Aprotein’shydrophobicity;横坐标表示氨基酸序列的顺序，纵坐标表示亲、疏水值；“-”表亲水性，“+”表疏水性.X-axisforencodingproteinaminoacidsequence,Y-axisforhydrophilicandhydrophobicvalue;thesymbol“-”indicatedhydrophilic,thesymbol"+"indicatedhydrophobic;45 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-4PeDREB2A和PeDREB1A蛋白信号肽序列预测分析Fig.4-4PredictionofPeDREB2AandPeDREB1Aproteins’signalpeptidesequences.注：A：PeDREB2A蛋白信号肽序列预测；B：PeDREB1A蛋白信号肽序列预测。Note:A:TheanalysisofPeDREB2Aprotein’ssignalpeptidesequence;B:TheanalysisofPeDREB1Aprotein’ssignalpeptidesequence.46 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-5PeDREB2A和PeDREB1A蛋白磷酸化位点分布Fig.4-5PredictionofPeDREB2AandPeDREB1Aproteins’phosphorylationsitedistributions.注：A:PeDREB2A蛋白磷酸化位点分布TheanalysisofPeDREB1Aprotein’sphosphorylationsitedistribution;B:PeDREB1A蛋白磷酸化位点分布TheanalysisofPeDREB1Aprotein’sphosphorylationsitedistribution.用Protfun软件预测PeDREB2A和PeDREB1A蛋白功能，功能分类表如图4-3所示，分析可得，PeDREB2A蛋白可能具有促进细胞膜形成和氨基酸合成，无酶活性，转录、转录调控及生长因子的功能；PeDREB1A蛋白具有中间代谢，无酶活性，转录、转录调控及生长因子的功能。47 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证表4-3PeDREB2A和PeDREB1A蛋白功能预测Fig.4-3PredictionofPeDREB2AandPeDREB1Aproteins’functions.FunctionalcategoryOdds(PeDREB2A)Odds(PeDREB1A)Amino_acid_biosynthesis2.5580.516Biosynthesis_of_cofactors0.7280.427Cell_envelope3.0910.786Cellular_processes0.7310.373Central_intermediary_metabolism1.9632.391Energy_metabolism0.2590.259Fatty_acid_metabolism1.2651.325Purines_and_pyrimidines0.6130.520Regulatory_functions0.9150.913Replication_and_transcription0.7391.177Translation0.6131.915Transport_and_binding0.6430.043Enzyme/nonenzymeOdds(PeDREB2A)Odds(PeDREB1A)Enzyme0.9890.833Nonenzyme1.0051.067GeneOntologycategoryOdds(PeDREB2A)Odds(PeDREB1A)Signal_transducer0.5590.340Receptor0.0180.019Hormone0.2560.206Structural_protein0.2470.041Transporter0.2310.231Ion_channel0.3360.340Voltage-gated_ion_channel0.2240.184Cation_channel0.2150.222Transcription3.1034.641Transcription_regulation2.4222.460Stress_response0.0870.064Immune_response0.5380.166Growth_factor3.5194.155Metal_ion_transport0.0200.028蛋白序列结构分析表明，这2个蛋白均含有一个由64个氨基酸残基组成的AP2/ERF结构域，如图4-6所示。PeDREB2A蛋白的AP2/ERF结构域位于92L到155R，而PeDREB1A蛋白的结构域位于106S到169L。DREB蛋白的AP2/ERF结构域的第14位48 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证缬氨酸（14V）和第19位谷氨酸（19E）非常保守，这2个氨基酸残基在决定DREB转录因子与目标基因结合特异性方面发挥着极为重要的作用，然而19E的保守程度远远低于14V（Liuetal.，1998；Dubouzetetal.，2003；Sakumaetal.，2006；Agarwaletal.，2007）。PeDREB2A和PeDREB1A蛋白结构域的第14位均为缬氨酸，可推断这2个基因都属于DREB家族基因，而PeDREB2A的AP2/ERF结构域第19位氨基酸为亮氨酸，进一步说明了AP2/ERF结构域第19位氨基酸的保守性低于第14位缬氨酸。图4-6PeDREB2A和PeDREB1A核酸序列及其推导出的氨基酸Fig.4-6NucleotidesequencesanddeducedaminoacidsequencesofPeDREB2AandPeDREB1A注：A是PeDREB2A核酸序列及其推导出的氨基酸；B是PeDREB1A核酸序列及其推导出的氨基酸AisnucleotidesequenceanddeducedaminoacidsequenceofPeDREB2A;BisnucleotidesequenceanddeducedaminoacidsequenceofPeDREB1A;PeDREB2A和PeDREB1A基因的氨基酸序列与拟南芥已知的53个DREB基因的氨基酸序列构建进化树，结果如图4-7所示。PeDREB2A与拟南芥DREB亚家族的GroupA6聚为一枝，PeDREB1A与拟南芥GroupA4聚为一枝，说明PeDREB2A和PeDREB1A分别属于毛竹DREB亚家族GroupA6和A4的成员。根据转录因子进化保守性可推测出PeDREB2A和PeDREB1A基因参与毛竹非生物胁迫响应过程。PeDREB2A与拟南芥Group49 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证A6的RAP2.4（AT1G22190）进行氨基酸序列比对分析显示，二者氨基酸组成的一致性达31.32%。RAP2.4定位于细胞核，特异结合GCC-box和DRE元件，在干旱和盐胁迫条件下起上调作用（Linetal.，2007），可推测PeDREB2A基因可能参与干旱和盐胁迫应答。PeDREB1A与拟南芥GroupA4的TINY2（AT5G11590）进行氨基酸比对分析显示，二者氨基酸组成的一致性达21.35%。TINY2能够响应ABA、低温、干旱、高盐和轻度机械伤害迅速表达，转录产物快速积累，提高拟南芥植株的耐逆性（Weietal.，2005），由此可预测PeDREB1A基因可能对多种非生物胁迫响应表达。图4-7PeDREB2A，PeDREB1A和拟南芥DREBs基因构建的进化树Fig.4-7PhylogenetictreeofPeDREB2A,PeDREB1AandArabidopsisthalianaDREBsgenes.将PeDREB2A和PeDREB1A蛋白序列的保守域分别与拟南芥对应的子家族基因的保守域进行比对，结果显示这些基因的结构域同源性非常高，如图4-8所示。基于PeDREB2A氨基酸序列与拟南芥同源基因氨基酸序列比对，发现其具有37个保守氨基酸，1L、2Y、3R、4G、5V、6R、7Q、8R、10W、11G、12K、13W、14V、15A、16E、17I、18R、20P、23R、25R、27W、28L、29G、30T、37A、38A、40A、41Y、42D、45A、49R、50G、53A、55L、56N、57F、58P。基于PeDREB1A氨基酸序列与拟南芥同源基因比对，发现其具有26个保守氨基酸，3R、5R、7R、12K、13W、14V、50 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证15S、16E、17I、18R、20P、25R、27W、28L、29G、36M、37A、40A、42D、44A、45A、50G、55L、56N、57F、58P。研究报道AP2/ERF结构域的YRG由19-22个氨基酸残基组成，主要是碱性氨基酸，其有利于与目标基因结合，而RAYD元件包含42-43个氨基酸残基，其中含有一个由18个氨基酸残基构成的α螺旋，通过改变YRG区域的构象或者与其他蛋白质互作来调节AP2/ERF结构域与目标基因的特异性结合（Allenetal.，1997；Okamuroetal.，1997），这2个基因的AP2/ERF结构域也含有YRG和RAYD两个保守基序，可推测这2个基因的AP2/ERF结构域与特异结合目标基因有关。图4-8PeDREB2A（A）和PeDREB1A（B）蛋白序列的AP2/ERF保守结构域氨基酸序列分别与拟南芥GroupA6和A4的氨基酸序列比对Fig.4-8ComparisonofthededucedaminoacidsequencesoftheAP2/ERFdomainsoftheDREBSubfamilyproteinsfromGroupA6orA4inArabidopsisthalianaandPeDREB2A(A)orPeDREB1A(B).4.2.3目的基因的组织特异性表达检测半定量PCR方法分析结果显示，PeDREB2A和PeDREB1A基因在叶片、幼茎和根中皆有表达，表明这2个基因为组成型表达基因（谢登雷等，2013），如图4-9所示。PeDREB2A在根中表达量显著高于叶片和幼茎，而在叶片和幼茎中表达量较低且在这2个组织中表达差异不明显；PeDREB1A在叶片和幼茎中的表达量非常高且表达量一致，根中的表达量却较低。这2个基因在不同组织中表达量存在一定的差异，具有组织表达特异性。51 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证PeDREB1A在叶片和幼茎组织中表达量明显高于PeDREB2A，在根中表达量与PeDREB2A相似，它们在不同组织中表达水平不一致也说明这2个基因为两个不同的基因。图4-9PeDREB2A和PeDREB1A基因的组织特异性表达Fig.4-9RT-PCRanalysesofPeDREB2AandPeDREB1Agenes.4.2.4干旱处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化PeDREB2A和PeDREB1A基因均受到干旱诱导，结果如图4-10和4-11所示。叶片中，2个基因均呈先升后降的趋势，PeDREB2A基因在处理12h时表达量出现峰值，是正常培养条件下的98.33倍，而PeDREB1A基因在处理1h时表达量达到最高值，是正常培养条件下的3.3倍，结果说明PeDREB2A基因在叶片响应干旱胁迫提高毛竹幼苗抗旱性方面发挥极其重要的作用。在根中，PeDREB2A基因在干旱诱导0.5h时表达量迅速下降到对照组的0.118倍，处理6h时仅为对照组的0.05倍达最低值，随着处理时间的延长，表达量恢复正常水平，发挥下调表达的作用；PeDREB1A基因在0-24h之间表达产物持续增加，未出现表达峰，因此补充测定了48h和72h这两个时间点基因的表达量，结果显示48h时表达量达最高值，为对照组的17.13倍，72h时表达量降低，PeDREB1A基因在根响应干旱胁迫过程中起着重要的作用。PeDREB2A基因在叶片中相对表达量高，发挥正调控作用，反之在根中的相对表达量低，这可能与基因的组织特异性表达有关。4.2.5低温处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化低温处理下，PeDREB2A和PeDREB1A基因表达模式变化结果如图4-12和4-13所示。低温诱导下PeDREB2A基因在叶片中相对表达量较低且呈先升高后降低的趋势，1h时表达量达到对照的4.2倍，随后表达量水平迅速恢复到正常水平，而在根中表达量水平52 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证低于对照组的表达量，起下调表达的作用。根据PeDREB2A基因在低温处理下表达模式变化分析，此基因在低温胁迫下相对表达量非常低，可能意味着此基因在低温胁迫下调控作用微弱。PeDREB1A基因在叶片和根中表达量均呈先升后降的趋势，均在3h时表达量达到最高，分别是对照的13.71倍和4.49倍，说明PeDREB1A基因可响应低温胁迫发挥正调控的作用，在提高毛竹幼苗抗寒性方面发挥着极为重要的作用，且在叶片中具有更重要的功能。图4-1020%PEG6000不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在叶片中相对表达量Fig.4-10RelativeexpressionofPeDREB2AandPeDREB1Aunderdifferenttimeof20%PEG6000treatmentinleaf图4-1120%PEG6000不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在根中相对表达量Fig.4-11RelativeexpressionofPeDREB2AandPeDREB1Aunderdifferenttimeof20%PEG6000treatmentinroot53 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-124℃不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在叶片中相对表达量Fig.4-12RelativeexpressionofPeDREB2AandPeDREB1Aunderdifferenttimeof4℃treatmentinleaf图4-134℃不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在根中相对表达量Fig.4-13RelativeexpressionofPeDREB2AandPeDREB1Aunderdifferenttimeof4℃treatmentinroot4.2.6盐处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因表达的变化盐处理下PeDREB2A和PeDREB1A基因的相对表达量变化结果如图4-14和4-15所示。在叶片中PeDREB2A基因表达量呈先升后降的趋势，0.5h时表达量达到最高，是对照组的15.86倍，此基因在盐处理初期起重要的作用；在根中，PeDREB2A基因的表达量变化小。PeDREB1A基因在叶片中表达量几乎没有发生变化，在根中表达量虽呈先升后降的趋势，表达水平变化不明显，表明PeDREB1A基因对盐胁迫响应几乎不表达。54 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-14250mmol/LNaCl不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在叶片中相对表达量Fig.4-14RelativeexpressionofPeDREB2AandPeDREB1Aunderdifferenttimeof250mmol/LNaCltreatmentinleaf图4-15250mmol/LNaCl不同时间下PeDREB2A和PeDREB1A在根中相对表达量Fig.4-15RelativeexpressionofPeDREB2AandPeDREB1Aunderdifferenttimeof250mmol/LNaCltreatmentinroot4.2.7PeDREB2A和PeDREB1A过表达载体的构建本实验用BamHI和HindIII双酶切pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB2A和pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB1A纯化质粒，酶切结果显示这2个已构建的植物表达载体酶切出的小片段大小分别与PeDREB2A和PeDREB1A基因大小相同，酶切后的大片段大小在7000-10000bp之间，与植物表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S大小一致（图55 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证4-16）。进一步对纯化后的重组质粒进行测序，结果表明重组质粒插入片段与相应的目的基因完全一致。上述结果说明已经获得正确的带有35S启动子的重组质粒，表明植物表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB2A和pCAMBIA2300-CaMV35S-PeDREB1A构建成功。其结构如图4-17所示。图4-16pCAMBIA2300-PeDREB2A和pCAMBIA2300-PeDREB1A双酶切电泳Fig.4-16Electrophoresisofthedoubleenzyme-digestedpCAMBIA2300-PeDREB2AandpCAMBIA2300-PeDREB1A注：A是pCAMBIA2300-PeDREB2A双酶切产物电泳，B是pCAMBIA2300-PeDREB1A双酶切产物电。M.DL15000；泳道1为PCR回收产物，泳道2为重组质粒，泳道3、4、5为质粒酶切产物。Note:AistheElectrophoresisofthedoubleenzyme-digestedpCAMBIA2300-PeDREB2A;BistheElectrophoresisofthedoubleenzyme-digestedpCAMBIA2300-PeDREB2A.M.MarkermoleculeDL10000;Lane1istherecycledproductofPCR,Lane2istheplasmid,Lane3,4,5arethedoubleenzyme-digestedproductsofplasmid.图4-17pCAMBIA2300-PeDREB2A和pCAMBIA2300-PeDREB1A表达载体框架Fig.4-17StructuremapofpCAMBIA2300-PeDREB2AandpCAMBIA2300-PeDREB1Aexpressingframework56 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证4.2.8转基因拟南芥纯合体株系的筛选将收集的T0代种子经100mg/L卡那霉素抗性固体培养基筛选后获得T1代转基因株系数分别为：PeDREB1A基因125个株系，PeDREB2A基因83个株系。卡纳抗性培养基上筛选结果如图4-18和4-19所示。收集T1代转基因各株系的种子，再经100mg/L卡那霉素抗性固体培养基筛选，获得T2代转基因拟南芥株系。经RT-PCR检测后获得目的基因可转录表达的株系数分别为：PeDREB1A基因15个株系，PeDREB2A基因13个株系。收集T2代转基因各株系的种子，经100mg/L卡那霉素抗性固体培养基筛选进行纯合体植株的筛选，得到T3代转基因拟南芥纯合体株系：PeDREB1A基因9个株系，PeDREB2A基因7个株系。图4-18在卡纳霉素平板上筛选PeDREB2AT0代转基因拟南芥幼苗Fig.4-18SelectionoftheT0generationseedingsbyusingthecontainedkanamycinculturemediumofoverexpressionPeDREB2AinArabidopsis图4-19在卡纳霉素平板上筛选PeDREB1AT0代转基因拟南芥幼苗Fig.4-19SelectionoftheT0generationseedingsbyusingthecontainedkanamycinculturemediumofoverexpressionPeDREB1AinArabidopsis57 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证4.2.9转基因拟南芥胁迫响应功能验证经各浓度盐胁迫后，发现PeDREB1A基因和PeDREB2A基因的转基因幼苗在50mmol/LNaCl培养基中生长变化与野生型相比较无明显差异，无胁迫现象出现；在200mmol/LNaCl培养基中转基因幼苗与野生型幼苗均受到高盐胁迫抑制生长，变化无明显差异；在100mmol/LNaCl培养基中转基因幼苗与野生型幼苗比较，有比较明显的胁迫响应特征，PeDREB1A基因和PeDREB2A基因转基因株系幼苗的根均比野生型植株幼苗的根生长速度快，相对伸长长度长，如图4-20和4-21所示。在上述研究的基础上，又将T2代纯合体转基因拟南芥种子播种于100mmol/LNaCl培养基上，经观察发现，PeDREB2A转基因种子平均发芽时间为4d，PeDREB1A转基因种子平均发芽时间为5d，而野生型拟南芥种子平均发芽时间为6d，且转基因株系幼苗的侧根数明显多于野生型拟南芥幼苗的侧根数，野生型拟南芥幼苗的体型也较小，如图4-22所示。经4℃低温处理后，野生型拟南芥幼苗的叶片逐渐变黑，呈墨绿色，而两个目的基因的转基因拟南芥幼苗的叶片仍保持绿色，表明转基因拟南芥幼苗抗低温能力较强，如图4-23和4-24所示。经PEG8000模拟干旱胁迫后，仔细观察幼苗变化，结果发现PeDREB1A基因和PeDREB2A基因的转基因株系抗旱性状不明显。4.3讨论DREB转录因子参与非生物胁迫信号转导途径，下游大量的胁迫相关基因被其诱导表达，从而提高植物的非生物胁迫耐逆性，尤其在抵抗干旱、低温和高盐胁迫方面。在本研究中，克隆了两个毛竹DREB基因，PeDREB2A和PeDREB1A，这两个基因均包含一个AP2/ERF保守结构域，与拟南芥DREB基因具有较高的同源性和相似的基因结构，如保守的氨基酸残基和基序。保守的氨基酸序列结构可能在一个转录因子家族基因功能觉得方面发挥特定的作用。AP2/ERF结构域区域中包含两个非常保守的氨基酸残基，分别是第14位的缬氨酸（valine，V）和第19位的谷氨酸（glutamate，E）。这个结构特点58 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-20PeDREB1AT3转基因拟南芥7d大小幼苗培养基中盐胁迫处理Fig.4-20TheresultsofPeDREB1AtransgenicArabidopsis7dsizeseedlingstransplantedinto100mmol/LNaClmediumstresstreatment注：WT为野生型拟南芥，L1-3为转基因拟南芥。WTisthewild-typeArabidopsisthaliana,L1-3arethetransgenicarabidopsisthaliana.图4-21PeDREB2AT3转基因拟南芥7d大小幼苗培养基中盐胁迫处理Fig.4-21TheresultsofPeDREB2Atransgenicarabidopsis7dsizeseedlingstransplantedinto100mmol/LNaClmediumstresstreatment注：WT为野生型拟南芥，L1-3为转基因拟南芥。WTisthewild-typeArabidopsisthaliana,L1-3arethetransgenicarabidopsisthaliana.59 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-22PeDREB2A和PeDREB1AT3代转基因拟南芥种子播种培养基中盐胁迫处理Fig.4-22TheresultsofPeDREB2AandPeDREB1Atransgenicarabidopsisseedssowedinto100mmol/LNaClmediumstresstreatment注：WT为野生型拟南芥，L1-3为转基因拟南芥。WTisthewild-typeArabidopsisthaliana,L1-3arethetransgenicarabidopsisthaliana.图4-23PeDREB1A转基因拟南芥幼苗经4℃低温胁迫处理Fig.4-23TheresultsofPeDREB1AtransgenicArabidopsisseedingsunder4℃treatment注：WT为野生型拟南芥，L1-3为转基因拟南芥。WTisthewild-typeArabidopsisthaliana,L1-3arethetransgenicarabidopsisthaliana.60 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证图4-24PeDREB2A转基因拟南芥幼苗经4℃低温胁迫处理Fig.4-24TheresultsofPeDREB2AtransgenicArabidopsisseedingsunder4℃treatment注：WT为野生型拟南芥，L1-3为转基因拟南芥。WTisthewild-typeArabidopsisthaliana,L1-3arethetransgenicarabidopsisthaliana.是DREB亚家族基因和ERF亚家族基因区分的标志，ERF亚家族基因的AP2/ERF结构域第14位为丙氨酸（alanine，A），第19位为天冬氨酸（aspartate，D）（Agarwaletal.，2007）。目前研究报道第19位的谷氨酸的保守性低于第14位的缬氨酸（Sakumaetal.，2002）。比如，At1G64380和At4G39780两个基因的AP2/ERF结构域第19位为亮氨酸（leucine，L）。这可能意味着第14位的缬氨酸在特异结合目标基因的DNA结合域过程中发挥更加重要的作用。与At1G64380和At4G39780两个基因相似的是，PeDREB2A基因的第19位也是亮氨酸。包含保守基序的同一亚家族的蛋白更有可能具有相似的功能（Nakanoetal.，2006）。AP2/ERF结构域包含YRG和RAYD两个元件，其在激活DNA结合域调控拟南芥目标基因的表达方面发挥重要的作用（Okamuroetal.，1997）。YRG元件包含19-22个氨基酸残基，几乎全部为碱性氨基酸，其作用是辅助转录因子结合目标基因。RAYD元件由42或43个氨基酸残基组成，且包含一个由18个氨基酸组成的α-螺旋，能够改变YRG元件的构象或介导其他蛋白质来调控对目标基因的特异结合（Allenetal.，1997；Okamuroetal.，1997）。在PeDREB2A和PeDREB1A基因中也存在YRG和RAYD元件，表明这两个元件的功能必要性。2010年和2012年Liu等人（Liuetal.，2010；Liuetal.，2012）分离了两个毛竹DREB基因，一个是干旱响应基因PeDREB2A，另一个61 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证是低温响应基因PeDREB1A。将这两个基因与本研究分离的两个基因基序氨基酸序列比对，发现它们不仅ORF长度不同，而且氨基酸序列也不同，所以表明本研究获得了两个新的毛竹DREB基因。PeDREB2A和PeDREB1A基因在毛竹幼苗的根、幼茎和叶片中皆有表达，说明这两个基因具有组织表达特异性。在未经胁迫处理的毛竹幼苗中，PeDREB2A基因在根中的表达量显著高于叶片和幼茎中的表达量。相反的是，PeDREB1A基因在叶片和幼茎中的表达量显著高于根中的表达量。这一现象可能可以解释不同的氨基酸序列导致不同的基因结构和不同的组织表达模式，而且这些结果为进一步研究基因功能提供了基础信息。DREB1s和DREB2s蛋白是AP2/ERF家族中两类重要的转录因子，这两类蛋白参与两条不同的信号转导途径，分别是低温和干旱信号传导途径（LataandPrasad，2011）。PeDREB2A和PeDREB1A基因在干旱、低温和盐胁迫处理下叶片中的表达模式分析结果显示，PeDREB2A基因主要响应干旱和盐胁迫，PeDREB1A基因主要响应低温胁迫，这可能意味着PeDREB2A基因主要参与干旱胁迫信号转导途径，PeDREB1A基因在低温胁迫信号转导途径中发挥重要的作用。关于植物耐逆性的研究大部分只关注了叶片中基因表达模式的变化（Niuetal.，2010；Zhaoetal.，2013；Liangetal.，2014），却很少关注根中的基因表达模式。本研究也对PeDREB2A和PeDREB1A基因在干旱、低温和盐胁迫处理下根中的表达模式进行了研究，为进一步明确目的基因在不同植物组织中的表达模式提供依据。在根中PeDREB2A基因在响应三种胁迫过程中发挥下调表达的作用，然而，PeDREB1A基因在响应三种胁迫过程中表达量呈先升后降的趋势，尤其在干旱胁迫过程中表达量较高。这些结果表明PeDREB1A基因在根中响应非生物胁迫过程中发挥着比PeDREB2A基因更重要的作用。综合分析PeDREB2A和PeDREB1A基因的表达模式，表明这两个基因在毛竹不同组织中响应非生物胁迫发挥重要的功能。种子的快速发芽，根的快速伸长以及侧芽数的增多是植物抗非生物胁迫的重要指标，如低温和盐胁迫（Sharifipeyman，2010；Cavusogluetal.，2007）。本研究中，100mmol/LNaCl盐胁迫培养基下，超表达PeDREB1A和PeDREB2A转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种子萌芽快，根伸长速度快，侧根数量多，说明这两个基因均可提高毛竹的耐盐性。超表达PeDREB1A和PeDREB2A转基因拟南芥幼苗表现出更耐低温的特性，叶片保持持62 第四章毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及功能验证久的绿色。通过干旱模拟实验并未发现转基因拟南芥幼苗出现抗旱性状，这可能是由于胁迫处理浓度过高或过低的缘故造成的，其在干旱胁迫响应过程中的功能验证还需进一步的研究。综上所述，超表达PeDREB1A和PeDREB2A转基因拟南芥耐盐和耐低温的特性增强，说明PeDREB1A和PeDREB2A基因在毛竹抗非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。4.4小结在本研究中，分离了两个重要的增强毛竹耐逆性的DREB基因，为组成型表达基因。它们在干旱、低温和盐胁迫条件下的表达模式也初步明确。本研究构建了PeDREB1A基因和PeDREB2A基因的植物超表达载体，并通过农杆菌浸染法转化野生型拟南芥获得了转基因拟南芥纯合体株系。通过干旱、低温和盐胁迫培养基验证了这2个目的基因响应这三种胁迫的功能，结果表明，这2个基因在低温和盐胁迫下均发挥重要的作用，而在模拟干旱胁迫下抗旱性状不明显，需要进一步的研究。63 第五章结论与展望第五章结论与展望5.1结论本研究在毛竹基因组数据库的基础上，对毛竹AP2/ERF家族基因进行了生物信息学分析，分析结果发现毛竹DREB亚家族基因成员数较其他物种同亚家族基因数少，故应用qRT-PCR方法对DREB亚家族基因在干旱、高盐和低温胁迫下的表达模式变化进行分析；然后我们筛选出PeDREB2A和PeDREB1A基因，通过转基因拟南芥超表达验证其功能。本研究的主要结论如下：（1）本研究共鉴定出121个PeAP2/ERF转录因子，对其中116个转录因子进行了分析，结果表明，116个PeAP2/ERF基因可被分为3个亚家族：AP2、RAV和ERF，其中ERF亚家族又可被分为11个Group。在116个转录因子中，有52个PeAP2/ERF转录因子含有内含子，其主要为AP2亚家族转录因子和大部分的GroupVII转录因子。PeAP2/ERF转录因子中存在的保守基序在拟南芥和水稻相应的亚家族和Subgroup转录因子中同样存在。进化模式和分离分析显示，PeAP2/ERF基因在1500万年前经历了一次大规模复制事件，毛竹和水稻的AP2/ERF基因分离时间在1500-2300万年前。毛竹PeDREB基因的启动子区域存在大量的干旱、高盐、低温等非生物胁迫相关的顺式作用元件。（2）在响应干旱、低温和盐胁迫这三种非生物胁迫时，大多数的PeDREB基因在叶片中发挥负调控的作用，而在根中发挥正调控的作用。（3）克隆并分析了2个关键的毛竹耐逆性相关的DREB基因，分别为PeDREB2A（ID号：PH01000046G1730）基因和PeDREB1A（ID号：PH01000668G0350）基因，这2个基因均为组成型表达基因。PeDREB2A基因在叶片中响应干旱和高盐胁迫诱导强烈表达，在低温胁迫条件下表达量低。PeDREB1A基因在叶片中响应干旱和低温胁迫低表达，而在根中响应三种胁迫诱导持续高表达。64 第五章结论与展望通过干旱、低温和盐胁迫培养基对超表达PeDREB2A和PeDREB1A转基因拟南芥进行功能验证，结果发现，转基因拟南芥在盐胁迫下种子发芽和根伸长速度比野生型拟南芥快，侧根数多于野生型拟南芥；在4℃低温胁迫下转基因拟南芥可保持正常的绿色。说明这2个基因在低温和盐胁迫下均发挥重要的作用，而在模拟干旱胁迫下抗旱性状不明显。5.2展望本研究采用多种生物信息学分析软件对毛竹AP2/ERF家族基因的序列、结构及其进化机制等进行了全面分析，筛选出毛竹抗非生物胁迫的关键基因，并用RT-PCR、qRT-PCR及转基因等技术方法对候选基因进行了初步的功能验证。这些研究在很大程度上将有助于揭示毛竹抗逆分子机制。但毛竹的抗逆分子机制方式多样，如多条信号转导途径的协调参与，多个转录因子家族的共同调控，本研究仍存在许多的不足，需进一步的深入研究与完善。本研究只对PeAP2/ERF基因家族进行了研究，并没有综合研究其他与抗非生物胁迫相关的转录因子家族之间的相互作用机制，这将成为下一步研究的重点。由于竹类植物的遗传转化体系尚未建立，后续的基因功能验证只能通过转化模式植物拟南芥或水稻等物种，存在一定的局限性。这是制约竹子遗传改良的瓶颈，也是竹类植物研究亟待解决的难题。65 参考文献参考文献AgarwalP,AgarwalPK,NairS,etal.Stress-inducibleDREB2AtranscriptionfactorfromPennisetumglaucumisaphosphoproteinanditsphosphorylationnegativelyregulatesitsDNA-bindingactivity[J].MolecularGeneticsandGenomics,2007,277(2):189-198.AkhterMS,MohammedN,KoujiS,etal.Genestructures,classificationandexpressionmodelsoftheAP2/EREBPtranscriptionfactorfamilyinrice[J].PlantCellPhysiol,2011,52(2):344-366.AkhtarM,JaiswalA,JaiswalJP,etal.Cloningandcharacterizationofcold,saltanddroughtinducibleC-repeatbindingfactorgenefromahighlycoldadaptedecotypeofLepidiumlatifoliumL[J].PhysiologyandMolecularBiologyofPlants,2013,19(2):221-230.AlizadehH,MohammadiV,ShafeinieA,etal.OverexpressionofArabidopsisdehydration-responsiveelement-bindingprotein2Aconferstolerancetosalinitystresstotransgeniccanola[J].PakistanJournalofBiologicalSciences,2014,17(5):619-629.AlbrechtV,RitzO,LinderS,etal.TheNAFdomaindefinesanovelprotein-proteininteractionmoduleconservedinCa2+-regulatedkinases[J].EuropeanMolBiolOrg,2001,20:1051-1063.AllenRD,WebbRPandSchakeSA.Useoftransgenicplantstostudyantioxidantdefenses[J].FreeRadicalBiologyandMedicine,1997,23:473-479.AlonsoJM,StepanovaAN,LeisseTJ,etal.Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana[J].Science,2003,30:653-657.AlvesMS,DadaltoSP,GonçalvesAB,etal.Transcriptionfactorfunctionalprotein-proteininteractionsinplantdefenseresponses[J].Proteomes,2014,2(1):85-106.AmbawatS,SharmaP,YadavNR,etal.MYBtranscriptionfactorgenesasregulatorsforplantresponses:anoverview[J].PhysiologyandMolecularBiologyofPlants,2013,19(3):307-321.AnZW,XieLL,WangQT,ETAL.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationoftranscriptionfactorHbERF1inheveabrasiliensis[J].ScientiaAgriculturaSinica,2014,47(8):1622-1633.66 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附录表B-1鉴定的121个毛竹AP2/ERF家族基因Tab.B-1Putative121AP2/ERFfamilygenesidentifiedinmosobamboo.CDSProteinMWSubcellularGeneIDPIClassificationlengthlength（kDa)LocalizationPH01000046G1730795264299.47n/9.92IbPH01000242G139079226328.59.05n/4.92IbPH01002393G02308642873111.07n/9.84IIaPH01000887G050052217317.65.88n/9.68IIbPH01001003G016069022923.85.01n/9.00IIbPH01001205G003055218319.74.85n/9.90IIIbPH01000017G095057018920.15.13n/9.94IIIcPH01000131G124073524425.65.11n/9.73IIIcPH01001480G040073224325.65.6n/9.83IIIcPH01000023G103082227328.45.2n/9.90IIIdPH01000668G035082527428.85.34n/9.92IIIdPH01000343G078078626127.86.31n/9.90IIIdPH01003772G017080726828.47.13n/9.90IIIdPH01000841G040078626127.65.13n/9.93IIIdPH01000668G0390624207225.49n/9.89IIIdPH01000343G083065421722.95.53n/9.92IIIdPH01088680G0010657218235.53n/9.89IIIdPH01003107G007073824526.35.19n/9.90IIIdPH01003772G018065721823.25.24n/9.89IIIdPH01003475G0200100533436.35.92n/9.68IIIePH01000124G027066922223.86.18n/9.95IIIePH01000098G118077725828.75.03n/9.91IVaPH01003928G008068122625.45.35n/9.88IVaPH01000022G005052517418.84.5n/9.78IVbPH01000188G098091830532.66.55n/9.38IVbPH01001487G041069323024.85.03n/9.35IVbPH01002279G025081627128.78.1n/9.21IVbPH01000791G082061520422.29.18n/9.62VaPH01000182G063086128630.324.73n/5.34VIPH01000568G075088529431.144.88n/8.94VIPH01001773G007075625126.875.73n/9,82VIPH01001057G0620101733835.964.58n/8.44VIPH01001381G048052517419.059.64n/9.66VIPH01003923G011078326028.95.18n/7.60VI89 附录PH01000320G046096632134.44.79n/6.45VI-LPH01003811G010085828531.554.66Ch/5.03VI-LPH01004434G004084928231.324.7n/7.78VI-LPH01003506G0180111937240.74.72n/9.90VIIaPH01000014G0360108035939.714.82n/9.88VIIaPH01001102G0050107735839.595.00n/9.93VIIaPH01000210G1070111337040.814.7n/9.90VIIaPH01001080G0230120039942.955.12n/9.51VIIaPH01002593G0060121540443.374.91n/9.79VIIaPH01000364G115064521423.616.22n/9.72VIIaPH01000027G2350114037941.135.3n/9.27VIIaPH01001864G007056718819.737.67n/6.44VIIaPH01003023G001070223325.496.65n/4.99VIIaPH01000038G084075325027.666.36n/9.83VIIaPH01000115G042099933236.115.55n/9.05VIIaPH01000115G0490103234336.464.57n/9.79VIIaPH01000115G047087929231.414.5n/8.83VIIaPH01000038G091094531433.984.59n/6.46VIIaPH01026494G001054017918.777.63n/9.83VIIaPH01002733G027057619121.116.19n/6.62VIIaPH01001704G027053117619.738.76n/9.76VIIbPH01000069G056030910211.159.45n/8.70VIIIaPH01000093G189056118619.038.97n/9.70VIIIaPH01000573G067061820521.49.24n/9.92VIIIaPH01000573G064066322022.99.2n/9.81VIIIaPH01000890G03606122032110.87n/9.56VIIIaPH01000084G117082227328.810.68n/4.40VIIIaPH01002604G029068422723.39.41n/9.92VIIIaPH01001489G054068722824.49.52n/9.82VIIIaPH01000032G174070823523.89.65n/9.89VIIIaPH01001112G065051617118.3310.07n/9.87VIIIaPH01001609G041052217318.539.6n/9.91VIIIaPH01001112G062070823524.29.66n/9.74VIIIaPH01002571G030075325027.65.93n/9.88IXbPH01000171G088077125628.126.01n/9.89IXbPH01001938G033078326028.529.04n/9.95IXcPH01001229G022083127629.777.72n/9.93IXcPH01000085G001060920221.439.75n/9.89IXcPH01000004G0570102334036.349.16n/9.78Xa90 附录PH01001201G0350103234335.416.33n/9.77XaPH01002648G030053117619.1911.07n/9.90XaPH01000493G015077725828.145.37n/9.66XbPH01000149G085080126628.795.27n/9.45XbPH01000559G063081026929.215.32n/9.87XbPH01000437G039069923224.98.6n/9.92XbPH01000173G070066622123.499.86n/9.94XbPH01000007G1520180960264.766.7n/9.84AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01000135G0570921306335.37n/7.22AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01000193G0900183961265.465.88n/9.69AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01000379G0890116138642.438.85n/9.86AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01000428G0870123641144.095.9n/9.89AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01000597G0530141046950.556.02n/9.94AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01000948G0320141046951.147.67n/9.88AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01001206G0160126041945.238.54n/9.90AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01001338G0140192664167.416.68n/9.94AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01001341G0150126041946.434.96n/9.92AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01001432G0330117339042.325.76n/9.87AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01001762G0240144648152.058.77n/7.25AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01002011G0250112537442.29.04n/9.48AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01002603G0280125141646.515.02n/9.89AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01002652G023067822525.219.62n/9.94AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01003083G016073824526.665.21n/9.82AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01003525G003096332035.159.06n/9.92AP2（twoAP2/ERFdomain）PH01003432G003090630133.445.24n/9.69AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01001057G046090630132.136.86n/9.68AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01000604G058097232335.359.24n/9.91AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01003011G019062120622.039.18n/9.91AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01005239G007071723825.929.51n/9.92AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01001038G0080144648152.19.21n/7.84AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01000169G143095431734.276.03n/9.87AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01002097G011054918220.510.16n/9.94AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01004181G003073224325.885.32n/5.25AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01000443G045089129632.234.47Ch/6.06AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01003515G007093331032.934.48n/5.49AP2（oneAP2/ERFdomain）PH01000015G1290107435738.89.44n/9.89RAVPH01000024G2370101733836.079.51n/9.90RAVPH01000281G0890107135638.889.4n/9.88RAVPH01000297G0830113437740.29.68n/9.93RAV91 附录PH01000581G0530102634136.099.6n/9.94RAVPH01001971G0060114338040.169.17n/9.92RAVPH01001568G0220107435738.919.34n/9.86RAVPH01001018G009066922225.249.14n/9.90SoloistPH01000303G010040813514.296.15n/9.93theothersPH01000028G160064221322.294.47n/8.76theothersPH01002652G024059119621.124.45n/8.80theothersPH01004233G007052817519.046.79n/8.77theothersPH01195697G001049516417.54.74n/8.79theothers92 附录表B-2毛竹AP2/ERF亚家族基因Tab.B-2TheERFsubfamilygenesinmosobambooGroupNameIDNameGeneNameIbPH01000046G1730PeDREB2AIbPH01000242G1390IIaPH01002393G0230IIbPH01000887G0500IIbPH01001003G0160IIIbPH01001205G0030IIIcPH01000017G0950IIIcPH01000131G1240IIIcPH01001480G0400IIIdPH01000023G1030IIIdPH01000668G0350PeDREB1AIIIdPH01000343G0780IIIdPH01003772G0170IIIdPH01000668G0390IIIdPH01088680G0010IIIdPH01000343G0830IIIdPH01000841G0400IIIdPH01003772G0180IIIdPH01003107G0070IIIePH01003475G0200IIIePH01000124G0270IVaPH01000098G1180PeDREB2IVaPH01003928G0080PeDREB1IVbPH01001487G0410IVbPH01002279G0250IVbPH01000022G0050IVbPH01000188G0980VaPH01000791G0820VIPH01001057G0620VIPH01001381G0480VIPH01003923G0110VIPH01000182G0630VIPH01000568G0750VIPH01001773G0070VI-LPH01000320G0460VI-LPH01003811G010093 附录VI-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 附录XbPH01000493G0150XbPH01000559G0630XbPH01000173G0700XbPH01000437G039095 附录表B-3毛竹PeAP2/ERF家族转录因子保守基序（CMPes）Tab.B-3Summaryofconservedmotifs(CMPes)withinPeAP2/ERFfamily基序基序序列GroupIKLYRGVRQRQWGKWVAEIRLPQNRVRVWLGTYDSPETAAHACMPeI-1YDRAAYKLRGEYARLNFPGVMDGRCMPeI-2RQLRAAVDAKIQAIRVRLAMDASLRTLSPASFPGEVRSAVSSLLLSPGASALDTVFSHLPPPVTCMPeI-3IPPLGSSVYYRQSELLRHFCMPeI-4ECLLERMPSFDPELIWEMLNFGroupIIKYKGVRMRKWGKWVSEIRLPNSRERIWLGSYDTPEAAARAYDCMPeII-1AALFCLRGPSARLNFCMPeII-2LSPASIQKVAAEAGAAVDALCMPeII-3FPDSPPPVVARTSDPREVYAFAVSHANRCMPeII-4(LWSYmotif)EDDEDIRLWSFCMPeII-5DEEAAFASPKCMDFMCMPeII-6SFDWSQLMANPPPLYGroupIIICMPeIII-1RKKSRIWLGTFPTAEMAARAHDVAALAIKGRAAHCMPeIII-2(LNFP,LRRPandLNFPDLAHSLPRPASASPKDIQAAAAD[I/V]QAAmotif)CMPeIII-3RMRSWGKWVSEIREPCMPeIII-4KRRKRxEGKHPVYRGCMPeIII-5(EARmotif)GDEEALFDLPDLLLDLRDGLMCMPeIII-6MFELDLFGEMDLDLYYASLAQGLLMEPPCMPeIII-7xSSSSSSSSSSSSSSSSESSACMPeIII-8(LWSYmotif)FRLEEPLLWECMPeIII-9(DSAWRmotif)LNFADSAWLLAVPPCMPeIII-10LSDLADVRRAAAEAVADFLRRCMPeIII-11TTSSDSGSCVINGAQEKSKNSKPKHLKRKRSTTPAPPPSCQCMPeIII-12(LWSYmotif)ADVALWSYCMPeIII-13LSCASSWDDDVGroupIVGGPENSRCDYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGARLWLGTFPTACMPeIV-1EEAALAYDEAARALYCMPeIV-2GEKSKRKAPAKGSKKGCMKGKCMPeIV-3(LWSYmotif)VFEPEGIVLHKEVNVSYDYFNVEELLEMIIVELNADQKMEVHEE96 附录YQDGDDGFSLFSYCMPeIV-4RKSDGPDSVAETIKRWKEYNECMPeIV-5GPxARLNLPALSAxAASGASCMPeIV-6VPAYGLLNLNAQHNVHVIHQRLQELKNCMPeIV-7EDFEAYVTRLPKAEDFGLEGFQEVCMPeIV-8LDEAGGGISIWDLTICPDMMPGroupVMQPKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEACMPeV-1ARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPVSLSQILSAKLRKCCKAPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARACMPeV-2DSNWVMTVELNKCMPeV-3MDDEEKIALQMIEELLNRSCMPeV-4PASPSHGEGEGSFVICMPeV-5QRNSTGDLAPAADQDARSNGGGroupVICMPeVI-1VWLGTFDTAEEAARVYDAAAIRLRGPSATTNFCMPeVI-2KFRGVRRRPWGKYAAEIRDPWCMPeVI-3RIVRIFCDDPDATDSSSDEEECMPeVI-4(SPTSVLmotif,PutativePSAGTADSGAASYDSGEESSHAASSPTSVLRSFPPLAILAphosphorylationsites)CMPeVI-5ARRRVKRxVHEIPLCMPeVI-6WQEDDEFQDIGDLFGCMPeVI-7MDEFMDLRPIKYTEHKTSIRKYTKGCSLTVPEELGEFVPFEDAPVYASSSFWDFEPEAGFLYAEPSSPECMPeVI-8APWDGroupVI-LPTSKYRGVRRRKWGKWAAEIRDPFRKSRKWLGTFDTEEEAAACMPeVI-L-1AYQAAKREFDAELAAIKAQSSVCMPeVI-L-2MLPPSRKVRVFCNDPDATDSSSDDEENFARLADVFPVSDFVGATDEPLDNDYIGLADISQLPLPITDPKFDLCMPeVI-L-3DAELDWDGFDFASMERELEIAKKVPMEIDPEPEDKHLLNFSSTPRANEISVDAFLGRIDELPVSDCMPeVI-L-4CVGPTDELPLDDCMPeVI-L-5EKRMIREVLLPMNNSKNCKSAKTLVPCGTTAELPDDPEFYKDILRGLQLPDIDPMDFRAGLDALDISDVPAYLCMPeVI-L-6DGEQCMPeVI-L-7SSAAISCVSSSVSCEQKAQCMPeVI-L-8MAPLKQQQMLLKKVLAKKPKTKRLSGFGLKPSAAFSKPHGroupVII97 附录KRKRKNQYRGIRQRPWGKWAAEIRDPRKGVRVWLGTFNTAEECMPeVII-1AARAYDAAARRIRGKKAKVNFPDCMPeVII-2MCGGAIISDFICMPeVII-3(LWSYmotif)LDGGSDESIDSLLNLDGSQDVASNMDLWSFDDMPMSCMPeVII-4DDDFEADFEEFEDDSCMPeVII-5TVKPAVNNLANTNAFSYPSADFTSNEPFVQPDNMPFVPAMNCMPeVII-6（PutativeSDQGSNSFGCSDFGWphosphorylationsites）CMPeVII-7SRRVTAGHLWPEAKKCMPeVII-8ENDTKTPDITSVLVPGroupVIIICMPeVIII-1RYRGVRKRPWGRYAAEIRDPAKKTRVWLGTFDTAEEAARAYCMPeVIII-2DAAAREFRGAKAKTNFPCMPeVIII-3(EARmotif)SAVxAARALPLDLDLNLPPPACMPeVIII-4AAAAAAGSDSSSSSTVESSSGCMPeVIII-5MPAAHPYYFLDQAAAAAVACMPeVIII-6EKVAAAAATGLALGVGGGAGGCMPeVIII-7HPHPHHHLYFGroupIXFRxYRGVRQRPWGKFAAEIRDSTRKGARVWLGTFDTAEEAARCMPeIX-1AYDQAAFSLRGSKAILNFPNEVVCMPeIX-2LALGAAGGSPVLALKRRHSIRKRRKGKKCMPeIX-3EQKPTVVELEDLGADYLEELLRSSECMPeIX-4(PutativephosphorylationLPPLSPLSPHPHFGFPQLTVNsites)CMPeIX-5EDQALDLIRAHLLDDCMPeIX-6SSSSSSSSEELSMREVKKERVLEEEEAANKADLAAASWDGMASAAAAIGGCMPeIX-7GMDFWEEMEELKGICGroupXRKRRYRGVRQRPWGKWAAEIRDPHKAARVWLGTFDTAEAAACMPeX-1RAYDEAALRFRGSRAKLNFPEDARCMPeX-2FSGISQEQEMSAIVSALTHVVAGGGTGPPCMPeX-3(Cysrepeatmotif)CARCGIDGCLGCDFFCMPeX-4DQLWDGLQDLMKLDEGDLWFCMPeX-5DYLQYAMLLQGCMPeX-6HDDNGGDASAAAKSDTLTPSPCSADAEERTCMPeX-7LTYPATTASWSGSSQYPPPPAP2subfamily98 附录CMPeA-1GNKDLYLGTYDTEEEAARAYDLAAIKYRGPNAVTNFPLSRYCMPeA-2SGFSRRSSIYRGVTRHRWTGRWEAHIWDVCMPeA-3EELKEMKNMTKEEFVASLRRQCMPeA-4ARAYDRAAIKFRGVTADINFRCMPeA-5GKQVYLGGFDTAHAAIEDINEPLAADDSAECINEPLAIVDGIEESLWSPCLDYELDSMPGCMPeA-6ANFSNSMNFSEWFNDAAFECMPeA-7DVKKIMESNTLLPGEAARRKKCMPeA-8WEARMGQLRAVsubfamilyAKLPSSKYKGVVPQPNGRWGAQIYERHQRVWLGTFPGEEEAACMPeR-1RAYDVAALCMPeR-2KVWRFRYSYWNSSQSYVLTKGWSRFVKEKGLCMPeR-3AAREHLFEKAVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKHFPLQLPCMPeR-4ELRFLAAHSKAEVVDMLRKHTYADELRQGCMPeR-5AEGKGVLLNFEDAAGCMPeR-6RFRGRDAVTNFPPAACMPeR-7AGPDKQLFIDCKKRKGTTTDGSDAPPVEKPKEARVVRLFGVDIAGDGCQKRGRAVEMALEQGCMPeR-8QEFFKRQCVGAHQHSPALGAFVLSoloistHRRKQYVDQEPCIMRGVYFKNMKWQAAIKVDKKQIHLGTVGTCMPeS-1QEEAARLYDRAAFMCGREPNFELLQKYTWDDFLALTRDTITSKKQRKVGLIRRNKADLFVGQSDGDCMPeS-2TEMINGGGSSHSEDGDADTSMVSLRRRRLLGLCSGKDSLPVDLPKPIANEKIVEVAHPNAKPFSCMPeS-3VHPLPLTKTSDVCMPeS-4SSNGSDSLKEDKNHYFPGKEI99 附录表B-4毛竹DREB亚家族基因启动子区域非生物胁迫相关顺式作用元件数统计Tab.B-4Summaryofabiotic-stressinduciblecis-elementsisinthepromoterregionsofDREBsubfamilygenesinmosobamboo.GenenamemotifPH0100PH0100PH0100PH0100PH01000PH0100PH01000Abioticsequence0017G00022G00023G10046G1098G1180131G1188G098stresscis-element95005003073002400S000133CCACGTGG0000000S000153CCGAC1312232S000174CACATG2023212S000175CTAACCA0000000S000176CNGTTR4353344Drought-S000177TAACTG0000010stressS000402ACCGAC0101002S000408WAACCA2224242S000413CATGTG2003212S000414ACGTG3130221S000415ACGT61114106108S000418RCCGAC0112012total17202525172420S000153CCGAC1312232Cold-S000402ACCGAC0101002stressS000407CANNTG1414182720424S000418RCCGAC0112012total1517192922726Salt-S000402ACCGAC0101002stressS000418RCCGAC0112012S000453GAAAAA2003100total2216114Heat-S000030CCAAT3473277stressS000418RCCGAC0112012total3585289Wound-sS000244AACGTGT1001000tressS000444AGATCCAA0000000S000457TGACY3543372total4544372100 附录（续）GenenamePH0100PH01000PH01000PH01000PH0100PH01000AbioticmotifSequence0242G13343G078124G027343G0830668G0668G039stresscis-element900003500S000133CCACGTGG000000S000153CCGAC100143S000174CACATG312031S000175CTAACCA100000S000176CNGTTR1064795DroughtS000177TAACTG011000-stressS000402ACCGAC100020S000408WAACCA212462S000413CATGTG312031S000414ACGTG111635S000415ACGT621024816S000418RCCGAC100122total261221353328S000153CCGAC100143Cold-S000402ACCGAC100020stressS000407CANNTG241924142820S000418RCCGAC100122total251924153223Salt-S000402ACCGAC100020stressS000418RCCGAC100122S000453GAAAAA500052total700194Heat-S000030CCAAT446597stressS000418RCCGAC100122total5466119S000244AACGTGT000000Wound-S000444AGATCCAA000000stressS000457TGACY5810383total5810383101 附录（续）GenenamemotifPH01000PH01000PH010010PH01001PH0100PH01001PH0100Abioticsequence841G040887G05003G0160205G0031480G0487G0412279G0stresscis-element0004000250S000133CCACGTGG0000002S000153CCGAC1103142S000174CACATG3016312S000175CTAACCA0000000S000176CNGTTR5094634Drought-S000177TAACTG0000000stressS000402ACCGAC0001011S000408WAACCA1043223S000413CATGTG3016312S000414ACGTG2002618S000415ACGT400818224S000418RCCGAC0001022total1711530331327S000153CCGAC0103142Cold-S000402ACCGAC0001011stressS000407CANNTG2842634301434S000418RCCGAC0001022total2852637311836Salt-S000402ACCGAC0001011stressS000418RCCGAC0001022S000453GAAAAA5010003total5012036Heat-S000030CCAAT4173213stressS000418RCCGAC0001022total4174235S000244AACGTGT1000000Wound-sS000444AGATCCAA0000000tressS000457TGACY72791044total82791044102 附录（续）GenenamemotifPH01002PH01003PH0100PH01003PH01003PH01003PH01088Abioticsequence393G023107G0073475G0772G017772G018928G008680G001stresscis-element002000000S000133CCACGTGG0000000S000153CCGAC2444260S000174CACATG3212100S000175CTAACCA0101000S000176CNGTTR11635840Drought-S000177TAACTG0000100stressS000402ACCGAC1211010S000408WAACCA1056100S000413CATGTG3212100S000414ACGTG3020800S000415ACGT104861400S000418RCCGAC2213030total3019222628110S000153CCGAC2444260Cold-S000402ACCGAC1211010stressS000407CANNTG262714181660S000418RCCGAC2213030total2831182218120Salt-S000402ACCGAC2211010stressS000418RCCGAC2213030S000453GAAAAA3037010total74511050Heat-S000030CCAAT6663540stressS000418RCCGAC2213030total8876570S000244AACGTGT0010000Wound-stS000444AGATCCAA2000200ressS000457TGACY85541030total105641230103 附录表B-5qRT-PCR基因表达研究所用到的上游引物和下游引物Tab.B-5ForwardandreverseprimersusedintheqRT-PCRgenesexpressionstudiesGenenameSequence（5’to3’）GenenameSequence（5’to3’）PH01000017G0950-FCGCTAAACTTCCCCGACACPH01000668G0390-FCCGTCACCTCCTCTTCGTPH01000017G0950-RAAAACGTCATCCTCGTCCACPH01000668G0390-RCTCCTGGACATCCTTGGGPH01000022G0050-FCGGAGAACATGAAACACAPH01000791G0820-FCTACGAGCAACCTGTCCCPH01000022G0050-RGGAAAGAGAACAAGACGCPH01000791G0820-RTCCTCTCCTCATCATCCAPH01000023G1030-FTCGTCCTTGTCCATTTCCPH01000841G0400-FTCCTCCACCGTCACGGACPH01000023G1030-RTGCTGCTCTCCTCTCCCTPH01000841G0400-RCGACACCCACTTGCCCCAPH01000046G1730-FCGAGGAGAACAAGGAGAACGPH01000887G0500-FTCGTGGGTGTCGGAGATCPH01000046G1730-RATCAACTCGGGATCAAACGAPH01000887G0500-RGCTGCAGGCCGGGGTGGTPH01000098G1180-FAGAATGCCTCAAGGAAAGCAPH01001003G0160-FGATAATCGCCACTCGGACTCPH01000098G1180-RGTGCAGCTTCCAATGCAGTAPH01001003G0160-RCGGCGATAAAATCCATGAACPH01000131G1240-FCACCGTGTGCCTCAACTTCPH01001205G0030-FCGGCACAGGTCCGGTTTAPH01000131G1240-RTTTCCCCGAACAAGTCAAACPH01001205G0030-RAGACGGGTCCCAGAGCAAPH01000188G0980-FACGTCTCCTTGCTCCACTGTPH01001480G0400-FGGGGAAATGGACTTGGGTATPH01000188G0980-RCTTGAGCACGCCTATCTGCTPH01001480G0400-RTAGCTCCAGAGTGCGACATCPH01000242G1390-FAGCAAGGAGAATCCATGCACPH01001487G0410-FCGTCAGGACAAGCCCTCAPH01000242G1390-RATCAACTCGGGATCAAACGAPH01001487G0410-RAACACCTCGAGGGGCACPH01000343G0830-FCCGACCTACGCCAATGCTPH01002279G0250-FTGCAGCCTCGTCCTCCACPH01000343G0830-RACGGAGGGCCGTATCTGAPH01002279G0250-RCCTCCTCTCTTGTCATCTPH01000124G0270-FGTCGGCGTCTGTTTCTTCTTPH01002393G0230-FAGATCTCAGCGCTGACCCTPH01000124G0270-RTAATCTCCTGCAACCCATCCPH01002393G0230-RTGGCCTTCTTCCGGATCGAPH01000668G0350-FCCTCCTCGTTGTTGTCCACTPH01003475G0200-FGAACCCGAACAAAATCCTCAPH01000668G0350-RGCTCTCCTCTCCCTGTCCATPH01003475G0200-RGTAGTCCAATCCGGTGTGCTPH01003772G0170-FGCCGCGTTCGCCATCAAGPH01088680G0010-FCACCGAAAGATGTCCAGGPH01003772G0170-RCACCACAGCCCGTCCCTCPH01088680G0010-RAGTATTCCCACAGCAGCGPH01003772G0180-FCGCCGGTGTCCAATGGTTTIP41-FAAAATCATTGTAGGCCATTGTCGPH01003772G0180-RCGGTACGTCGGGTGCTTCTIP41-RACTAAATTAAGCCAGCGGGAGTG104 在读期间的学术研究在读期间的学术研究在读期间参加的科研项目：1、国家863项目子课题“毛竹功能基因组学研究””（2013AA102607-4）；2、国家林业局948项目“RNAi干扰竹子功能基因研究应用技术引进”（2014-4-74）；3、国际竹藤中心基本科研业务费重点项目（1632011004）。在读期间发表论文情况：1、WuHuili,LiLong,ChengZhanchao,GeWei,GaoJian,LiXueping.CloningandstressresponseanalysisofPeDREB2AandPeDREB1Agenesinmosobamboo(Phyllostachysedulis)[J].Geneticsandmolecularresearch.（SCI收录，已接收，第一作者，IF=0.7）.##2、HuiliWu,HaoLv,LongLi,JunLiu,ShaohuaMu,XuepingLi,JianGao.Genome-WideAnalysisoftheAP2/ERFTranscriptionFactorsFamilyandtheExpressionPatternsofDREBGenesinMosoBamboo(Phyllostachysedulis)[J].PLoSOne.（SCI收录，已发表，并列第一作者，IF=3.23）.3、吴惠俐,李雪平,高健,牟少华.禾本科植物抗寒机理的研究进展[J].竹子研究汇刊,2014,33(1):7-11.4、吴惠俐,李龙,程占超,葛伟,高健,李雪平.毛竹PeDREB2A和PeDREB1A基因的克隆及胁迫响应表达分析[C].第十一届林业青年年会（陕西杨凌）,2014.105 致谢致谢本论文是在导师李雪平副研究员悉心指导下完成的！无论从课题设想、论文开题、实验进展还是论文撰写等方面都凝聚了恩师的心血。导师丰富的科研经验、渊博的知识、扎实的基础、勇于进取和创新的精神让我体会到了科学的精神。恩师和蔼可亲的待人风格、严谨的治学态度、踏实的工作作风和敬业精神给我留下了深刻的印象，受益终生！感谢基因中心首席专家高健研究员对我论文的指导和生活上的关心。三年来与高健老师的频繁接触中，她对工作的认真及敬业的精神令我深深的折服，从而也使我形成了对科研积极认真的态度，对我今后的工作及学习产生深刻的影响。特此感谢高健老师！感谢首都师范大学的祁晓廷教授在实验过程中提供的帮助。感谢中国林科院研究生院杨茂瑞、张金玉、金海燕、李丽、吴海龙等领导和老师及国际竹藤中心费本华、范少辉、覃道春、王英、蔡春菊、苏浩然、李志强、李波、宋虽花等领导和老师在课程学习、日常生活中给予的大力支持和帮助。感谢基因中心实验室牟少华、胡陶、马艳军、李娟等老师的帮助。感谢实验室的同门孙中元、郭少玲、张颖、张春玲、葛伟、程占超、李龙、白青松、侯丹、刘俊在实验原理和实验技巧上的指导、生活上的关怀和鼓励。他们勤奋钻研、乐观向上的精神激励我努力向前、战胜困难的斗志。感谢我的室友董丽莉、毛超、任丹、王丽丽、武秀明在生活上给予的大力帮助。我们互相照顾、互相帮助、互相鼓励，培养了良好的友谊，创造了丰富多彩的宿舍生活，为我缓解紧张的学习压力提供了良好的休息空间。也感谢同一级的邓建超、廉超、靳肖贝、张二浩等人给予的帮助。感谢我的家人和朋友，感谢他们无微不至的关怀与理解，支持与鼓励！感谢所有帮助过我的人！致谢人：2015年5月于北京106
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