《猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及elisa检测方法的初步建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
密级：论文编号：中国农他科学院学位论文'猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ELISA检测方法的初步建立IsolationofPorcineEpidemicDiarrheaVirusandEstablishmentofELISAMethodsforAntibodyDetection硕士研究生：潘溪指导教师：童光志研究员申请学位类别.•农学硕士专业.•预防兽医学研究方向：分培养单位：上海兽医研究所研究生院2015年5月 独创性声明本人卢明所M交的论文足我个人在导师指导下进行的研究:丨:作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教冇机构彻学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：潘时间：年〔;以’|丨关于论文使用授权的声明本人2全r解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，屮w农业科学院丨i权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采川影印、缩印或扫描等M制T.段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以川"式在小|Hj媒体上发衣、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间:年[丨丨 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目猪流行性腹泻病毒的分离鉴定与ELISA检测方法的初步建立兽医微生物论文作者潘溪专业预防兽医学研究方向及其分指导教师童光志培养单位（研究所、中心）上海/医研究所1,y：姓名职称单位专业f::签名刘金华教授中国农业大学预防兽医学评阅苑纯秀副研究员上海兽医研究所预防兽医学/人答辩周继勇教授浙江大学微生物学主席秦爱建教授扬州大学预防兽医学丁铲研究员上海兽医研究所预防兽医学答马志永研究员上海兽医研究所预防兽医学f<辩李国新研究员上海兽医研究所预防兽医学委贝会议记录（秘书）顾惠明论文答辩时间地点2015年5月25日，上海兽医研究所。 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪流行性腹泻病毒的分离鉴定与ELISA检测方法的初步建立IsolationofPorcineEpidemicDiarrheaVirusandEstablishmentofELISAMethodsforAntibodyDetection硕士研究生：潘溪指导教师：童光志研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：上海兽医研究所研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationIsolationofPorcineEpidemicDiarrheaVirusandEstablishmentofELISAMethodsforAntibodyDetectionM.S.Candidate:XiPanSupervisor:Prof.GuangzhiTongMajor:PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015 摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheaviruse，PEDV）引起的一种急性肠道疾病，以呕吐、水样腹泻为主要特征，严重时可引起病猪死亡。1978年，该病首次在英国和比利时被报道，此后欧洲、亚洲的多个国家相继报道了PED的发生与流行。近几年，一种变异的PEDV在我国猪群中开始流行，并引起七日龄以内新生仔猪严重腹泻和高死亡率，本研究从腹泻仔猪的肠道组织成功分离到一株PEDV流行毒株，测定了其全基因组序列，并初步建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法和基于单克隆抗体的竞争性ELISA方法。具体研究内容如下：1、PEDV的分离鉴定与全基因组分析本试验通过尝试多种细胞、培养系统和培养条件，成功分离出一株猪流行性腹泻病毒。通过间接免疫荧光试验（IFA）、全基因组克隆、同源性比较和系统进化树分析等证实该分离株是目前广泛流行的变异PEDV，暂时命名为SH6株，属于GroupII。全序列分析证明该病毒的基因组大小为28,038bp，从5’端至3’端，编码蛋白依次是多聚蛋白（6,781aa），S蛋白（1,386aa），ORF3蛋白（224aa），E蛋白（76aa），M蛋白（226aa）和N蛋白（441aa）。2、PEDVN蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的初步建立为建立猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA检测方法，本研究从新分离PEDV流行毒株（JS-2013）中扩增其N基因，并将N基因克隆至pCold-IDNA原核表达载体中，构建pCold-I-N重组质粒，经过IPTG诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立PEDV间接ELISA检测方法，并且对各种检测条件进行优化，优化后确定N蛋白最佳包被条件为37℃包被2h，最佳抗原包被量为200ng/孔，最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭2h，最佳血清稀释4度为1:200，血清最佳孵育时间为37℃孵育20min，二抗最适稀释度为1:2×10，二抗最佳孵育时间为40min，临界值为0.345~0.394，介于两者之间为可疑。并对50份已知背景血清进行检测，符合率达94%。该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了依据。3、抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的初步建立将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，运用杂交瘤细胞筛选技术最终获得1株稳定分泌抗PEDVN蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为：2B8。扩大培养该杂交瘤细胞株5接种BALB/c小鼠，制备腹水。经鉴定，腹水效价在10以上。Westernblot和IFA试验结果显示该单克隆抗体具有良好的反应性和特异性。与其他猪源病毒无交叉反应。将获得的单克隆抗体作为竞争一抗初步建立竞争ELISA检测方法。并对工作条件进行优化，确认最佳工作条件和阴阳性判定临界值。其中阴性血清临界值=X＋2SD=33.2%，阳性血清临界值=X＋3SD=38.6%，介于两者之间为可疑。本试验初步建立的两种检测PEDV抗体的ELISA方法，为PEDV变异株感染的诊断及其流行病学分析奠定了重要的基础。关键词：猪流行性腹泻病毒，分离与鉴定，N蛋白，ELISA，单克隆抗体I AbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED)isakindofacuteentericdisease,whichiscausedbyporcineepidemicdiarrheaviruse(PEDV)andcharacterizedbyvomiting,waterydiarrheaandsignificantmortalityinswine.Asaworldwideporcinedisease,itwasfirstlyreportedintheUnitedKingdomandBelgium,lateritinducedtremendouseconomiclossestotheswineindustryinEurope,Asia.Inrecentyears,anewPEDVhasbeenpopularinourcountry,whichcauseshighmortalityofnewbornpigs.Inthisstudy,wehaveisolatedanepidemicstrainandestablishedthemethodfordetectionoftheantibodyagainstPEDV.Meanwhile,weexpressedtheNproteinofPEDVthroughprokaryoticexpressionsystemandmonoclonalantibodies(MAb)werepreparedwhichnamedMAb2B8.UsingthepurifiedNrecombinantproteinasthecoatingantigen,theMAb2B8wasselectedasthecompetitiveantibodytodevelopacompetitiveELISA.Themajorcontentswereasfollowing:1.Isolation,identificationandgenome-wideanalysisofPEDV.Inthisexperiment,wesuccessfullyisolatedthevirususingVerocontinuouscelllinebyvarietiesofcells,culturesystemandconditions.AsshownbyIFA,thehomologycomparisonandphylogenetictreeanalysis,thepurifiedviruswasidentifiedtobethePEDVvirusandnamedSH6,whichbelongstoGroupII.ThePEDVgenomeisapproximately28,038bpinlength,encoding4structuralproteins:polyprotein(6,781aa),Sprotein(1,386aa),ORF3protein(224aa),Eprotein(76aa),Mprotein(226aa)andNprotein(441aa).2.ExpressionandpurificationofNproteinofPEDVinprokaryoticexpressionanddevelopmentofanindirectELISAfordetectingantibodies.ToestablishanindirectELISAoftheantibodyagainstPEDV,the1326bpfragmentofthePEDVNgenewasamplifiedbyRT-PCRusingspecificprimers,insertedintotheexpressionvectorpCold-IDNAtoconstructarecombinantplasmidpCold-I-N,thenitexpressedinthehostcellBL21inducedbyIPTG.UsingHis-Binding-Resin,therecombinantNproteinwaspurified.WesternblotanalysisshowedthatthefusionproteinreactedspecificallywithPEDVpositiveserum.TheindirectELSAwasdevelopedwiththepurifiedproteinascoatingantigen.Theoptimalreactionconditionsweredetermined,including2µg/mLcoatingantigenofrecombinantNprotein,thecoatedconditionwas2hat37°C,thesealingbufferwas5%skimmilk-PBST,andthesealingtimewas2hat37°C.Thedilutionofthetestingserumwasdefinedas1:200andthereactiontimewas20minat37°C.HRPconjugatedanti-pig4IgGreactionconditionsweresetat1:2×10dilutionandincubatedfor40minat37°C.whenthecutoff-valueOD450nm≥0.394,theserumwasjudgedaspositive;whileOD450nm≤0.345,thesamplewasjudgedasnegative,andassuspiciousbetween0.345and0.394.Total50clinicalserumsamplesweredetectedtoprovethattheindirectELISAhadgoodinter-andintra-batchreproducibility.ItindicatedthatthismethodcouldprovideanavailabletoolforPEDVepidemiologicalsurveysanddiagnosisinthefuture.3.PreparationofmonoclonalantibodiestoNProteinofPEDVanddevelopmentofthecompetitiveII ELISAfordeterminingPEDVantibody.FemaleBALB/cmicewereimmunizedwiththepurifiedrecombinantNproteinandonestrainofhybridomacellnamed2B8secretinganti-NproteinMAbwereobtainedbyhybridomatechnique.Thenthehybridomacellswereinjectedintopristane-treatedBALB/cmicetogainabundantasceticfluid.The5titerofasceticfluidwas10byindirectELISA.TheMAb2B8wasspecificallyreactedwithPEDVbywesternblotandIFA.TosetupacompetitiveELISAfordetermingPEDVantibody,themonoclonalantibody2B8wasworkedasthecompetitiveantibody.Afteroptimizingaseriesofworkconditions,aspecificcompetitiveELISAmethodwasdevelopedfinally.Theinhibitionratioofthesampleswhichweremorethan38.6%wasjudgedaspositivevaluebystatisticalanalysis.Whiletheinhibitionratioofthesampleswhichwerelessthan33.2%,itwasregardedasnegative,andassuspiciousbetween33.2%and38.6%.Inthisstudy,wehavedevelopedELISAmethodsforantibodydetection,ithasapositivesignificancefordiagnosisandepidemiologicalanalysisofmutantPEDV.Keywords:Porcineepidemicdiarrheavirus,isolationandidentification,Nprotein,ELISA,MonoclonalantibodyIII 目录第一章引言...................................................................................................................11.1PEDV的分类地位......................................................................................................11.2PEDV的形态结构及理化性质..................................................................................11.3PEDV的细胞培养特性..............................................................................................11.4PEDV的基因组结构与功能......................................................................................21.5PEDV的主要基因组结构与功能..............................................................................31.5.1主要结构基因及其功能......................................................................................31.5.2非结构基因及其功能..........................................................................................31.6PEDV的主要蛋白结构与功能..................................................................................41.6.1结构蛋白及其功能..............................................................................................41.6.2非结构蛋白及其功能..........................................................................................51.7PEDV的诊断技术......................................................................................................51.7.1临床诊断及病理组织变化..................................................................................51.7.2实验室诊断方法..................................................................................................51.8免疫预防.....................................................................................................................61.8.1PED灭活苗...........................................................................................................71.8.2PEDV弱毒疫苗...................................................................................................71.9研究目的和意义.........................................................................................................7第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析...........................................82.1主要材料......................................................................................................................82.1.1载体、菌株和试剂盒...........................................................................................82.1.2主要试剂及配制...................................................................................................82.1.3主要仪器设备......................................................................................................92.1.4分子生物学软件..................................................................................................92.1.5样品采集..............................................................................................................92.2方法.............................................................................................................................92.2.1粪样的处理..........................................................................................................9IV 2.2.2变异PEDV的分离及鉴定..................................................................................92.2.3免疫荧光（IFA）检测变异PEDV......................................................................92.2.4病毒蚀斑纯化.....................................................................................................102.2.5引物设计.............................................................................................................102.2.6RNA的提取........................................................................................................112.2.7反转录和双链cDNA合成.................................................................................122.2.8PCR扩增.............................................................................................................122.2.93’RACE和5’RACE...........................................................................................132.2.10PCR产物的纯化...............................................................................................132.2.11PCR产物的测序...............................................................................................142.2.12变异PEDV的序列分析...................................................................................142.3结果...........................................................................................................................142.3.1PEDV的分离及鉴定..........................................................................................142.3.2PEDV的全基因组克隆和序列分析..................................................................152.4讨论...........................................................................................................................23第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立..............................253.1材料与方法...............................................................................................................253.1.1主要材料与试剂................................................................................................253.1.2PEDV重组N蛋白的原核表达与纯化.............................................................253.1.3间接ELISA检测方法的初步建立...................................................................273.1.4间接ELISA检测方法临界值的确立...............................................................283.1.5符合率分析........................................................................................................283.1.6重复性测试........................................................................................................283.2结果...........................................................................................................................293.2.1PEDV重组N蛋白的原核表达及纯化.............................................................293.2.2间接ELISA方法的建立及条件优化结果.......................................................313.2.3间接ELISA临界值的确立...............................................................................333.2.4间接ELISA符合率试验结果...........................................................................34V 3.2.5间接ELISA重复性试验结果...........................................................................343.3讨论...........................................................................................................................35第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立.................364.1材料与方法...............................................................................................................364.1.1主要材料与试剂................................................................................................364.1.2包被抗原的制备................................................................................................364.1.3抗N蛋白单克隆抗体的制备...........................................................................364.1.4抗N蛋白单克隆抗体的初步应用...................................................................404.1.5竞争ELISA检测方法的初步建立...................................................................414.1.6竞争ELISA检测方法临界值的确定...............................................................424.1.7符合率分析........................................................................................................424.1.8重复性测试........................................................................................................424.2结果...........................................................................................................................424.2.1包被抗原的制备................................................................................................424.2.2抗N蛋白单克隆抗体的制备...........................................................................424.2.3抗N蛋白单克隆抗体的初步应用...................................................................444.2.4竞争ELISA检测方法的建立及条件优化结果...............................................454.2.5竞争ELISA检测方法临界值的确定...............................................................484.2.6竞争ELISA检测方法符合率试验结果...........................................................484.2.7竞争ELISA检测方法重复性试验结果...........................................................484.3讨论...........................................................................................................................49第五章全文结论.............................................................................................................51参考文献.............................................................................................................................52致谢.................................................................................................................................58作者简历.............................................................................................................................60VI 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称PEDVporcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒TGEVTransmissiblegastroenteritisvirus猪传染性胃肠炎病毒PRCOVPorcinerespiratorycoronavirus猪呼吸道冠状病毒bp/kbBasepair/kilo-basepair碱基对/千碱基对RT-PCRReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction反转录—聚合酶链式反应ELISAEnzyme-linkedimmunoadsordentassay酶联免疫吸附试验IFAindirectimmunofluroescenceassay间接免疫荧光IEMImmuneelectronmicroscopy免疫电镜法Vero/非洲绿猴肾传代细胞SP2/0SP2/0-Agl4BALB/c小鼠浆母细胞瘤DMEMDulbercco’smodifiedEaglemedium基础培养基PEGpolyethyleneglycol聚乙二醇HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳MAbMonoclonalantibody单克隆抗体OD450/在450nm处的吸光值rpmRotationperminute每分钟转速VII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性传染病(AndriesandPensaert,1980;Cornetal.,1986;Sunetal.,2012)，对小于5日龄的仔猪的致死率高达100%(KimandChae,2000)。自2010年开始，新生仔猪病毒性腹泻在我国多个省市爆发，呈高感染率，高致死率的态势，给我国养猪业带来不可磨灭的损失。1.1PEDV的分类地位PEDV属于冠状病毒Ⅰ群成员，具体为尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）。和PEDV同属的还有猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV），猪呼吸道冠状病毒（Porcinerespiratorycoronavirus，PRCV）等(Gadlageetal.,2008;Grahametal.,2005;Lecomteetal.,1987)。1.2PEDV的形态结构及理化性质PEDV主要结构蛋白有四种，分别是位于病毒粒子表面的纤突蛋白（spike,S）、包膜蛋白（envelope,E）、膜糖蛋白（membrane,M）和位于病毒粒子内部的核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）(Kweonetal.,1997)。电镜下观察，该病毒大小不一，形态多样，平均直径约128nm。球状粒子外包裹一层囊膜，上有长约20nm的纤突(HofmannandWyler,1989;Pospischiletal.,1981)。粒子中央是一个不透明的电子区域。PEDV是囊膜病毒,所以对乙醚和氯仿等(HofmannandWyler,1988)脂溶性溶剂很敏感,该病毒的抵抗力也不强,一般的消毒液都能将其杀死。PEDV在蔗糖中的密度3不超过1.18g/cm，而1mol/LMgCl2就能显著降低PEDV的热稳定性(HofmannandWyler,1989;PensaertanddeBouck,1978)。65℃以上半小时，该病毒失活。此外，PEDV与猪、鼠、牛等动物的红细胞不发生凝集反应(Kocherhansetal.,2001;Parketal.,2010)。1.3PEDV的细胞培养特性相对其他冠状病毒而言，PEDV的细胞培养难度较大。因此，在相当长的时期内阻碍了PEDV的研究进展。自该病毒发现报道以来，诸多学者多次尝试在不同的传代细胞进行PEDV的体外增殖培养，我国是于1982年，由学者宣华等人，经过不懈的努力，首次分离到猪流行性腹泻病毒吉林毒株(宣华,1984)。随后，瑞典学者Hofmann等发现在培养基中加入适量胰酶可成功促使PEDV在Vero细胞中增殖(HofmannandWyler,1988)。从而推测出胰酶通过切割S蛋白可增强自身侵染力(HofmannandWyler,1988;Shiratoetal.,2011)。进一步研究发现，血清因子对PEDV与细胞受体的结合过程有明显的抑制作用。随着各国学者对该病毒的深入研究，发现了更多的能适应PEDV生长的传代细胞，如：肾脏的原代细胞和KSEK6等(Kadoietal.,2002;Kweonetal.,1999)。这一发现，为PEDV相关疫苗及其分子生物学的研究提供了物质基础。然而，目前仍面临许多技术难关，还需各国研究者共同努力。1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.4PEDV的基因组结构与功能PEDV是核酸基因组为单股正链RNA的囊膜病毒，其基因组全长为27~32kb，具有感染性。在基因组3’端有1个Poly(A)尾(PensaertanddeBouck,1978)，5’端有一个帽子结构。PEDV基因组包含一个长约292个核苷酸的5’端非翻译区（UTR），和长度为334个核苷酸的3’端非翻译区(3’UTR)，二者之间至少有7个开放阅读框（ORF）,他们在病毒基因组上的排列顺序从5’→3’依次为：5’UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR(Bridgenetal.,1998;DuarteandLaude,1994;Duarteetal.,1994;Kocherhans,etal.,2001)。其中，ORF1a和ORF1b约占病毒全基因组长度的2/3，编码非结构复制多聚酶1a和1b。它们之间有46nt的重叠区域。该区域中有一个长约7nt的ORF“滑动序列”（UUUAAAC），该序列用于确保核糖体的移码阅读以及基因的正确翻译。四个主要的结构基因分别编码4个主要的结构蛋白：S蛋白、E蛋白、M蛋白和E蛋白(Kocherhans,etal.,2001;Parketal.,2012;Wangetal.,2013)。这些蛋白主要参与构成完整的病毒粒子，此外，还能刺激机体产生特异性抗体(Croizieretal.,2000)。辅助基因ORF3编码的辅助蛋白ORF3位于结构蛋白S蛋白和E蛋白之间，与病毒毒力有关。图1.1PEDV模式图和基因组结构Fig1.1GenomestructureandschematicgraphofPEDV2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.5PEDV的主要基因组结构与功能1.5.1主要结构基因及其功能S基因PEDV的S基因长约4.15kb，它的启动密码子主要用于编码病毒最主要的结构蛋白S蛋白。通过比对S基因序列发现，S基因在不同地区时间分离的毒株之间和同地区同时间分离的毒株之间变异都很大。因此，S基因是分析不同地区PEDV流行性毒株的遗传变异和流行特点的主要切入点。同时，序列同一性比较结果还显示，PEDVS基因与CCV（犬冠状病毒）、TGEV和FIPV（猫传染性腹膜炎病毒）的S序列分别有59.6%～60.0%（S1区）和35.5%～35.9%（S2区）的同源性。根据S基因的遗传系统进化树分析结果，人为的将PEDV毒株分成3个亚群（G1,G2,G3）(Parketal.,2007a)。我们发现，近2年分离到的PEDV毒株大多属于G1群的成员。N基因PEDVN基因由1326bp组成。它位于PEDV基因组3’端，N基因的3’端和poly(A)尾之间有一段保守序列，它是病毒复制过程中RNA负链合成的识别位点，大小约11bp。将N基因的核苷酸序列与MHV、HCV、FIPV、PRCV、TGEV、HCV229E等冠状病毒的N基因序列比较发现，PEDV的N基因序列与这些冠状病毒的同序列大部分相同，但比HCV229E和TGEV要大。此外，PEDVN蛋白比TGEV、HCV229E的N蛋白多一段氨基酸残基。将在Vero细胞中传代过的病毒的N基因，克隆到pCold-I载体上，构建pCold-I-N重组质粒，并在15℃条件下诱导表达，经过分离纯化，通过Western-blot结果表明蛋白与多抗血清有良好的免疫反应。M基因M基因由约680bp组成，它编码的M蛋白是PEDV主要结构蛋白之一。将M基因序列与同属冠状病毒TGEV序列比较分析，二者同源性为53%。同样，与其他冠状病毒同源性也较低。M基因高度保守(JinghuiandYijing,2005)。冠状病毒Ｍ基因的表达有一定困难，据文献记载，关于犬、猪及人SARS病毒的M蛋白表达，其表达量均很低。目前，本实验室已成功利用原核表达载体pCold-I-TF，实现了M蛋白的可溶性表达。E基因PEDVE基因全长231bp，该基因序列与TGEV和HCV229E（人冠状病毒）的序列相比,同源性分别达到29%和54%。运用Northern杂交技术，对PEDV亚基因组RNA进行分析发现，该部分mRNA同预测的RNA5（成熟的病毒粒子中的第5个RNA组分）具有相同电泳迁移率。1.5.2非结构基因及其功能复制酶基因（ORF1a，ORF1b）复制酶基因全长约20.3kb，位于近病毒基因组的5’端，约占基因组全长的2/3，由2个长开放阅读框（ORF1a，ORF1b）组成；其中ORF1a长约12350bp；ORF1b长约8037bp。二者之间重叠区长约46bp，包含一个七个核苷酸大小的假结体结构，它能确保基因被正确翻译(Chenetal.,2010;DijkmanandvanderHoek,2009)。ORF3基因3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言ORF3基因是PEDV唯一的调节基因。位于基因组116～784个核苷酸处，结构基因之间，与病毒毒力有关。它编码的ORF3蛋白是一种辅助蛋白。至少存在3个可变区和2个功能基序（Motif），分别为：精氨酸酶信号肽和ATP/GTP结合位点。ORF3基因缺失约5bp的核苷酸，因此细胞培养不能复制ORF3蛋白。Park等发现致弱的DRl3的ORF3基因上缺失17bp的核苷酸，该发现为强弱毒株分别鉴定提供了新的思路(Park,etal.,2007a;Wangetal.,2010;Yeoetal.,2003)。1.6PEDV的主要蛋白结构与功能1.6.1结构蛋白及其功能S蛋白PEDVS基因编码的S蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白，它结合于病毒粒子表面，呈纤突状。S蛋白能特异性识别入胞受体，对病毒侵染细胞起促进作用(Yeo,etal.,2003)。S蛋白包括两个区域：S1段（第1～789位氨基酸）和S2段（第790～1383位氨基酸）(Changetal.,2002;Jackwoodetal.,2001;Sturmanetal.,1985;Sunetal.,2008)。在病毒感染宿主的过程中，首先S1段特异性识别并结合宿主细胞受体，从而引发S2构象发生变化,最终导致融合肽插入细胞膜中。由于PEDVS蛋白与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S蛋白无血清学交叉反应，说明二者同源性很低，但是二者S蛋白中和表位的线性位置可能存在相似之处。此外,S蛋白还能影响PEDV体外培养的适应性，且病毒在机体内增殖时毒力的减弱也与之息息相关(Park,etal.,2007a;Satoetal.,2011)。因此，S蛋白常被作为研发PEDV新型疫苗的首选目标。N蛋白核衣壳蛋白N是分子量为55~58kDa的一种磷蛋白。它由441个氨基酸组成，与病毒RNA相互结合并缠绕形成螺旋状。存在引导蛋白质定位到细胞核的信号(吕茂杰等,2009)。它参与病毒的转录与复制。N蛋白同其它冠状病毒同源性较低，然而它在同种病毒间具高度保守性(孙东波etal.,2006)，有3个相对保守的结构域(Junweietal.,2006;LeeandYeo,2003)。N蛋白作为PEDV中含量最多的结构蛋白，在病毒感染机体初，就能在细胞中大量表达。病猪体内能迅速产生抗N蛋白特异性抗体(Lvetal.,2011)。因此N蛋白可用作早期诊断蛋白(Bridgenetal.,1993;LeeandYeo,2003;Tobleretal.,1993)。这为利用N蛋白建立PEDV抗体检测方法提供了良好的科学依据(Houetal.,2007;Leeetal.,2008)。同时，N蛋白还具有较好的抗原反应性，它能刺激机体产生免疫反应。M蛋白M蛋白是由226个氨基酸组成的，相对分子质量为27~32kDa的多肽的病毒表面结构蛋白。它作为一种跨膜糖蛋白，包含3个跨膜区，从内到外依次为：C末端区、α螺旋区和N末端区(Utigeretal.,1995)。M蛋白结构稳定，与核衣壳紧密结合，参与病毒粒子的装配及出芽。一方面，M蛋白可介导细胞融合和α-干扰素（α-IFN）的产生；另一方面，在病毒感染的早期，它可抑制宿主细胞基因的转录。因此M蛋白可以作为PEDV的诊断和预防研究实验的重要蛋白(Shenyangetal.,2007;Utigeretal.,1993)。E蛋白4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言E蛋白是由76个氨基酸组成的小包膜蛋白，它主要参与形成粒子包膜，分散于病毒囊膜上。促进成熟的病毒粒子出芽(Xuetal.,2013)。经研究发现，同群冠状病毒的E基因差异性较小。此外，另有学者发现，该小包膜蛋白可能诱发T细胞凋亡(Pengetal.,2006)。1.6.2非结构蛋白及其功能复制酶多聚蛋白1ab在PEDV中，复制酶多聚蛋白1ab是一个多功能非结构蛋白，大小约753KDa。其中含有至少13个预测蛋白酶切割位点。病毒感染早期，该多聚蛋白迅速合成，并被自身水解酶分解成十多种非结构蛋白质，发挥重要作用(Kocherhans,etal.,2001)。ORF1a作用主要包括，蛋白切割作用及参与RNA的复制等。ORF1b主要编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），它包括3个蛋白结构域，分别是保守序列域（C）、螺旋酶域（Hel）和锌指蛋白域（Z）(BrianandBaric,2005)。ORF3蛋白ORF3蛋白是一种具有多态性的病毒包膜蛋白,由223或224个氨基酸组成。它能通过形成一种特殊离子通道，辅助增加病毒产量(Luetal.,2006;Wangetal.,2012)。经研究发现，该蛋白可能影响病毒毒力(Songetal.,2003)。由于该蛋白位于S蛋白和E蛋白之间,故而又被称为SNE蛋白。1.7PEDV的诊断技术1.7.1临床诊断及病理组织变化寒冷潮湿的季节是PED的高发季。可通过感染猪排泄物传播。潜伏期带毒的猪也是传播源10日龄内的哺乳仔猪最易感染，并且临床症状极其明显。感染仔猪临床表现为：精神沉郁、食欲减退、被毛粗乱，呕吐腹泻现象严重，最终严重脱水而亡。一般发病猪日龄越小,症状越明显，死亡越快。剖检病死仔猪，可见典型的射流，肠道充血，肠淋巴结肿大，呈黄色，并含有大量的凝结、未消化的奶，由于肠绒毛萎缩而造成小肠壁变薄，几乎透明。镜检可见小肠绒毛脱落变短、呈空泡状,上皮细胞变性脱落等病理现象。由于很难将PED跟猪传染性胃肠炎在临床症状上加以区分，因此急需建立实验室鉴别诊断PEDV的方法。1.7.2实验室诊断方法病毒分离是诊断病毒病的金标准，最初PEDV主要靠分离鉴定病毒来确定感染，然而猪流行性腹泻病毒很难被分离导致该法存在一定技术难关。随着学者的研究的深入，免疫组织化学技术(Kimetal.,1999)、免疫荧光(DebouckandPensaert,1980;Shibataetal.,2000;崔现兰etal.,1990)、原位杂交法(KimandChae,2000)、RT-PCR(Bridgen,etal.,1993;Duarteetal.,1993;Ishikawaetal.,1997;Kubotaetal.,1999;Songetal.,2006)、免疫电镜观察（IEM）(Pensaertetal.,1981;王继科等，1991)、ELISA(Callebautetal.,1982;RenandLi,2011;vanNieuwstadtandZetstra,1991)等也被用作实验室诊断PEDV。接下来将主要介绍几种常用的实验室诊断方法。免疫电镜法（IEM）普通电镜可以观察到病毒粒子的形态大小、内部结构等，可以迅速准确的确定病原。在普通5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言电镜下观察PEDV，其形态与同属冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒相似度高，普通电镜法很难加以区别。为此，王继科等将待处理的样品与高免血清混合后，经12,000r/rnin离心处理，此时再利用电镜观察，若样品中含有PEDV，则可看到呈晶格状排列的病毒粒子。免疫电镜法能准确定性，且直观、便捷。但考虑到设备限制，只适用于小范围临床诊断。免疫荧光法免疫荧光技术，包括直接免疫荧光技术（FAT）、间接免疫荧光技术（IFAT）和免疫过氧化物酶技术。其中，直接免疫荧光法是目前应用最广泛、最可靠的检测PEDV的特异性诊断技术。崔现兰等应用直接免疫荧光法检测发病仔猪病理组织切片，人工感染阳性率高达91.41%；应用间接免疫荧光技术，检出率达89.0%。突出了免疫荧光法的高精准性。1997年林志雄等人成功建立了一种跟其他猪源病毒不发生交叉反应的直接免疫荧光法。提高了免疫荧光法的特异性。2010年陈建飞等用IFAT证实了PEDV抗血清能够与Vero细胞中的发生PEDV反应。酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunoadsordentassay,ELISA）ELISA法是一种相对成熟的常用血清学检测方法。它包括间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA等，是国际贸易指定的标准诊断方法之一。酶联免疫吸附试验既可以用于检测抗原，又可以检测抗体，适用于临床大规模样品的检测。我国学者朱维正等，采用夹心ELISA法直接检测病猪粪便中的病毒抗原。对比免疫电镜法检测结果，阴阳性结果符合率均在95%以上，阴性检测结果更是100%符合。此外，陈苑等还利用纯化的PEDV抗原，建立的Dot-ELISA法可以检测PEDV抗体，该方法还具有特异性强、阳性检出率高等优点。Roddk等人在筛选出PEDV抗M蛋白抗体的基础上，对间接ELISA法、双抗体夹心ELISA法、竞争ELISA法灵敏度进行测试，结果显示后者灵敏度更高。因此，它不仅是目前应用最广泛的实验室检测方法之一，也适用于基层流行病学调查。反转录聚合酶链反应（reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR）为有效快速诊断猪流行性腹泻病，各国学者经长期探索，先后成功建立了检测PEDVM基因、N基因、ORF3基因和S基因的RT-PCR法。根据猪流行性腹泻病毒S基因，Ishikawa等成功设计一对引物，建立RT-PCR法用于该病毒的定性检测。1999年，Kubota等和Bridgen等也先后分别根据M基因和N基因，成功构建了RT-PCR法。为解决检测中的混合交叉污染和病毒定量的问题，Song等建立了多重RT-PCR，用于鉴别诊断PEDV、TGEV、PORV（猪轮状病毒）的多重混合感染，此外，他们还建立了实时荧光定量PCR法检测猪流行性腹泻病毒。在我国，张坤等也成功构建出检测TGEV、PORV、PEDV的多重RT-PCR法。RT-PCR法操作简便，灵敏，能迅速获得结果。但由于特殊试剂、设备的需求，不适应基层推广。1.8免疫预防预防PEDV的一般措施主要是加强饲养管理。在发现PEDV感染早期，就应立即隔离病畜，切断传染源。并全面消毒。防止病毒进入新的猪舍感染新生仔猪。同时应在水中添加含一定抗生素的5%葡萄糖生理盐水以达到给脱水病猪补水的目的。新生仔猪免疫系统发育尚不完善，一经感染，易导致迅速发病、死亡。因此，仔猪对于PEDV的免疫力主要来自母乳中的抗体。国内外许多猪场在爆发PEDV期间，让怀孕母猪接触感染仔猪的带毒排泄物，从而剌激母猪产生保护性6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言母源抗体。然而，这种人为扩散病毒的方法免疫病毒效价不均，不能达到稳定的诱导免疫效果，更有甚者，可能引发其他传染性疫病的流行。疫苗免疫接种是目前最主要的针对PEDV的特异性预防措施。这些疫苗主要分为：弱毒苗疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗三类。其中前两类疫苗包含完整病毒颗粒。我国市面上常见有两种预防疫苗：灭活苗和弱毒苗。1.8.1PED灭活苗PEDV的灭活苗包括：组织灭活苗和细胞灭活苗。灭活苗接种途径简单、安全有效。但其生产成本较高，且操作繁琐，产品质量难以达标，且在疫苗中病毒难以定量。为此，马思奇等研究员采用在Vero细胞中培养的PEDVCV777的第28代毒株制备氢氧化铝灭活苗，该疫苗对幼猪的免疫保护率达85%以上(马思奇等,1994)。马思奇等还进行了“TGEV-PEDV二联灭活疫苗”的研制。2002年，还红华等进行了“PEDV-TGEV二联油乳剂灭活疫苗”的研究(还红华,2002)。2005年，邹勇等研制了“PEDV-TGEV-RV的三联灭活疫苗”。这些研究为PEDV的有效预防，避免经济损失做出了巨大的贡献(邹勇,2003)。1.8.2PEDV弱毒疫苗由于灭活苗不利于紧急预防，为迅速产生免疫保护效果，弱毒疫苗应运而生。从1997年起在日本和韩国用日本的P-5V疫苗株进行母猪PED的预防。但之后未有该毒株不断致弱的相关报道。韩国学者将DR13强毒连续传代100代以上成功研制出了DR13弱毒苗，该弱毒疫苗株能显著降低仔猪发病率和死亡率，提高保护力(Parketal.,2007b;Songetal.,2007)。佟有恩等学者为获得稳定减弱的毒力同时保持良好的免疫原性的弱毒株，取适应Vero细胞的CV777株第90代开始进行克隆纯化。经安全性、稳定性试验测试，该克隆后毒株安全性良好，且未见毒力返强，证明此弱毒疫苗株已培育成功(佟有恩等,1998)。李树根等用弱毒株PEDV-G1P83和TGEV-AG1制成弱毒二联疫苗，显著降低了PED的发病率和死亡率。尽管弱毒疫苗优点较多，但它不能显著降低病毒的扩散，且存在毒力返强的可能。1.9研究目的和意义自猪流行性腹泻病毒出现以来，在世界范围内，该病爆发的频率越来越高。给各国养殖业造成重大经济损失。我国养猪业自2010年来，也深受猪流行性腹泻病的困扰。PEDV毒株只有1种血清型，但PEDV在长期流行的过程中，病毒为了更好地适应不同地区的环境差异发生了变异(Parketal.,2013)。出现已免疫的仔猪仍发生PEDV感染，既有疫苗对新型的病毒失去保护力等现象，这就使PED的防控工作困难重重。为深入研究变异病原，找寻新的保护办法。本研究将分离当前流行的PEDV新型变异毒株，分析其全基因组，并将该毒株与经典毒株的序列比对结果及遗传进化分析结果进行研究，阐明该流行毒株的遗传变异规律。并开展了检测方法的建立，通过原核表达获得PEDVN蛋白，将其作为抗原包被酶标板，初步建立PEDV间接ELISA检测方法。通过制备抗N蛋白单克隆抗体，并对其反应性和特异性进行鉴定，将其作为竞争一抗，初步建立针对PEDV的N蛋白竞争ELISA抗体检测方法，为疫苗研发中抗体检测提供配套的工具，为PEDV血清学流行病学研究奠定基础。7 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析猪流行性腹泻最早于1978年在比利时和英国被发现报道，它给欧洲、亚洲的多个国家养猪业均造成了巨大的经济损失(PensaertanddeBouck,1978)。近年来，在中美地区，不断有报道发现变异的PEDV，该病原体能引起大量仔猪急性死亡(Linetal.,2014;Loweetal.,2014;Wangetal.,2014)。在国内，尽管导致新生仔猪腹泻的病因很多，但2011年下半年以来，学者从表现为呕吐、水样腹泻、迅速脱水、高死亡率为特征的新生仔猪样品中分离到了PEDV。因此，我们可以认为，PEDV是近年来引起新生仔猪腹泻最重要病原。为更好的研究仔猪流行性腹泻病，本实验尝试分离当地猪流行性腹泻病毒。对其全基因组进行克隆分析，同时与流行毒株和经典毒株主要基因、蛋白进行同源性比较和系统进化树分析，了解该流行毒株特点，为进一步研制PEDV相关疫苗，更好的防控猪流行性腹泻病夯实基础。2.1主要材料2.1.1载体、菌株和试剂盒pMD-18T载体购自大连宝生物公司；胰酶、PBS、胎牛血清、DMEM、3’RACE和5’RACE试剂盒、感受态细胞TOP10和SuperScriptIIIReverseTranscriptase购自立菲生物技术有限公司，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司;AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒购自上海前尘生物公司；胰蛋白磷酸肉汤（tryptosephosphatebroth，TPB）购自Sigma。Vero细胞为本实验室保存的细胞。2.1.2主要试剂及配制2.1.2.1主要试剂胰酶、PBS、胎牛血清和DMEM购自立菲生物技术有限公司；西班牙琼脂糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、Tris-base，购自上海诺宁生物技术有限责任公司；dNTP和DNAmarker购自大连宝生物公司；FITC羊抗猪IgG购自Sigma公司。2.1.2.2试剂的配制LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母浸出物，5gNaCl，溶于900mL双蒸水中，完全溶解后，用NaOH和HCl调pH值至7.0-7.2，定容至1000mL，高压灭菌后备用。LB固体培养基：按上述方法配制液体培养基，每100mL加入1.5g琼脂粉，高压灭菌后在无菌状态下铺平板，冷却后备用。如需含抗生素的平板，则待培养基冷却至50℃－60℃时向培养基中加入氨苄青霉素后立即铺板。50×TAE：750mL双蒸水中溶解242gTris碱，加入57.1mL乙酸，100mL的0.5mol/L的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000mL。使用时用双蒸水稀释为1×TAE。溴化乙锭EtBr(10mg/mL)：10mL双蒸水中加入0.1gEtBr，完全溶解后置棕色瓶中铝箔包裹，4℃保存。氨苄青霉素(Amp)：用灭菌双蒸水溶解成储存浓度50mg/mL，滤过除菌，分装后-20℃保存8 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析备用。DEPC处理水（0.1‰）：1000mL双蒸水中加入0.1mLDEPC，过夜温育后高压灭菌。分离病毒的DMEM:分离病毒的DMEM含有终浓度为0.3%TPB和10g/mL的胰酶。2.1.3主要仪器设备PCR仪，高速冷冻离心机及台式高速离心机，数码凝胶成像系统，超低温冰箱，电泳仪，CO2培养箱，国产超净工作台，国产摇床，国产制冰机。2.1.4分子生物学软件DNA序列分析软件DNAstar、引物设计软件PrimerPremier5.0、进化树用MEGA4.0软件、多序列比对用ClustalW工具（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）。2.1.5样品采集采集上海爆发变异PEDV某猪场的1~5日龄腹泻仔猪的小肠和内容物。2.2方法2.2.1粪样的处理新鲜采集的小肠及内容物和PBS按照1：10的比例匀浆，反复冻融3次。在4℃条件下13,000rpm离心15min，取上清（勿取到悬浮的油脂类物质），用0.22µm滤器过虑悬液。2.2.2变异PEDV的分离及鉴定取样品滤液100L加入900L分离病毒的DMEM中，将1mL（100L+900L）样品培养液混合液，加入经PBS清洗3次的铺有单层Vero的T25细胞培养瓶中。详细过程见参考文献(Panetal.,2012)。2.2.3免疫荧光（IFA）检测变异PEDV将分离的变异PEDV接种Vero细胞，病变不同时间后，通过IFA实验，观察感染PEDV的Vero细胞病变特点。具体操作如下：1)细胞感染PEDV：6孔细胞培养板中铺满Vero细胞，用PEDV感染Vero细胞，12h后，用冰甲醛于-20℃固定10min。未感染PEDV的Vero细胞做阴性对照；2)洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5min；3)封闭：含有5%BSA的PBS缓冲溶液37℃孵育1h；4)洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5min；5)加入一抗（PEDV阳性血清）：用PBS缓冲溶液按照1:100的比例稀释一抗，37℃孵育1h；6)洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5min；7)加入二抗：FITC羊抗猪IgG购自Sigma公司，用PBS按1:1000倍稀释后加入六孔板，避光9 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析37℃孵育1min；8)洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5min；9)荧光显微镜观察。2.2.4病毒蚀斑纯化51）在培养皿中接种6×10的Vero细胞（2ml），放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中过夜培养；2）接毒。以不含血清的DMEM将病毒作连续的10倍稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养皿内的单层细胞。置37℃作用1h，使病毒充分吸附。吸附完毕后，吸出病毒液；3）加琼脂。取配好的营养琼脂糖，融化后降温至43～45℃，注入铺有细胞的培养皿中，并缓慢翻转，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面，厚度约2mm，以不超过3mm为宜。平放30～60分钟，待琼脂糖凝固,随后置37℃继续培养。逐日观察一次细胞形态以及出斑情况，约1~2d后，出现肉眼可见的病灶。4）挑单克隆病毒，于培养瓶中培养。2.2.5引物设计根据GenBank中BJ-2011-1株（登录号：JN825712）核苷酸序列信息，设计24对扩增变异PEDV基因组的引物和6条扩增3’RACE和5’RACE的引物。引物序列如下：10 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析表2.1RT-PCR试验中使用的引物序列Table2.1SequenceofoligonucleotideprimersusedinRT-PCR.PrimerSequence(5’3’)PrimerSequence(5’3’)RACE-R3ATGTAGAAGGCGACGGAACG13LCGTCGTGTATCAAATAGTGCRACE-R2TTGCTAGCCATAGCCGACAG13RTTTGTACAGATGCTTAACCCRACE-R1TAAAAAGATTTTCTATCTAC14LTAAATGTTGGATCGAGCCTG1LAACGAAATTTTGTCCTTCCG14RTGGCAAAGCATTGACAGTAG1RATTTACCAGAGCAAGCGAGG15LTGGCAAAGCATTGACAGTAG2LTGGTTCTGTTGTGGTTACGC15RCTCTGACGGGTTTAATGTAG2RACCAGTGATAAAAGAGCGCC16LCTCTCTTTTGCACACGCGAC3LACCACTTGTTGCACGATGTC16RACAGCTACAGGAAGCTCACC3RACTCATAGCATTTGCGAACC17LGCTAAGTTGAAGCCAATGCC4LCTTTGCAAGCTATGGAGGAC17RTGCGGATAAAATGTCTGGAG4RCTTCAGGGTTGCACTCATAG18LTATGGATCTCCTGCTTGACG5LATGGATGGCTTGGTAGATGC18RTCTTGCGAAATGCCAATCTC5RACATTGAGATCACCCGGTAC19LTGTTGTACTGGGCGGTTATC6LTAGTGGCACCATCACACCTC19RGGTAGAAACCATCGTCAAGG6RAATAGTGGCAGGACCTGTCG20LGTTTCTGGACCATAGCATCG7LATGCCAATGGTGGTTCTAAG20RCCACTTGCAGGATCATACAC7RTCCACCCAAACCAGATAATG21LGTCAGCATTACAACTCAGCG8LTTGGTGTATCAGACGAAGCG21RGGACCAGTTCTATTGGGCAG8RAGGTGTACTTAGGCGTGTGG22LTTGACTCTACGTGAGCCTGG9LCTGGTGTTGTTGAGAAGTGC22RAACCGGTGACAAGTGAAGCA9RAGTTATATGCCGCAGTCAGC23LTTCCTCAATGGTAAAGCAGC10LATGGGTTTTAATGCACAAGG23RCATAGAGGGATAATGGCACC10RTGACAGGGACTCAGCATTCT24LGGTTGGGCTTTCTATGTCCG11LTAATCGTATCCAGCGTGAGG24RTTTAAATGCATCCACCTGTG11RACTCCTCACAAGCACCTACCRACE-L1GTAGCAGCTTGCTTCGGACC12LGAAAAGTGTGGAGCCGTAGCRACE-L2CAAAAATTTTGGAGATGCGG12RAAGAGCGAAACACCACCCACRACE-L3ATGCCTCAGGCTATGCTCAG2.2.6RNA的提取应用QIAGEN公司病毒基因组提取试剂盒提取上述滤液中病毒基因组的操作步骤如下：1)取离心的上清140μL，向其管中加入含有CarrierRNA的AVL560μL，振荡10s，室温静置10min；2)简短离心上述样品；3)加入560μL无水乙醇，轻轻混匀；11 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析4)简短离心上述样品；5)将EP管中的700μL液体移入QIAampspin柱中，盖上管盖，12,000rpm离心1min，弃去废液和收集管；6)重复步骤5；7)小心打开吸附柱的盖子，加入500μLBufferAW1，12,000rpm离心1min；8)小心打开吸附柱的盖子，加入500μLBufferAW2，12,000rpm离心1min；9)将吸附柱置入新的收集管中，13,000rpm离心3min；10)将吸附柱放入洁净的1.5mL的EP管中，向吸附柱中加入50μLBufferAVE，室温静置5min，13,000rpm离心1min；11)收集提取的病毒RNA，供检测和全基因组克隆用。2.2.7反转录和双链cDNA合成病毒RNA提取后立即进行反转录。反转录的引物为随机引物，反转录试剂盒为Invitrogen公司反转录试剂盒（SuperScriptIIIReverseTranscriptase）。反转录之前，将11μL病毒RNA和1μL100pmol的引物在75℃变性5min，立即置于冰上，静置≥2min后，加入反转录混合液如表2.2。反转录的反应程序如表2.3。表2.2反转录体系Table2.2ReagentsforRT成分量（μL）DTT1SuperScriptIIIReverse1TranscriptasedNTP(100mmol)25×buffer4病毒RNA和引物12总体系20表2.3反转录程序Table2.3ProcedureofRT温度（℃）时间（min）251052607052.2.8PCR扩增PCR扩增的引物为2.2.4中的引物，体系为50μL，模板和试剂如表2.4。PCR反应程序如表2.5。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析表2.4PCR反应体系Table2.4ReagentsforPCR成分量（μL）Pfu酶1Buffer5dNTP（2.5mmol）8引物Ln*(10mmol)5引物Rn*(10mmol)5模板5ddH2O21n*代表1~242.2.93’RACE和5’RACE3’RACE和5’RACE按照试剂盒操作步骤完成。2.2.10PCR产物的纯化切取目的片段，应用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收目的序列。AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒操作步骤如下：1)向装有上述切下来的凝胶的1.5mLEP管中，加入3倍体积的的BufferDE-A；2)75℃水浴，至凝胶全部溶解；3)加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；4)吸取上述混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，12,000×g离心1min。弃滤液；5)重复步骤4，至上述混合液全部离心完毕；6)将制备管置回离心管，加500μLBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液；7)将制备管置回离心管，加700μLBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液；8)将制备管置于2mL离心管中，12,000×g离心1min；9)晾干制备管中的残余的酒精；10)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜中加25~30μL水。12,000×g离心1min洗脱DNA。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析表2.5PCR反应程序Table2.5ProcedureofPCR温度（℃）时间循环数945min9440s︱5940s︱36cycles721.5min︱7210min4-2.2.11PCR产物的测序PCR产物直接送上海生工生物工程股份有限公司测序。2.2.12变异PEDV的序列分析2.2.12.1变异PEDV序列拼接通过DNAstar软件中SeqMan，对RT-PCR产物及RACE产物的测序结果进行拼接。2.2.12.2变异PEDV系统进化树分析和同源性比较通过MEGA软件对SH6分离株基因组的不同基因和其编码的氨基酸与从GenBank中调取PEDV代表株的基因组（JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013，AJ1102，GD-A，DR13,CV777和SM98）及本实验室分离的疫苗候选株JS-2013进行序列比对系统进化树分析及同源性比较。2.3结果2.3.1PEDV的分离及鉴定取样品滤液100L加入900L分离病毒的DMEM中，将1mL（100L+900L）样品培养液混合液，加入经PBS清洗3次的铺有单层Vero的T25细胞培养瓶中。第4天收取细胞并反复冻融3次，取100l前一代的病毒加入900L分离病毒的DMEM中，进行下一代接毒。本分离株，SH6，经过3代培养，出现明显的细胞病变（图2.1）。通过抗PEDV的N蛋白的单克隆抗体对该分离株进行免疫荧光检测。结果证实本试验成功分离的PEDV，我们将其命名为SH6。14 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析1~3：不同感染时间细胞病变程度；4：阴性对照1~3：Differentinfectiontime;4：Negativecontrol图2.1PEDV感染Vero细胞不同时间IFA检测结果Fig.2.1IFAdetectionofPEDVinVero2.3.2PEDV的全基因组克隆和序列分析通过RT-PCR扩增及RACE，本实验克隆了SH6的全基因组大小为28038bp（不包括PolyA）。其编码6个蛋白分别为poly蛋白，S蛋白，ORF3蛋白，E蛋白，M蛋白和N蛋白，大小分别为6781aa，1386aa，224aa，76aa，226aa和441aa。通过MEGA软件对SH6分离株基因组的不同基因和其编码的氨基酸和JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013，AJ1102，GD-A，DR13，CV777，SM98和JS-2013的系统进化树分析如图2.2~2.13。从图2.2~2.13中看出，本实验分离株SH6为PEDV的GroupII，且与本实验室分离的疫苗候选株JS-2013比较接近，初步判定为强毒株。从分析PEDV的不同基因及其编码的氨基酸的系统进化树结果显示，PEDV的S蛋白是对PEDV进行分型的最好的基因。图2.2SH6株的poly基因与参照序列系统进化树分析Fig.2.2PhylogeneicanalysisofpolygeneofSH6withrelatedsequences.15 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析图2.3SH6株的poly蛋白与参照序列系统进化树分析Fig.2.3PhylogeneticanalysisofpolyproteinofSH6withrelatedsequences.图2.4SH6株的S基因与参照序列系统进化树分析Fig.2.4PhylogeneticanalysisofSgeneofSH6withrelatedsequences.16 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析图2.5SH6株的S蛋白与参照序列系统进化树分析Fig.2.5PhylogeneticanalysisofSproteinofSH6withrelatedsequences图2.6SH6株的ORF3与参照序列系统进化树分析Fig.2.6PhylogeneticanalysisofORF3geneofSH6withrelatedsequences17 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析图2.7SH6株的ORF3蛋白与参照序列系统进化树分析Fig.2.7PhylogeneticanalysisofORF3proteinofSH6withrelatedsequences图2.8SH6株的E基因与参照序列系统进化树分析Fig.2.8PhylogeneticanalysisofEgeneofSH6withrelatedsequences18 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析图2.9SH6株的E蛋白与参照序列系统进化树分析Fig.2.9PhylogeneticanalysisofEproteinofSH6withrelatedsequences图2.10SH6株的M基因与参照序列系统进化树分析Fig.2.10PhylogeneticanalysisofMgeneofSH6withrelatedsequences19 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析图2.11SH6株的M蛋白与参照序列系统进化树分析Fig.2.11PhylogeneticanalysisofMproteinofSH6withrelatedsequences图2.12SH6株的N基因与参照序列系统进化树分析Fig.2.12PhylogeneticanalysisofNgeneofSH6withrelatedsequences20 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析图2.13SH6株的N蛋白与参照序列系统进化树分析Fig.2.13PhylogeneticanalysisofNproteinofSH6withrelatedsequences通过MEGA软件分析SH6分离株基因组的不同基因和其编码的氨基酸和JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013，AJ1102，GD-A，DR13，CV777,SM98和JS-2013的同源性比较见表2.6至2.9。从表2.6和2.7中看出，本实验分离株SH6与JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013和JS-2013等株核苷酸同源性较高，各个基因的同源性都大于99%，而与AJ1102，GD-A，DR13，CV777和SM98的核苷酸同源性相对较低。其中，SH6株的E基因和ORF3基因与JS-HZ2012，GD-B和JS-2013的同源性为100%。E蛋白和ORF3编码的蛋白是比较保守的基因，而S基因是易变异的基因。从表2.8和2.9中可以看出，SH6株S基因及S蛋白与JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013和JS-2013的S基因核苷酸及S蛋白氨基酸的同源性都大于99%，而与AJ1102，GD-A，DR13，CV777和SM98的S基因核苷酸和S蛋白氨基酸的同源性相对较低，分别为：94.3~98%和92.7~98.5%。21 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析表2.6SH6株基因片段与参考株同源性比较（％）Table2.6GenetichomologyofSH6withrelatedsequencesavailableinGenBankSH6毒株名ORF1abSMENORF3BJ-2011-199.899.699.699.699.599.6JS-HZ201299.899.799.3100.099.2100.0GD-B99.799.699.3100.099.2100.0USA/lowa/18984/201399.399.199.399.699.2100.0USA/KS/201399.399.299.399.699.2100.0AJ110299.498.097.999.696.297.3GD-A98.797.997.899.696.196.4CV77797.494.397.897.495.696.4SM98/94.097.796.595.4/DR1398.495.297.998.796.999.6JS-201399.699.499.3100.099.5100.0表2.7SH6株氨基酸序列与参考株同源性比较（％）Table2.7AminoacidhomologyofSH6withrelatedsequencesavailableinGenBankSH6毒株名ORF1abSMENORF3BJ-2011-199.799.498.7100.099.399.6JS-HZ201299.899.697.8100.099.1100.0GD-B99.799.297.8100.099.1100.0USA/lowa/18984/201399.599.397.8100.099.1100.0USA/KS/201399.699.497.8100.099.1100.0AJ110299.698.596.9100.096.897.3GD-A99.298.396.0100.096.896.4CV77798.493.598.298.796.496.4SM98/92.796.996.196.1/DR1399.194.497.8100.096.899.6JS-201399.799.297.8100.099.3100.022 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析表2.8SH6株与参考株S基因之间同源性（％）Table2.8HomologyofSgeneofSH6withrelatedstrains1234567891011121SH62JS-201399.43BJ-2011-199.699.64JS-HZ201299.799.699.15GD-B99.699.599.799.86USA/lowa/18984/201399.199.499.499.499.37USA/KS/201399.299.499.499.499.3100.08AJ110298.098.298.398.298.198.198.19GD-A97.998.198.298.298.098.098.098.210CV77794.394.394.694.594.494.394.394.494.211SM9894.094.094.394.294.093.994.094.193.999.612DR1395.295.295.495.495.295.295.295.195.098.598.1表2.9SH6株与参考株S氨基酸之间同源性（％）Table2.9HomologyofSaminoacidofSH6withrelatedstrains1234567891011121SH62BJ-2011-199.43JS-HZ201299.699.94GD-B99.299.699.65USA/lowa/18984/201399.399.699.799.46USA/KS/201399.499.699.899.499.97AJ110298.598.998.998.698.698.78GD-A98.398.698.798.398.498.599.49CV77793.593.893.893.693.793.893.793.610DR1394.494.694.894.494.694.794.694.598.011SM9892.793.193.192.992.993.093.192.999.197.112JS-201399.299.599.699.399.499.498.698.393.594.492.72.4讨论猪流行性腹泻最早于1978年在比利时和英国被发现报道，猪流行性腹泻病毒是引起猪流行性腹泻的重要病原体，该病毒是一种恶性高度接触性传染病原体。它给欧洲、亚洲的多个国家养猪业均造成了巨大的经济损失(PensaertanddeBouck,1978)。近年来，在中美地区，开始不断有报道发现变异的PEDV，该病原体能引起大量仔猪急性死亡(Lin,etal.,2014;Lowe,etal.,2014;Wang,23 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析etal.,2014)。我国自2010年下半年以来，我国多省市爆发了以哺乳仔猪表现为“顽固性腹泻”的疫情(Huangetal.,2013;Lietal.,2012;Pan,etal.,2012)。该病的主要特征表现为呕吐、腹泻脱水以及消化道粘膜损伤溃烂。PEDV对细胞、培养体系和培养的条件要求比较高。目前，分离出该病毒的报道不多。本试验采用本实验室前期分离JS-2013的技术，成功分离出SH6。通过IFA、全基因组克隆、系统进化树分析及同源性比较分析等证实成功分离出PEDV且该毒株为广泛流行的变异PEDV。通过与流行毒株经典毒株序列比对和遗传演化分析，发现分离株SH6与JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013和JS-2013等株核苷酸同源性较高，各个基因的同源性都大于99%，而与AJ1102，GD-A，DR13，CV777和SM98的核苷酸同源性相对较低。S基因是易变异的基因。SH3株S基因及S蛋白与JS-HZ2012，BJ-2011-1，GD-B，USA/lowa/18984/2013，USA/KS/2013和JS-2013的S基因核苷酸及S蛋白氨基酸的同源性都大于99%，而与AJ1102，GD-A，DR13，CV777和SM98的S基因核苷酸和S蛋白氨基酸的同源性相对较低。E基因、ORF3基因，N基因及它们编码的蛋白相对保守。目前，PEDV分为GroupI和GroupII，GroupI为经典的PEDV，如CV777和SM98等。而GroupII为变异的PEDV，即是广泛流行的PEDV。GroupII又分为GroupIIa和GroupIIb。本试验分离的SH6为广泛流行的变异PEDV，属于GroupII。24 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立目前，新生仔猪流行性腹泻病已在中国、韩国、越南、美国和加拿大等(Ojkicetal.,2015;Parketal.,2014;Vlasovaetal.,2014;Vuietal.,2014)国家流行。在国内，尽管导致新生仔猪腹泻的病因很多，但2011年至今以来，学者从表现为呕吐、水样腹泻、迅速脱水、高死亡率为特征的新生仔猪样品中分离到了PEDV。因此，我们可以认为：PEDV是近年来引起新生仔猪腹泻最重要病原。PEDV的N蛋白具有良好的抗原反应性，是制备诊断试剂的主要蛋白。目前国内外对PEDV的研究尚不深入，缺乏有效的诊断和研究工具。PEDV抗体检测有血清中和试验、免疫电镜观察(IEM)、间接血凝试验(IHA)、免疫组织化学技术、免疫荧光、原位杂交法、RT-PCR、ELISA等(SongandPark,2012)。其中，ELISA方法具有简单快速、敏感性高、特异性强、阳性检出率高、结果判定标准化等优点。因此，它不仅是目前应用最广泛的实验室检测方法之一，也适用于基层流行病学调查。目前市面上尚无商品化的PEDVELISA检测试剂盒，因此建立PEDV抗体ELISA检测方法具有一定现实意义。3.1材料与方法3.1.1主要材料与试剂PEDVJS2013由本实验室分离并保存；表达菌株BL21(DE3)购自全式金生物技术有限公司；XhoⅠ限制性内切酶、ExTaqDNA聚合酶、dNTP、In-FusionHDCloningKit均购自TaKaRa公司；蛋白纯化试剂盒His-Binding-Resin购自上海悦克生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，pCold-I载体由本实验室保存。PEDV阳性血清,由本实验室制备保存(将PEDV疫苗接种PEDV阴性30日龄健康仔猪,三次免疫后，釆集血液，分离血清)，阴性血清，由本实验室制备保存(PEDV阴性30日龄健康仔猪血液制备)；3、3,5、5四甲基联苯氨（TMB）购自AMRESCO公司；ELISA酶标板购自CORNING公司；抗体试剂：HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。ECL发光试剂盒（货号：34080）购自Thermo公司。3.1.2PEDV重组N蛋白的原核表达与纯化3.1.2.1引物设计根据N基因核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长（1326bp）的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物序列为：N-F：5’-GCTCGGTACCCTCGAGATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATC-3’；下游引物序列为：N-R：5’-ATTCGGATCCCTCGAGTTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCG-3’。酶切位点为XhoI。3.1.2.2N基因扩增与重组表达质粒的构建及鉴定提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物N-F、N-R扩增全长N基因，PCR体系方法参照第二章。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收胶产物后，送上海生工生物工程25 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立股份有限公司测序。测序正确的产物与用XhoI酶切后载体pCold-IDNA各100ng，用5×In-FusionHDEnzymePremix50℃连接15min后转化DE3感受态细胞，具体步骤如下：1)将连接产物10μL全部加入在冰上刚刚溶解的200μLDE3感受态细胞中，冰浴30min；2)再放入42℃水浴锅中，热激45s，再冰浴3min；3)在无菌操作台中，将冰浴后的产物加入装有1mL无抗的LB培养基的1.5mLEP管中。置于摇床中，200rpm/min37℃震荡1h；4)取出EP管，于离心机中4,000rpm离心2min，弃液保留100μL液体；5)用枪吹打均匀，于无菌操作台中均匀涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上。37℃培养14h~16h挑取菌落置于含有氨苄的2YT培养基中，摇菌，PCR鉴定重组表达质粒是否正确，提取PCR鉴定正确的质粒，具体步骤：选取N基因克隆阳性菌液，按OMEGA公司质粒抽提试剂盒的说明抽提质粒，具体操作步骤如下：1)4mLLB过夜培养的菌液，取出至1.5mLEP管中，1,000rpm离心1min，去液取沉淀，扣干。细菌沉淀中加入250μLsolution1溶液，使用震荡器重悬菌液；2)再加入250μLsolution2溶液，来回颠倒EP管,使其均匀混合，待液体变澄清为止；3)加入350μLsolution3溶液，来回颠倒EP管,可见溶液再次变浑浊，有絮状物沉淀物；4)12,000rpm离心10min，避开白色沉淀，小心吸取上清转至吸附柱中，12,000rpm离心1min后，弃液；5)在吸附柱中加入500μLBufferHB，12,000rpm离心1min，弃液。再加入700μLwashbuffer，12,000rpm离心1min，弃液。如此反复洗两次；6)弃液后的组合吸附柱12,000rpm空离1min，弃收集管，将吸附柱转置一个新的1.5mL的EP管；7)在吸附柱中央悬空加入40μLelutionbuffer，室温静置1min后12,000rpm离心1min。留收集液。取5μL质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序，其余放-20℃保存备用。测序正确的重组质粒命名为pCold-I-N。3.1.2.3N蛋白的原核表达及诱导条件的优化将pCold-I-N/DE3细菌加入到2YT液体培养基中，200rpm/min37℃活化至OD600nm0.6左右时，用终浓度分别为0.0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和0.8mM的IPTG于15℃下各自都诱导表达4h、8h、12h、16h、24h后，分别取诱导菌液500μL，10,000rpm离心2min，取菌体，进行SDS-PAGE实验分析，以确定最佳诱导浓度和时间。3.1.2.4目的蛋白纯化、定量及Western-blot分析将阳性菌2YT培养基中诱导表达过夜，离心收集菌体，用PBS洗两遍后，用20mL破菌缓冲液（4.2399gTris-HCL，23.376gNaCL，用去离子水定容至1L，PH=8.0）重悬，超声波裂解，离心收集上清液，用0.42nm滤膜过滤杂质后，按照His-Binding-Resin蛋白纯化试剂盒说明书纯化表达的N蛋白，具体操作步骤如下：1)轻轻晃动纯化树脂直至树脂完全悬起，吸取适量（8mL）的树脂(含50%浆料)至层析柱中；2)用10倍柱床体积的破菌缓冲液洗涤树脂。待树脂沉积在层析柱底部，形成一个圆柱形，将融合重组N蛋白上清液缓慢加入到柱子中，流速控制在10~15mL/h；26 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立3)待上清液上完柱子后，缓慢加入（避免破坏已沉淀的树脂形状）20倍体积的含有1mM咪唑的破菌缓冲液（母液是1M的咪唑溶液，用去离子水定容68.08g咪唑至1L，PH=8.0）洗涤柱子；4)接着用20倍体积的含有75mM咪唑的破菌缓冲液洗涤柱子，洗去杂蛋白；最后加入4mL含有200mM咪唑的破菌缓冲液洗脱目的重组蛋白，加入洗脱液后作用10min，收集目的蛋白后，再加入4mL洗脱液，作用10min，收集目的蛋白。定量分析纯化的重组蛋白，确定浓度后，保存于-20℃。接着进行Western-blot分析，将纯化的目的蛋白4μL与16μL6×loadingbuffer混匀后沸水中煮10min，10,000rpm离心1min，取10μL上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，采用伯乐半干转膜仪，电压15V，转印50min，将蛋白转印至硝酸纤维膜（NC膜）上。转印完毕后进行后续实验具体操作如下：1)封闭：用5%脱脂乳室温封闭NC膜1h；2)洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10min；3)加入一抗：PEDV阳性猪血清，用含有5%BSA的TBST缓冲溶液按照1:500-1,000的比例稀释一抗，室温作用1h或4℃孵育过夜；4)洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10min；5)加入二抗：Sigma公司HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，用TBST按1:6,000倍稀释后加入，室温作用1h；6)洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10min；7)显影：采用Thermo公司ECL发光试剂盒（货号：34080）进行曝光显影。3.1.3间接ELISA检测方法的初步建立3.1.3.1抗原最适包被浓度和血清最佳稀释浓度的优化用方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，将纯化的N蛋白用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释成不同浓度梯度（1µg/mL至10µg/mL）包被，每孔包被100μL，4℃包被过夜，用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5min。用5%脱脂乳37℃封闭1h后，用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5min。接着将PEDV阳性血清和阴性血清分别从1:50到1:400倍比稀释，37℃孵育1h，用同一洗涤液同样步骤洗三次后，加入HRP标记的羊抗猪IgG抗体37℃孵育1h。最后洗三次后，加入50μLTMD底物显色，37℃避光显色15min，用50μL2mol/LH2SO4终止反应，测定各孔OD450nm值，根据阳性血清孔OD450nm值（P）/阴性血清孔OD450nm值（N）（P/N）之比确定最佳抗原包被浓度与血清稀释浓度。3.1.3.2最佳包被液、最佳封闭液及封闭时间的优化用3.1.3.1中确定的抗原最适包被浓度，分别用0.05M碳酸盐包被液和0.01M磷酸盐包被液包被酶标板，洗涤后，分别用含5%脱脂乳5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST封闭，37℃分别封闭1h，2h，进行ELISA测定，血清稀释度参照3.1.3.1中确定的稀释度进行。通过探索，选择包被液、最佳封闭液及封闭时间。27 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立3.1.3.3包被温度时间和酶标二抗稀释度的优化用3.1.3.2中确定的包被液，以最适包被浓度包被N蛋白，包被温度和时间分别为4℃过夜，37℃1h，37℃2h，37℃4h，进行ELISA测定，洗涤后，按最适封闭条件封闭后，洗涤三次，4444血清按3.1.3.1中确定的稀释度稀释，孵育后洗涤，酶标二抗分别以1×10、2×10、4×10、8×10倍比稀释，通过各组阴阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的包被温度和时间以及最佳酶标二抗稀释度。其他步骤同3.1.3.1。3.1.3.4血清与酶标二抗的最佳作用时间的优化酶标板按选择条件包被封闭后，加入血清，按照前面已摸索出的用最佳稀释液以最佳稀释度稀释血清，37℃孵育时间为20min，30min，45min，1h，二抗孵育时间为20min，30min，45min，441h，二抗工作浓度为1:1×10到1:8×10，进行ELISA测定，以选择合适的待检血清与酶标二抗的作用时间及二抗的最佳稀释度。3.1.3.5显色温度与时间的优化显色温度分别为室温和37℃，显色时间为5min，10min，15min，进行ELISA测定，以确定最佳的显色温度与时间。3.1.4间接ELISA检测方法临界值的确立根据优化的条件检测本实验室保存的已知背景的24份PEDV阴性血清样品，统计测定的OD450nm值，依据统计学原理，当OD450nm≥X(平均值)＋3SD(标准差)时，可以判定为阳性。OD450nm≤X(平均值)＋2SD(标准差)时，可判定为阴性。介于二者之间为可疑。3.1.5符合率分析用建立的间接ELISA抗体检测方法检测50份已知背景猪血清，其中已知30份为阳性标准血清，20份为已知阴性血清。对比检测结果，计算分析该方法的符合率。总符合率（100％）=〔（阳性数+阴性数）/检测总数〕×100％3.1.6重复性测试3.1.6.1批内重复试验从同批次包被抗原的酶标板中随机取3组，用建立的间接ELISA抗体检测方法检测8份已知背景的样品，其中4份已知阳性样品，4份已知阴性样品编号（1-8），每个样品做3个平行重复。统计OD值结果计算批内变异系数。3.1.6.2批间重复试验取三个不同批次包被抗原的酶标板中分别取一组，检测上述已知背景血清样品，针对检测结果进行统计学分析，计算批间变异系数。28 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立3.2结果3.2.1PEDV重组N蛋白的原核表达及纯化3.2.1.1PEDVN基因的PCR扩增及pCold-I-N重组质粒构建通过PCR扩增出大小约1326bp的N基因，与预期结果相符（图3.1），PCR片段经胶回收后连接至pCold-IDNA原核表达质粒，对重组质粒进行PCR鉴定，并送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。测序结果表明载体构建成功。M:DNA标准1~3：PCR产物M：DNAMarkerDL150001~3：PCRproductsofNgene;图3.1PEDVN基因PCR产物电泳图Fig.3.1PCRproductselectrophoresisofPEDVNgene3.2.1.2构建原核表达载体后PCR及酶切鉴定结果载体pCold-IDNA用XhoI酶切后与扩增好的目的基因连接，构建pCold-I-N重组质粒。将插入N基因的重组载体用XhoⅠ酶切，结果得到大小约为1326bp和4407bp的两个片段（如图3.3），与预测结果一致。测序结果显示，基因插入位置、方向、读码框均正确。M:DNA标准；1：重组质粒PCR鉴定M：DNAMarkerDL15000；1：PCRproductsofpCold-I-N图3.2重组表达质粒pCold-I-N的PCR鉴定Fig.3.2PCRproductselectrophoresisofpCold-I-N29 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立M:DNA标准；1：重组质粒的酶切鉴定M：DNAMarkerDL15000；1：DigestionofpCold-I-NbyXhoⅠ图3.3重组表达质粒pCold-I-N的酶切鉴定Fig.3.3EnzymedigestionproductofpCold-I-N3.2.1.3重组N蛋白的表达纯化与westernblot分析经试验确定诱导表达N蛋白的IPTG最佳诱导浓度为0.4mM，在15℃下诱导4h目的蛋白的表达量最大，通过SDS-PAGE分析可以看到纯化的融合蛋白，表达产物大小约为52kDa，同时对超声裂解破碎细菌后的上清及沉淀一起进行电泳鉴定，表明融合蛋白以上清可溶形式存在（图3.4）。纯化后的表达产物经Westernblot显示，目的条带明显清晰。M：蛋白质分子量标准；1：空载体诱导产物；2：N蛋白纯化产物；3：表达产物破碎后的沉淀；4：表达产物破碎后的上清液；5：N蛋白纯化产物M:MolecμLarweightproteinMarker;1:ExpressionofplasmidpCold-IDNA;2:PurifiedNprotein;3:Inclusionbody;4:Thesupernatant;5:PurifiedNprotein图3.4纯化的N蛋白表达产物SDS-PAGE和重组N蛋白的westernblot结果Fig.3.4SDS-PAGEofNproteinandwesternblotdetectionofNprotein30 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立3.2.2间接ELISA方法的建立及条件优化结果3.2.2.1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定将N蛋白稀释成不同浓的度进行包被，PEDV阳性血清和阴性血清分别从50倍到400倍稀释，方阵滴定结果显示，抗原的最佳包被量为2µg/mL（200ng/孔），血清的稀释度为1:200，此时的阳性血清与阴性血清的OD450nm值相差最大（P/N=9.736）。表3.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定Table3.1Determinationofthecoatingconcentrationofrecombinantproteinandserumdilution抗原包被浓度（ng）血清稀释度血清1002004008001000P1.0101.1221.1461.2041.1851:50N0.1520.1630.2230.3690.499P/N6.6456.8835.1393.2632.375P0.8871.0070.9911.1341.1171:100N0.0990.1220.1560.2610.352P/N8.9598.2546.3534.3453.173P0.7760.8860.9430.9611.0181:200N0.0920.0910.120.1830.238P/N8.4359.7367.8585.2514.277P0.5530.6910.7980.8350.8611:400N0.0760.0840.0990.1380.165P/N7.2768.2268.0606.0505.2183.2.2.2最佳包被液、最佳封闭液及封闭时间的优化结果用不同包被液以2µg/mL(200ng/孔)包被酶标板，用不同的封闭液对包被的酶标板按不同时间进行封闭，试验结果表明，用0.05M碳酸盐包被液包被抗原，5%脱脂乳37℃封闭2h时，P/N值最大。此时为最佳条件。表3.2最佳抗原包被液和封闭条件的确定Table3.2Determinationofthecoatingbufferandthesealingcondition抗原包被液碳酸盐包被液磷酸盐包被液封闭液血清封闭时间(37℃)1h2h1h2hP1.2331.2781.1051.0735%BSAN0.1970.1940.1710.181P/N6.2586.5886.4625.928P1.4061.5681.1051.0865%脱脂乳N0.1130.0750.0680.088P/N12.44220.90716.25012.34131 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立3.2.2.3包被温度时间和酶标二抗稀释度的优化结果用0.05M碳酸盐包被液，分别以37℃1h、37℃2h、37℃4h、4℃过夜的条件包被抗原，4444实验结果表明37℃包被2h，P/N值最大；将酶标二抗分别作1×10、2×10、4×10、8×10倍稀4释后，置37°C作用1h，选择酶标二抗最佳稀释倍数。试验结果表明，2×10倍稀释时，P/N值4最高，因而确定最佳二抗稀释倍数为2×10。表3.3抗原最佳包被方法和二抗稀释度的确定Table3.3Determinationofthecoatingantigenconditionandtheanti-antibodydilution二抗稀释度血清抗原包被方法37℃1h37℃2h37℃4h4℃过夜P1.5651.5431.1461.36141×10N0.090.1060.110.158P/N17.38814.55610.4188.614P1.7781.8211.3421.85842×10N0.0870.0860.1130.116P/N20.43721.17411.87616.017P1.0271.0281.1131.25144×10N0.0810.0740.0710.107P/N12.67913.89215.67611.691P0.5660.5550.6360.67148×10N0.0720.0690.0670.074P/N7.8618.0439.4929.0673.2.2.4血清与酶标二抗的最佳作用时间的优化结果按上述确定条件进行实验，将血清按20min、30min、45min、60min四个时间段作用，洗三次后，将稀释好的酶标二抗按20min、30min、45min、60min四个时间段作用，根据OD450测定结果，计算P/N值，确定最佳血清孵育时间为20min，最佳二抗孵育时间为60min。32 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立表3.4血清最佳反应时间和二抗最佳反应时间的确定Table3.4Determinationofreactiontimeofserumandtheanti-antibody血清反应时间20min30min45min60min20min30min45min60min血清二抗反应时间20min20min20min20min30min30min30min30minP0.7190.7270.7140.7740.8240.7980.8860.810N0.0820.0890.0970.1120.0870.1030.1130.122P/N8.7688.1687.3616.9119.4717.7477.8406.639血清反应时间20min30min45min60min20min30min45min60min血清二抗反应时间45min45min45min45min60min60min60min60minP0.8240.9850.9310.9961.0881.1471.1761.141N0.090.1040.1200.1410.1140.1240.1280.156P/N9.1559.4717.7587.0649.5449.2509.1887.3143.2.2.5显色温度与时间的优化按上述条件实验，最后显色时，分别用室温和37℃，显色时间为5min，10min，15min，进行ELISA测定，分析实验结果表明，37℃显色15min，为最佳底物显色温度时间，此时P/N值可达21.760。表3.5底物最佳显色条件的确定Table3.5Determinationofthesubstratereactioncondition底物显色条件血清室温5min室温10min室温15min37℃5min37℃10min37℃15minP0.5740.9711.5680.6531.1271.632N0.0730.1620.0750.0750.0880.075P/N7.8635.99420.9068.70612.80721.7603.2.3间接ELISA临界值的确立取本实验室保存的已知背景的24份PEDV阴性血清样品，以优化的间接ELISA实验条件检测，对结果进行统计学分析，计算其平均值为0.248，标准差为0.048。当OD450nm≥X＋3SD=0.394的血清判为阳性；当OD450nm≤X＋2SD=0.345的血清判为阴性，两者之间为可疑血清。33 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立表3.624份猪阴性血清的ELISA检测结果Table3.6Detectionresultsof24porcinenegativeserumsamples样品数OD450值1-80.3490.2340.1950.3220.2480.2520.2310.2399-160.2150.3040.2210.3390.1910.2230.2630.29417-240.2280.2630.2410.1860.2330.2110.3110.174X0.248SD0.0483.2.4间接ELISA符合率试验结果用已经建立的间接ELISA方法对30份阳性样品和20份阴性样品进行检测，结果显示30份阳性样品27份为阳性，3份为可疑；20份阴性样品检测均为阴性，计算符合率结果为94%。表3.7符合性试验结果Table3.7TheresultsofconformanceofELISAN蛋白间接ELISA检测结果阳性阴性可疑已知阳性样品（30份）2703已知阴性样品（20份）0200总符合率(%)=〔（27+20）/50〕×100%=94%3.2.5间接ELISA重复性试验结果同批次的包被抗原酶标板检测结果显示，批内重复试验变异系数在2.1%~9.9%之间；不同批次的包被抗原酶标板检测结果显示：批间重复试验变异系数在3.2%~7.1%之间，都不超过10%。因此，该间接ELISA法具有良好的重复性。表3.8批内重复性试验结果Table3.8Theresultsofintra-assayrepeattestsOD450值重复次数1234567810.3480.2250.2260.2340.4140.4780.4890.43320.3340.2520.1910.2260.5010.4610.5180.39430.3410.2320.2300.2090.4430.4790.4830.469平均值0.3410.2360.2160.2230.4530.4730.4970.432标准差0.0070.0140.0210.0130.0440.0100.0190.038变异系数0.0210.0600.0990.0570.0970.0220.0380.08734 中国农业科学院硕士学位论文第三章PEDVN蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立表3.9批间重复性试验结果Table3.9Theresultsofinter-assayrepeattests不同批次OD450值1234567810.5140.5560.4220.4740.2460.1930.2330.28220.5070.6110.4850.5130.2530.2160.2210.27730.4830.5420.4640.5210.2610.2190.2540.314平均值0.5010.5690.4570.5030.2530.2090.2360.291标准差0.0160.0360.0320.0250.0070.0140.0170.020变异系数0.0320.0630.0700.0490.0300.0670.0710.0693.3讨论PEDVN蛋白是一种磷酸化的核衣壳蛋白，它与基因组RNA紧密结合，是PEDV中所占比例最大的一种结构蛋白，且其高度保守，具有良好的抗原反应性和特异性。能诱导机体快速产生较高水平的特异性抗体，可作为PEDV早期感染的诊断依据。在上一章节中我们成功分离到了一株PEDV流行毒株SH6，由于目前国内外对PEDV研究尚不深入，对该病的准确监测仍存在技术难关，因此，建立实用的PEDV实验室检测方法迫在眉睫。酶联免疫吸附试验是一种常用的经典血清学检测方法，它操作简便、灵敏度高，特异性强。不仅可用于实验室流行病学研究，也适用于大规模流行病学调查。目前市面上有一些以全病毒抗原为基础的商品化PEDV检测试剂盒，但该病毒不易分离培养，因此难以制备大量抗原。此外，这些ELISA试剂盒还可能存在排散病毒的隐患。本研究扩增其N基因，以pCold-IDNA作为原核表达载体，构建pCold-I-N重组质粒，并将其转化感受态细胞BL21(DE3)，目的蛋白在上清液中高效表达。采用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化，得到浓度为1.5mg/mL的目的蛋白。Westernblot分析表明该蛋白具有良好的抗原反应性。利用纯化的重组蛋白，初步建立间接ELISA检测方法，优化各项反应条件。间接ELISA优化后条件为：最佳包被液0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6），最佳抗原包被量为200ng/孔，最佳包被条件为37℃包被2h，最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭2h，最佳血清稀释度为1:200，血清4最佳孵育时间为37℃孵育20min，二抗最适稀释度为1:2×10，二抗最佳孵育时间为40min，临界值为当OD450nm≥0.394时判定为阳性，OD450nm≤0.345时判定为阴性，0.345~0.394为可疑。并对50份已知背景血清进行检测，符合率达94%。由于目前市面上尚未有商品化的ELISA检测试剂盒，因此，无法进行检测比较。用该方法筛选阴性猪，以便相关动物实验的展开。然后在样品检测过程中，会出现假阳性的现象。分析其原因，可能是由于本实验是以E.coliBL21（DE3）作为外源基因原核表达宿主菌，而普通的大型养殖场中，极易发生大肠杆菌感染，因此，猪体内可能存在抗大肠杆菌抗体，而使检测结果呈现假阳性现象。还需进一步探求新的检测方法，以提高PEDV检测的准确度，用于PEDV抗体检测和流行病学调查。35 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立猪流行性腹泻病毒是引起猪流行性腹泻的重要病原体，该病毒是一种恶性高度接触性传染病原体。核衣壳（N）蛋白在PEDV的结构蛋白中所占的比例较大，具有较强的抗原性，不仅能够诱导宿主T细胞和B细胞免疫反应，而且在猪在感染PEDV的早期,体内就能快速产生抗N蛋白的高水平抗体。因此，本研究通过原核表达获得PEDVN蛋白，对其进行纯化，通过Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原活性和特异性。将其作为免疫原制备抗N蛋白单克隆抗体，将该单克隆抗体作为一抗，初步建立竞争ELISA抗体检测方法(Bhatiaetal.,2008;Jabraneetal.,1992)。便于深入研究，为PEDV准确快速的病原诊断和鉴别诊断、PEDV感染相关的基础性研究提供了物质基础。4.1材料与方法4.1.1主要材料与试剂PEDV阳性血清,由本实验室制备保存（将PEDV疫苗接种PEDV阴性30日龄健康仔猪,三次免疫后，釆集血液，分离血清），阴性血清,由本实验室制备保存（(PEDV阴性30日龄健康仔猪血液制备)；3、3,5、5四甲基联苯氨（TMB）购自AMRESCO公司；ELISA酶标板购自CORNING公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；牛血清白蛋白（BSA）和脱脂乳购自biosharp公司；吐温2000购自MPBiomedicals公司。弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FICA）、聚乙二醇（PEG）均购自Sigma公司。培养基：细胞培养液DMEM购自lifetechnologies公司；HAT、HT培养基、胎牛血清均购自Sigma公司。抗体试剂：HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。ECL发光试剂盒（货号：34080）购自Thermo公司。4.1.2包被抗原的制备参见3.1.24.1.3抗N蛋白单克隆抗体的制备4.1.3.1病毒、样品、细胞和实验动物PEDV毒株、PRRSV、JEV、CSFV和PRV由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室分离保存；骨髓瘤细胞SP2/0细胞和Vero细胞由本实验室保存；6周龄BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。4.1.3.2动物免疫以纯化的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为免疫原，免疫6周龄BABL/c雌性小鼠。首次免疫以纯化的N蛋白与弗氏完全佐剂1:1比例混合，超声乳化后按50μg/只（200μL/只）的抗原量经腹腔注射。两周后，再经腹腔注射，用弗氏不完全佐剂处理同一剂量抗原，每隔两周重复免疫一次。二免后，眼眶采血，ELISA检测血清中抗体效价。第三次免疫开始，不加佐剂。融合前3~4d，36 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立腹腔注射纯抗原加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合。4.1.3.3间接ELISA方法检测小鼠血清效价二免后小鼠眶静脉采血检测抗体效价，4,000rpm离心10min，收集血清，用初步建立的间接ELISA方法确定小鼠血清抗体效价的改变，方法如下：1)包被：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100μL，37℃包被2h；2)洗涤：用含有5‰tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5min；3)封闭：5%脱脂乳37℃孵育2h，200μL/孔；4)洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5min；5)加待测血清：用5%脱脂乳将待测血清样品倍比稀释，稀释比例分别为l:100、1:1,000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000。100μL/孔，设立阴性对照及空白对照。37℃培养箱作用20min；6)洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5min；7)加入二抗：用5%脱脂乳按1：10,000倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育40min；8)洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5min；9)显色：每孔加入50μLTMB显色液，避光37℃孵育15min；10)终止：每孔加入50μL2MH2SO4；11)OD值检测：酶标仪测定OD450值。血清效价定义为当OD值大于或等于阴性对照OD值2倍时的最高血清稀释倍数。4.1.3.4骨髓瘤细胞系的复苏与传代培养从液氮罐中取出骨髓瘤细胞（SP2/0细胞）冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并不断摇晃，使其在1min内迅速解冻。待全部融化后，1,000rpm离心5min。用75%的酒精擦拭细胞冻存管外壁后，转入无菌操作台操作。弃上清,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液重悬沉淀细胞。移入T25细胞培养瓶中，再补加4mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液。放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。复苏6~12h内换液，避免冻存液中残余的DMSO对细胞的毒性作用。细胞培养严格按照无菌操作进行，当细胞培养液变黄时及时进行换液。一般2~3d换一次培养液，当细胞处于对数生长期,长满细胞培养瓶底面时，可进行细胞传代。传代时弃去细胞瓶中的培养液。用移液枪吸取新的含10%胎牛血清的DMEM完全培养液轻轻吹打细胞，待将瓶底的细胞完全吹落后，补加适量的培养液，分到两个T75细胞培养瓶中，如此反复，待细胞长满后重复这一操作。细胞融合当天，将细胞吹落后，收集于50mL离心管中，1,000rpm离心10min，弃上清。用20mLDMEM基础培养液洗一次。再用20mLDMEM基础培养液重悬细胞，并用细胞计数板计数，备用。4.1.3.5饲养细胞的制备试验用具：小剪刀一把,，弯头、直头的镊子各一把，手术刀一把，灭菌烧杯（200mL）一只，15mL离心管，灭菌培养皿若干，兽用一次性注射器(10mL)若干，大头针5个，DMEM基础培养液，双抗HAT培养液，96孔细胞培养板，泡沫板一个，保鲜膜。在融合前ld，取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，取阴性血清。待血流尽后，断髓致死小鼠。37 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立并将其浸泡入75%酒精中，5~10min后放入无菌操作台。操作如下：1)用大头针将小鼠腹部朝上四肢固定于铺有保鲜膜的泡沫塑料板上。用镊子提起腹部正中皮肤后，用剪刀剪开一个小口（注意不要剪破腹膜），用手术刀紧贴皮肤分离组织充分暴露腹部；2)在培养皿中倒入20mLDMEM基础培养液，用10mL注射器吸取培养液缓慢注入小鼠腹腔中反复冲洗，避开肠系膜及脂肪组织。用酒精棉球轻轻地按摩两侧腹部，缓慢抽取腹腔液体（注射器不要拔出）；3)充分收集腹腔内液体后，1,000rpm离心10min。弃上清，用双抗HAT培养液重悬细胞。用5细胞计数板计数，调整细胞浓度至2×10/mL；4)将调整好细胞浓度的液体分装于96孔细胞培养板中，100μL/孔，放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。4.1.3.6脾细胞悬液的制备试验用具：小剪刀一把,，弯头、直头的镊子各一把，手术刀一把，灭菌烧杯（200mL）一只，50mL离心管、灭菌培养皿若干，兽用一次性注射器（5mL）若干，大头针5个，DMEM基础培养液，双抗HAT培养液，泡沫板一个，保鲜膜。5取加强免疫后，经检测血清效价10以上的的BALB/C小鼠，摘除眼球，收集血清，4,000rpm/min离心取上清，可作为融合及亚克隆检测时的阳性对照。待血流尽后，断髓致死小鼠。并将其浸泡入75%酒精中，5~10min后放入无菌操作台。操作如下：1)将小鼠腹部朝上四肢固定于泡沫板上，无菌开腹腔并用镊子钝性分离取出完整脾脏。注意不要刺破脾脏脾；2)在培养皿中放入20mLDMEM基础培养液，放入分离干净的完整脾脏；3)用5mL无菌注射器小心在脾脏一端轻扎几个小孔，在另一端用5mL无菌注射器吸取基础培养液后小心刺入脾脏冲洗脾脏，多次反复直至脾脏变为灰白色，脾内细胞完全冲出为止；4)将带有脾细胞的冲洗液转入50mL离心管中，用DMEM基础培养液洗涤两次后（1,000rpm7离心10min），最后重悬、计数备用（脾细胞数需在10以上）。4.1.3.7细胞的融合试验用具：先前准备的骨髓瘤细胞与脾细胞，DMEM基础培养液，HAT培养液，HT完全培养液，PEG，盛有37℃水的500mL烧杯，50mL灭菌离心管，计时器等1)将计数备用的SP2/0骨髓瘤细胞悬液和免疫脾细胞悬液按1:5的比例混合置于50mL离心管内，补加DMEM基础培养液至30mL，充分混匀；2)1,000rpm离心10min后，弃上清，小心扣干后，轻击管底使细胞沉淀分散呈糊状；3)1mLPEG于37℃中预温，将装有脾细胞和SP2/0细胞的离心管放在盛有37℃的500mL烧杯中，边转动离心管，边将预热的PEG溶液缓慢滴加到离心管中，在1min内加完后静止2min；4)然后用DMEM基础培养液稀释PEG终止融合。先加入1mL，再加入5mL，最后加入34mL。5min内均匀加完后，1,000rpm离心10min。弃液。用37℃预热的含20%血清HAT培养液重悬细胞后，100μL/孔加入到铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养；5)3d后观察细胞融合情况，用HAT培养液换液适当补液,并渐渐用HT完全培养液替换HAT38 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立培养液。融合10~14d后，用排枪小心吸取50μL细胞培养上清，用间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株。4.1.3.8阳性杂交瘤的筛选待融合细胞长至孔底1/3~l/2面积时，采用之前所建立的间接ELISA检测方法检测细胞培养上清液，筛选阳性孔。其中融合细胞上清液为一抗，SP2/0细胞上清液为阴性对照，阳性对照为融合前小鼠血清，HRP-羊抗鼠IgG为二抗。具体方法为：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pCold-IDNA表达载体His标签蛋白分别包被ELISA酶标板，每孔包被量为100ng/100μL，4℃包被过夜。5%脱脂乳37℃200μL/孔封闭后备用。取50μL细胞上清液一一对应加入到包被重组N蛋白与His标签蛋白的酶标板，每孔培养上清液50μL，脱脂乳50μL，混匀，37℃培养箱作用1h后用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，每次5min。再用5%脱脂乳按1:10,000倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育1h。接着用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次。显色时每孔加入50μLTMB显色液，避光室温孵育10min。最后每孔加入50μL2MH2SO4终止反应。用酶标仪测定OD450值。经过重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pCold-IDNA载体标签蛋白双重ELISA筛选后，选取载体标签蛋白反应阴性、重组N蛋白反应阳性的、OD值最高的具有特异性的阳性细胞孔，扩大培养后进行4次亚克隆，每次亚克隆后均进行双重ELISA筛选鉴定阳性克隆。筛选的阳性杂交瘤细胞经扩大培养，用于单抗腹水制备。4.1.3.9有限稀释法克隆杂交瘤细胞本研究采用有限稀释法进行亚克隆。克隆前1d制备饲养细胞（方法见4.1.3.5）。用枪头将原孔中待亚克隆的杂交瘤细胞反复吹打均匀后，取10μL细胞悬液稀释10倍后进行细胞计数。经计算，取适量的细胞稀释到HT培养液中，使细胞浓度为4个/100μL、2个/100μL、1个/100μL。然后用排枪每组四列依次加入到铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL。然后将其置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。观察细胞的生长状态，尤其对呈圆蘑菇状的，单克隆细胞集落特别标注，约一周后，小心吸取杂交瘤细胞液上清液，对其进行ELISA检测。取阳性克隆扩大培养后，接着在进行下一次克隆筛选。直至培养板上凡是有细胞的生长孔的培养上清阳性率达到100%，筛到稳定分泌单克隆抗体的单克隆细胞株为止。一般至少进行三次亚克隆。然后将筛选出的单克隆细胞株扩大培养，冻存。4.1.3.10杂交瘤细胞的冻存与及稳定性试验冻存前12~24h换液使杂交瘤细胞处于对数生长期,选择细胞活力最好时冻存。具体操作如下：用DMEM基础培养基将杂交瘤细胞吹打下来，移入离心管中，用1,000rpm离心10min后，弃6液。用冻存液（DMEM基础培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1）重悬，调整细胞浓度至3×10个/mL。转入冻存管中，每管1mL，然后置于4℃1h，-20℃2h，-80℃24h。最后放入液氮罐中保存。细胞冻存1个月，2个月，4个月后，复苏细胞（杂交瘤细胞的复苏参见4.1.3.4），并用间接ELISA检测其分泌抗体的能力。检测方法同4.1.3.3。4.1.3.11腹水的制备及效价的测定单抗腹水制备，具体步骤如下：选取6周龄BABL/c雌性小鼠，腹腔注射降植烷，200μL/6只。免疫降植烷一周后，阳性杂交瘤细胞计数，基础DMEM培养基重悬，细胞计数后，10/只，200μL每只接种小鼠腹腔。一周后观察小鼠腹部变化，若出现腹部胀大，即进行腹水采集，采集39 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立腹水4,000rpm/min离心10min，弃去脂肪组织等杂质后，将黄色清亮的上清，经ELISA检测效价后，分装-80℃保存，备用。同时用SP2/0细胞代替阳性杂交瘤细胞制备阴性腹水。4.1.3.12单克隆抗体的纯化透析袋的处理：1)将最大孔径规格为8~14KD的透析袋剪成10cm的小段；2)将透析袋放入500mL含2%NaHCO3、1mMEDTA（PH=8.0）的液体中煮沸10min；3)用大量蒸馏水反复涮洗透析袋；4)再用蒸馏水煮透析袋10min,冷至室温即可使用；5)其余透析袋保存于蒸馏水中，备用。初步的纯化，具体步骤如下：1)吸取7mL腹水加入到带有搅拌子的25mL小烧杯中；2)向烧杯中缓慢滴加饱和硫酸铵7mL，边加边搅拌，于4℃搅拌2h；3)7,000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；4)用7mLPBS（0.01M，PH7.2）重悬沉淀；5)把重悬液装于透析袋中，在4℃用PBS（0.01M，PH7.2）透析24h。不时摇晃一下；6)用枪头将透析完的腹水，小心吸取出来，存于-20℃冰箱内。精纯化：使用HiTrapProteinGHP对初步处理过的腹水进行精纯化，具体步骤如下：主要试剂：饱和硫酸铵，20mM磷酸钠溶液PH=7.0（Bindingbuffer），0.1M甘氨酸盐酸溶液，PH=2.7（Elutionbuffer），1MTris-HCl，PH=9.0；0.01MPBS，PH=7.2。1)往纯化柱子中加入60-200μL的1MPH=9.0的Tris-HCl溶液，平衡柱子；2)用加入bindingbuffer的注射器注入柱子，将柱子内空气排空。用10倍柱子体积的bindingbuffer洗柱子；3)上样品，即用注射器缓慢小心地将初步纯化的腹水推入柱子中；4)将5-10倍柱体积的bindingbuffer缓慢推入柱子洗去杂质；5)最后，用2-5倍柱体积的elutionbuffer洗脱目的抗体。测浓度后，分装于-20℃保存备用。4.1.4抗N蛋白单克隆抗体的初步应用4.1.4.1westernblot检测将制备的腹水，作为一抗抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的特异反应性，检测。具体操作如下：收取细胞样品：从中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室，获得猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒，猪伪狂犬病毒，乙型脑炎病毒感染的细胞样品，与猪流行性腹泻病毒JS-2013感染的Vero细胞样品。按照4:1体积比混合5×样品缓冲液，煮沸10min后，-20℃保存备用。westernblotting：10μL等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，采用伯乐半干转膜仪，电压15V，转印50min，将蛋白转印至硝酸纤维膜（NC膜）上。转印完毕后进行后续实验具体操作如下：1)封闭：用5%脱脂乳室温封闭NC膜1h；40 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立2)洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10min；3)加入一抗：制备的腹水，用含有5%BSA的TBST缓冲溶液按照1:500-1,000（未纯化前）的比例稀释一抗（用SP2/0细胞上清液作一抗作阴性对照），室温作用1h或4℃孵育过夜；4)洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10min；5)加入二抗：Sigma公司HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，用TBST按1:6,000倍稀释后加入，室温作用1h；6)洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10min；7)显影：采用Thermo公司ECL发光试剂盒（货号：34080）进行曝光显影。4.1.4.2IFA检测将制备的腹水，作为一抗，IFA检测腹水的特异性反应性，其中腹水（未纯化前）用PBS缓冲溶液按照1:1,000-4,000的比例稀释，SP2/0细胞培养上清液做阴性对照；二抗为FITC羊抗鼠IgG购自Sigma公司，用PBS按1:1,000倍稀释后加入六孔板。具体方法参照2.2.3。4.1.5竞争ELISA检测方法的初步建立4.1.5.1血清稀释度和一抗稀释度的优化用方阵滴定法确定最佳血清稀释度和一抗稀释度，将本实验保存的PEDV标准阳性血清和阴性血清按1:1，1:5，1:10四个稀释倍数稀释后，37℃作用1h，洗涤三次后拍干，将2.2.2.4中制4444备纯化的MAb2B8作为一抗，按照1×10、2×10、4×10、8×10梯度稀释，终止反应后，测定各孔OD450nm值，根据阴性血清孔OD450nm值（N）/阳性血清孔OD450nm值（P）（N/P）之比确定最佳血清稀释浓度与一抗稀释度。4.1.5.2抗原包被液、封闭条件和血清作用时间的优化分别用0.01M磷酸盐包被液和0.05M碳酸盐包被液包被酶标板，洗涤后，分别用含5%脱脂乳5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST封闭，37℃分别封闭1h，2h，血清按照10min，20min，40min，60min不同的时间孵育，进行ELISA测定，根据统计学方法分析实验结果，选择包被液、最佳封闭液及封闭时间和最佳血清孵育时间。4.1.5.3一抗和二抗最佳工作时间的优化酶标板按选择条件包被封闭后，加入血清，按照前面已摸索出的用最佳稀释液以最佳稀释度稀释血清孵育后，洗三次，将一抗按照3.1.6.1中确定好的稀释度稀释，37℃分别孵育10min，20min，40min，60min，二抗分别孵育10min，20min，40min，60min，进行ELISA测定，以选择合适的一抗与酶标二抗的作用时间。4.1.5.4二抗最佳稀释度的确定4444按前面确定好的工作条件进行竞争ELISA检测，二抗按照1×10、2×10、4×10、8×10梯度稀释，终止反应后，计算N/P值，根据统计学方法分析结果，确定二抗最佳稀释度。4.1.5.5显色温度与时间的优化显色温度分别为室温和37℃，显色时间为5min，10min，15min，20min，进行ELISA测定，以确定最佳的显色温度与时间。41 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立4.1.6竞争ELISA检测方法临界值的确定根据优化的条件检测本实验室保存的已知背景的24份PEDV阴性血清样品，统计测定的OD450值，分别计算抑制率（PI）：抑制率=（阴性-待测）/阴性，并计算抑制率的平均值（X）和抑制率的标准差（SD），再依据统计学原理，当PI≥X（平均值）＋3SD（标准差）时，可以判定为阳性。PI≤X（平均值）＋2SD（标准差）时，可判定为阴性。介于二者之间为可疑。4.1.7符合率分析用已初步建立的竞争ELISA抗体检测方法检测已知30份已知背景为阳性标准血清，20份已知背景为阴性标准血清。对比检测结果，计算分析该方法的符合率。总符合率（100％）=〔（阳性数+阴性数）/检测总数〕×100％4.1.8重复性测试4.1.8.1批内重复试验从同批次包被抗原的酶标板中随机取3组，用建立的竞争ELISA抗体检测方法检测4份已知阳性样品，4份已知阴性样品编号（1-8），每个样品做3个平行重复。统计OD值结果计算批内变异系数。4.1.8.2批间重复试验取三个不同批次包被抗原的酶标板中分别取一组，检测上述已知背景血清样品，针对检测结果进行统计学分析，计算批间变异系数。4.2结果4.2.1包被抗原的制备参见3.2.14.2.2抗N蛋白单克隆抗体的制备4.2.2.1免疫动物血清效价的测定5间接ELISA结果表明，四只免疫小鼠的抗体效价达到1:1×10。四只小鼠的抗体效价几乎相近（如图4.1)。选择第三号小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体。筛选的细胞命名为2B8。42 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立2.5Mouse12.0Mouse2Mouse31.5Mouse4NC1.0OD450nm0.50.01:1001:10001:100001:100000图4.1免疫小鼠血清效价的测定。四免后，分别采取免疫后小鼠和未免疫小鼠的血清。十倍梯度稀释血清后，用间接ELISA检测。OD450值如上图所示。Fig.4.1Detectionofimmunizedmouseserumtiter.Afterfourimmunizations,positiveserumandnegativeserum(asnegativecontrol[NC])acquiredfromimmunizedandnon-immunizedmice,respectively.AseriesoftentimesdilutedserumwasaddedintoELISAplatescoatedbyrNprotein.ThevalueofOD450asshowedabove.4.2.2.2细胞融合和阳性杂交瘤细胞筛选结果本次实验用6块96孔细胞板进行细胞融合，融合率可达90%,经过初次筛选和二次筛选，共有6孔杂交瘤细胞孔产生阳性。采用有限稀释法，经四次克隆纯化后，获得1株分泌抗体特性稳定、抗体效价高，细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。命名为：2B8。4.2.2.3杂交瘤细胞稳定性试验结果用间接ELISA法检测筛选出的杂交瘤细胞F5、F10、F15、F20、F25、F30代细胞培养上清，并对冻存1个月，2个月，4个月后复苏的杂交瘤细胞上清进行检测，发现其依然能稳定的分泌特异性抗体。4.2.2.4单克隆抗体的纯化及效价测定纯化后的PEDV抗N蛋白单克隆抗体浓度为1.511mg/mL。用间接ELISA法测定的其效价为：51×10。2.01.51.0OD450nm0.50.0MAb2B8阳性阴性His标签图4.2抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗ELISA效价鉴定Fig.4.2DetectionofMAbagainstPEDVNproteintiter43 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立4.2.3抗N蛋白单克隆抗体的初步应用4.2.3.1westernblot检测结果westernblot检测结果显示，制备的抗N蛋白单克隆抗体与感染PEDV的Vero细胞反应，出现特异性条带。反之，SP2/0细胞上清并未与之产生特异性条带。并且，该单克隆抗体与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS）,乙型脑炎病毒（JEV），猪瘟病毒（SFV），伪狂犬病毒（PRV）不发生特异性反应。证明该MAb能特异性识别PEDV感染的细胞，而不识别其他病毒感染的细胞。1：SP2/0细胞培养上清液对感染PEDV的Vero细胞进行westernblot结果；2：MAb2B8对感染PEDV的Vero细胞进行Westernblot结果。1：VerocellswhichisinocμLatedPEDVisinspectedwithSP2/0cellsculturesupemate;2:VerocellswhichisinocμLatedPEDVisinspectedwithMAb2B8.图4.3Westernblot检测Fig.4.3Westernblotanalysis.图4.4猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性鉴定Fig.4.4DetectionofspecificityofMAbagainstPEDVNprotein4.2.3.2IFA检测结果MAb与感染PEDV的Vero细胞反应产生特异性荧光，反之，SP2/0细胞上清与感染相同病毒的Vero细胞反应并未产生特异性荧光。该IFA实验结果进一步证明2B8特异性识别PEDV。44 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立图4.5免疫荧光检测。SP2/0细胞上清和MAb2B8分别作为一抗与感染PEDV的Vero细胞反应。FITC-羊抗鼠抗体作为二抗。结果如上所示。Fig.4.5Indirectimmunofluorescenceassays.VerocellswereinfectedwithPEDV,andMAb2B8andSP2/0cellculturesupernatantwasusedasprimaryantibody,respectively,followedbyincubationofFITC-conjugatedsecondaryantibody.Arepresentativecomparisonisprovided.4.2.4竞争ELISA检测方法的建立及条件优化结果根据间接ELISA的最佳包被浓度2µg/mL（200ng/孔）包被抗原，4℃过夜后，继续其他条件的优化实验。4.2.4.1最佳血清稀释度和一抗稀释度的确定将标准阴性血清和阳性血清按1:1,1:5,1:10,1:50四个梯度稀释后，常规方法37℃孵育1h，一44444抗按照1×10、2×10、4×10、8×10梯度稀释，方阵滴定结果显示，当血清按1:1稀释，一抗1×10稀释时，此时的阴性血清与阳性血清的OD450nm值相差最大（P/N=3.596）。表4.1血清稀释度和一抗稀释度的确定Table4.1Determinationoftheserumandtheprimaryantibodydilution一抗稀释度血清稀释度血清44441×102×104×108×10P0.4010.2840.210.1531:1N1.4420.9980.740.451N/P3.5963.5143.5242.947P1.0890.8630.5970.4161:5N1.4491.0620.7610.499N/P1.3301.2301.2751.199P1.4051.0380.7660.5221:10N1.4591.1300.7750.542N/P1.0381.0881.0111.038P1.4381.0640.7310.5231:50N1.4681.1750.8060.525N/P1.0211.1041.1021.00345 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立4.2.4.2最佳抗原包被液、封闭条件和血清作用时间的确定分别用不同的包被液包被酶标板后，用不同的封闭液对包被的酶标板按不同时间进行封闭，接着按上述实验结果，血清按1:1稀释后，分不同时间段作用，试验结果表明，用0.05M碳酸盐包被液包被抗原，5%脱脂乳37℃封闭1h，血清于37℃作用60min时，N/P值最大（3.808），此时条件最佳。表4.2最佳抗原包被液、封闭条件和血清工作时间的确定Table4.2Determinationofthecoatingbuffer,thesealingconditionandreactiontimeofserum封血清作用时间（37℃）封闭闭10min20min40min60min时间液血清抗原包被液（磷酸盐包被液/碳酸盐包被液）即（磷/碳）(37℃)碳磷碳磷碳磷碳磷5%P0.1950.1650.2980.2630.4050.3640.2720.399脱脂N0.3850.3590.6420.6310.9500.8941.0360.9701h乳N/P1.9742.1762.1542.3992.3452.4563.8082.431P0.1870.1710.2990.2510.4090.3840.2780.4385%N0.4140.4250.7590.6831.0081.0151.0301.067BSAN/P2.2132.4852.5382.7212.4642.6433.7052.4365%P0.1700.1650.3040.2440.4490.3890.3350.398脱脂N0.3370.3620.5820.6230.9050.8800.9410.9842h乳N/P1.9822.1931.9142.5532.0152.2622.8082.472P0.1800.1830.3030.2980.4380.4060.3420.4355%N0.4070.5260.7010.7271.1191.0311.1821.074BSAN/P2.2612.8742.3132.4392.5542.5393.4562.4684.2.4.3一抗和二抗最佳工作时间的确定按上述确定条件进行实验，将一抗在37℃条件下按不同时间孵育，洗三次后，将稀释好的酶标二抗按10min、20min、40min、60min四个时间段孵育，分析OD450nm测定结果，计算P/N值，确定最佳一抗孵育时间为20min，最佳二抗孵育时间为40min。46 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立表4.3一抗最佳反应时间和二抗最佳反应时间的确定Table4.3Determinationofreactiontimeofprimaryantibodyandtheanti-antibody一抗反应时间10min20min40min60min10min20min40min60min血清二抗反应时间10min10min10min10min20min20min20min20minP0.090.0710.0820.0970.1530.1000.1460.186N0.1950.2030.2730.3120.3130.3360.4200.607P/N2.1662.8593.3293.2162.0453.3602.8763.263一抗反应时间10min20min40min60min10min20min40min60min血清二抗反应时间40min40min40min40min60min60min60min60minP0.1770.1480.2160.2540.1840.2350.3020.359N0.4950.8770.7540.8210.7310.8830.9951.189P/N2.7965.9253.4913.2283.9733.7573.2953.3124.2.4.4二抗最佳稀释度的确定按上述已确定的最佳工作条件进行竞争ELISA检测，一抗孵育后，洗三次，二抗按不同梯度4稀释后，37℃孵育40min。利用统计学方法分析实验结果，当二抗按照1×10倍稀释时，此时N/P值最大，为3.596。表明，此时为最佳工作条件。表4.4二抗最佳稀释度的确定Table4.4Determinationoftheanti-antibodydilution二抗稀释度血清44441×102×104×108×10P0.4010.2400.1620.108N1.4420.7720.4050.238N/P3.5963.2162.5002.2044.2.4.5显色温度与时间的优化结果按上述条件实验进行竞争ELISA测定，最后显色时，分别用室温和37℃，显色时间为5min，10min，15min，20min显色，根据统计学原理分析实验数据，结果表明，37℃显色15min，为最佳底物显色温度时间，此时N/P值可达21.760。47 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立表4.5底物最佳显色条件的确定Table4.5Determinationofthesubstratereactioncondition底物显色条件室温室温室温室温37℃37℃37℃37℃血清5min10min15min25min5min10min15min20minP0.1310.1570.1580.1930.1360.1730.1800.232N0.3430.5370.6090.670.3780.6630.8590.780N/P2.6183.4203.8543.4712.7793.8324.7723.3624.2.5竞争ELISA检测方法临界值的确定用优化的竞争ELISA检测本实验室保存的已知背景的24份PEDV阴性血清样品，对结果进行统计学分析，经计算阴性样本的抑制率平均值（X）=0.224，抑制率标准差（SD）=0.054，因此，阴性血清临界值=X＋2SD=33.2%,阳性血清临界值=X＋3SD=38.6%,介于两者之间为可疑。表4.624份猪阴性血清的ELISA检测结果Table4.6Detectionresultsof24porcinenegativeserumsamples样品数阴性血清抑制率1-80.2900.2970.2450.1620.2420.1690.1930.2599-160.1620.1800.1900.2040.2220.1170.2920.24717-240.2510.2720.2250.3030.2940.2210.1300.202X0.224SD0.0544.2.6竞争ELISA检测方法符合率试验结果用已经建立的竞争ELISA方法对30份阳性样品和20份阴性样品进行检测，经过统计学分析，结果显示30份阳性样品26份血清的抑制率大于38.6%，为阳性，4份抑制率在可疑范围；20份阴性样品检测均为阴性，计算符合率结果为92%。表4.7符合性试验结果Table4.7TheresultsofconformanceofELISAN蛋白竞争ELISA检测结果阳性阴性可疑已知阳性样品（30份）2604已知阴性样品（20份）0200总符合率(%)=〔（26+20）/50〕×100%=92%4.2.7竞争ELISA检测方法重复性试验结果用统计学方法分析同批次的包被抗原酶标板检测结果，经计算得知批内重复试验变异系数在48 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立1.2%~6.5%之间；不同批次的包被抗原酶标板检测结果显示：批间重复试验变异系数在1.8%~7.7%之间，控制在10%以内。表明，该竞争ELISA法重复性良好。表4.8批内重复性试验结果Table4.8Theresultsofintra-assayrepeattestsOD450值重复次数1234567810.4460.5020.3930.4610.7870.9010.8350.73120.5020.4510.4420.4810.8210.8710.8300.69830.4540.4760.4330.4720.7990.8820.8150.726平均值0.4670.4760.4230.4710.8020.8840.8270.718标准差0.0300.0250.0260.0100.0170.0150.0100.018变异系数0.0650.0530.0610.0210.0210.0170.0120.025表4.9批间重复性试验结果Table4.9Theresultsofinter-assayrepeattestsOD450值不同批次1234567810.5900.3450.4910.3900.8890.7760.9110.76520.5880.4000.5110.4110.8710.8110.8820.75230.5350.3610.5220.4210.9020.7980.9240.783平均值0.5710.3690.5080.4070.8870.7950.9050.766标准差0.0310,0280.0150.0160.0150.0170.0210.015变异系数0.0540.0770.0310.0390.0180.0220.0240.0204.3讨论PEDV的实验室检测方法有很多，如病毒分离鉴定、血清中和试验、免疫电镜观察（IEM）、间接血凝试验（IHA）、免疫组织化学技术、免疫荧光、原位杂交法、RT-PCR、ELISA等。但由于大多检测方法或是要求比较高，或是需要特殊仪器设备，不适合大规模临床检测。因此建立实用有效的PEDV抗体检测在PEDV流行病学调查、疫苗效果评价等方面具有重要的意义。1975年，GeorgeKohler等学者发明了杂交瘤技术。这项技术很快被广泛用于免疫学、病毒学等方面的研究中。目前，杂交瘤技术已日渐成熟，但是要制备出高质量的单克隆抗体，不仅要严格无菌操作，避免污染，还应注意控制抗原纯度、接种方式以及细胞状态良好与否等关键环节。本实验一方面将第二章中表达纯化获得的重组N蛋白作为包被抗原，包被酶标板；另一方面将该重组N蛋白，长程免疫BALB/c小鼠，三次免疫后，经间接ELISA检测到小鼠体内抗体水平明显提高。运用杂交瘤技术，取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经四次克隆纯化，成功筛选出一株稳定分泌抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2B8，并制备腹水，经鉴5定，腹水效价在10以上。经纯化后，获得单克隆抗体2B8，经westernblot和IFA试验结果显49 中国农业科学院硕士学位论文第四章抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立示该单克隆抗体可以特异性识别PEDV感染的Vero细胞。该单克隆抗体特异性识别PEDV，且具有良好的反应性，可以应用于IFA实验和westernblot实验。将获得的MAb2B8作为竞争一抗，经过反应条件的优化，建立了检测PEDV抗体的竞争ELISA检测方法，优化后条件为：N蛋白的最佳包被液为碳酸盐包被液，最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭1h，最佳血清稀释度为1:1，血清最佳孵育时间为37℃孵育60min，一抗最适稀释度为1:10,000，最佳孵育时间为20min，二抗最适稀释度为1:10,000，最佳工作时间为40min，最佳显色条件为37℃15min，阴性血清临界值=X＋2SD=33.2%,阳性血清临界值=X＋3SD=38.6%,介于两者之间为可疑。同时对50份已知背景血清进行检测，符合率达92%。接着，利用我们建立的间接竞争ELISA方法对临床采集的血清样本进行检测，发现该抗体检测方法重复性好，符合率高，对比上一章节建立的间接ELISA检测方法，该竞争ELISA检测方法能有效避免假阳性现象。因此，该检测方法可进一步用于大规模PEDV流行病学监测，并为进一步研制PEDV的ELISA抗体检测试剂盒奠定了良好的基础。50 中国农业科学院硕士学位论文参考文献第五章全文结论1.本实验通过分离流行毒株SH6，并将其与经典毒株及流行毒株进行序列比对及遗传进化分析，确定其属于GroupII，基因组大小为28,038bp，从5’端至3’端，编码蛋白的大小依次是6,781aa（poly蛋白），1,386aa（S蛋白），224aa（ORF3蛋白），76aa（E蛋白），226aa（M蛋白）和441aa（N蛋白）。2.本实验通过原核表达成功的获得PEDV重组N蛋白，westernblot检测结果表明N蛋白具有良好的抗原反应性。建立了PEDV抗体间接ELISA检测方法，经测试，该方法具有较高的批间和批内重复性，且符合率较高。3.以纯化的PEDV重组N蛋白免疫BALB/c小鼠，运用杂交瘤技术制备了抗PEDVN蛋白的单克隆抗体，命名为：MAb2B8。IFA检测和western-blot鉴定表明获得的MAb2B8能够与PEDV特异性反应，通过特异性实验表明，该单克隆抗体不与其他猪源病毒反应。4.将获得的MAb2B8作为竞争一抗，进一步建立竞争ELISA抗体检测方法，证实该单抗可以用于PEDV抗体检测的特异性工具。经重复性和符合性实验证明，该方法为PEDV的流行病学调查和分子病原学研究提供新的工具。51 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时间仿若流沙，看似漫长，然不停流逝；想挽留，一伸手，却于指缝悄然溜走。毕业答辩，散伙席筵，举手话别，各奔东西……一切似乎能预想的到，一切又将来的太匆匆。三年前初次踏入上海兽医研究所时，正是初春时节，天气虽乍暖还寒，却已满目绿意。心怀对未知生活的希冀，坚定又惶惶，幸得一帮挚友，相伴悠悠两载。紫竹园中，闲来踱步，恍不知，又是一年春意浓。如今，我已接近硕士生涯路终点，竟有些恍恍惚惚、时光错乱之感。新的路口近在眼前，新的未知将至，虽不知前路，但身后是勇气与力量之源。感恩上海兽医研究所，给我这个平台，收获良师益友。感谢我的导师童光志研究员，是您将我收入童门，为此我心存感恩，满怀骄傲。在实验汇报会议上，您总能深入简出给出最专业的学术指导，让我这个资质平平的学生深刻感受到您这位科研大家渊博的学识和系统的科研思路。开题报告上，您指出我需要多读文献，让我明白，对待科研，不能只埋头拉车，更要抬头看路。您总是很忙碌，只要在所里，总有处理不完的事儿。经常是我们吃完午饭回来，您才草草去食堂。可在这么忙碌的工作后，下班后乒乓球桌前，您那矫健的身姿，流利的身手，帅气的抽球，被同学们私下里奉为男神典范。您真心关心学生，是一位真正值得人爱戴的好导师。遗憾的是，硕士期间没能跟您交流太多，但一日为师终生为父。在我心里，更将您当做父亲敬仰爱戴。感谢单同领老师，感谢您在实验课题上给予我最直接的指导，您一直让我自主自由的做实验，在我状态不佳的时候，给与我充分的自由与谅解。在我因为实验不顺心情低落的时候，不给我思想压力，笑着告诉我，对待实验要不急不躁，不顺十之八九，但重要的是找到原因。在我投文章时，您鼓励我写好文章，勇敢迈出第一步，并对我生涩的语句给予认真的修改。您帮助我一步步走上正轨，在您身上，我更是学到了很多处世哲学。感谢孔宁师兄，你是真正的大智若愚，我从进入实验室开始，跟着你学习了很多实验技能，在我实验困惑慌乱的时候，是你教会我冷静与沉着，并给出最实际的帮助。作为师妹，却没有给你干太多活，反而拖累你许多，大恩不言谢，铭记于心。感谢实验室周艳君老师，李国新老师、郑浩老师，姜一峰老师、童武老师，于海老师，高飞老师给予的关心与帮助；感谢杨莘师兄，谢谢你花美男师兄，在我实验遇到困惑求助你的时候，热心无私的帮助；感谢虞凌雪师姐，永远记得在我刚来时候，你给我第一个微笑的温暖。感谢李丽薇，小薇姐，谢谢你在我写毕业论文最难的时候，给我耐心的指导与不厌其烦的帮助。虽然你总是哈哈的乐观的笑着，可是我知道你内心有多柔软与纤细，你是一个会让人幸福的姑娘，值得任何一个好男人好好疼爱，请相信我的预言，你的幸福会不期而至。感谢实验室刘飞师姐，“大师兄”真性情，简单，直接，萌萌哒；感谢梁超，“狼导”，从觉得你这个女生说话好奇怪，到慢慢的欣赏你的冷幽默，还有感谢你带领“兽医有约剧组”一起谱写的那出精彩的好戏；感谢王鑫，我们是最佳喜剧搭档；感谢田青，实验室不能没有你这个技术文艺男；感谢谢春师妹，春儿，最美主持人，心大的姑娘，记住，爱笑的女孩，食量都不会差；感谢师姐郑旭晨，弯弯月亮眼的漂亮师姐；刘欢师兄，祝你早点找到女朋友；夏天奇，你这个学霸，不要对自己要求那么高，开朗一些，阳光一些，你会收获更多；王康，康神，你要多注意身体，58 中国农业科学院硕士学位论文致谢不要那么拼命；汪秀会，相信自己，付出会有收获的；师妹兼室友孟琼，你是最有女人味的女人；吴永光师弟，实在单纯的孩子，祝你早日达成理想；曲泽慧师弟，你认真弹吉他的样子很像路边手机贴膜的；宫晓倩师妹，实验室的喝水重责交给你了，靠谱的姑娘；阮宝阳师弟，最帅“特工男”；曹艳云师妹，我真的好喜欢你的个性；感谢你们，这一幕幕的场景就像一张张绚烂的剪贴画，串连成一部即将谢幕的电影，播放着我们的快乐和忧伤，记录着我们的青春和国王，也见证着我们的友谊。感谢我的男朋友李旭，谢谢你在我失去亲人最无助的时候，做我坚强的后盾，希望我们这场源自大学的初恋能开花结果，执子之手，与子偕老。感谢我的家人，给我温暖的港湾，我温柔似水的母亲，对不起，我没长成你心目中的小家碧玉，成了个女汉子。我的兄长，虽然你对我很严格，爸爸走的时候，你揽过虚脱的我跟妈妈，颤抖着说，没事没事，从此为我跟妈妈撑起一个新的家。感恩有你们在我身边，我爱你们。青春散场，我们等待下一场开幕。我会用心记住你们每个人的样子，就着星光，回忆这段岁月里出现的容颜，因为那里有我生命中最美好的回忆和永恒的怀念。59 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历潘溪，女，汉族，1989年生于江苏南京。2011年获扬州大学动物医学（实验）专业学士学位；次年，考入中国农业科学院上海兽医研究所，师从童光志研究员，攻读预防兽医学硕士学位，从事猪流行性腹泻病毒方面的学习研究。硕士期间论文发表情况：1.Pan,X.,Kong,N.,Shan,T.,Zheng,H.,Tong,W.,Yang,S.,Li,G.,Zhou,E.,Tong,G.,2015.MonoclonalantibodytoNproteinofporcineepidemicdiarrheavirus.Monoclonalantibodiesinimmunodiagnosisandimmunotherapy34,51-54.2.潘溪，孔宁，单同领，童武，郑浩，李国新，杨莘，童光志。猪流行性腹泻病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备中国动物传染病学报（已接收）专利申请情况：申请号（20141384478.9）抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用。60
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