猪流行性腹泻病毒主要结构基因遗传变异分析及elisa检测方法的建立

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1、密级：无论文编号：82110-2012-03中国兽医药品监察所硕士学位论文猪流行性腹泻病毒主要结构基因遗传变异分析及ELISA检测方法的建立PorcineEpidemicDiarrheaVirusMainStructureGenes'GeneticVariationAnalysisandDevelopmentofELISADiagnosticMethod研究生：蔡青秀指导教师：夏业才研究员申请学位类别：农学硕士学科专业：预防兽医学研宄方向：兽医微生物与免疫学学位授予单位：中国兽医药品监察所2015年5月独创性声明木

2、人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文屮已经注明引用的内容外，本学位论文的研宄成果不包含任何他人创作的、己公幵发表或者没有公开发表的作品的内容，也不包含为获得中国兽医药品监察所或其它教宵机构的学位或证书而使用过的材料。对本论文所涉及的研宄工作做出贡献的其他个人和集体，均己在文屮以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。关于论文使用授权的说明本人完全丫解屮国兽医药品监察所有关保留、使用学位论文的规定，即：屮监所有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借

3、阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国兽医药品监察所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研’允生签名音吋l�H

4、:年士月J曰导师签名：时间：匆/f年5/勾中国兽医药品监察所硕士学位论文摘要摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的一种猪的急性、高度接触性传染病，以腹泻、呕吐、脱水等为主要临床特征特

5、征，给我国养猪业造成了巨大损失。临床上该病与猪传染性胃肠炎、轮状病毒病症状相似，较难进行鉴别诊断。为了探究PEDV的分子流行病学特点并建立有效的诊断方法，本研究主要开展了以下几个方面的工作：1.PEDV主要结构基因的遗传变异分析2013-2014年于北京、河南、陕西、广东、山东5个省市采集的猪流行性腹泻（PED）阳性病料，设计特异性引物对结构基因S、M、N进行克隆及测序，与国内外主要毒株进行比较，分析序列变化和遗传变异情况。序列比对结果显示，1株为弱毒株，其余4个样品株的S基因与国内疫苗株CV777差异较大，突变主

6、要存在于S1区。S基因氨基酸序列存在5个氨基酸的插入5962140163164（QGVNandN）和2个氨基酸的缺失（NI），S1区的2个中和表位（499~638aa和764~771aa）有7处氨基酸突变。M、N基因的核苷酸序列相对保守，只存在部分氨基酸突变。遗传进化分析结果显示，4个样品株与亚洲主要疫苗株（中国疫苗株CV777、韩国弱毒疫苗株DR13以及日本弱毒疫苗株83P-5）同源性较低（93.8%~94.7%），亲缘关系较远；与2007~2009年韩国毒株，2011年日本毒株以及中国近年流行毒株同源性较高（9

7、6.0%~99.6%），亲缘关系密切。2.PEDVBJ-1株M、N、S1融合蛋白的表达和抗原性分析将样品株BJ-1的M、N和S1基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1，转化感受态细胞BL21，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳结果显示M、N、S1重组蛋白获得表达，大小分别为50KDa、80KDa、110KDa，以包涵体表达形式为主。Westernblot分析结果表明3种重组蛋白能被PEDV猪阳性血清特异性识别，具有良好的抗原性，可以作为诊断抗原用于特异性检测PEDV感染。3.PEDVN蛋白间接ELISA抗体

8、检测方法的建立以纯化重组PEDVN蛋白作为包被抗原，优化各项反应条件，初步建立了可以检测PEDV血清中N蛋白抗体的间接ELISA检测方法。本研究中最终优化的反应条件为：N蛋白的最佳包被浓度为0.5g/mL，最佳包被时间为37℃2h后4℃过夜（10~16h），5%脱脂牛奶37℃封闭3h，血清样品最佳稀释度为1:400，37℃作用1h，兔抗猪酶标二抗最佳稀释度为1:40,000，37℃作用1h，抗体临界值为OD450nm0.40判为阳性，OD450nm<0.40判为阴性。试验证明该方法具有较好的敏感性、特异性、重复

9、性和符合率，表明PEDVN蛋白间接ELISA抗体检测方法初步建立，可以用于猪PEDV血清抗体的检测和流行病学调查。综上所述，本研究分析了PEDV样品株结构基因中M、N、S的序列变化和遗传变异情况，为研究PEDV毒株的变异情况提供理论参考；成功表达了M、N、S1重组蛋白，具有良好的反应原性，为建立针对结构蛋白的检测方法奠定基础；用纯化的重组N蛋白，成功建立了P