环介导等温扩增检测阿萨希毛孢子菌的研究和应用

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1、第二军医大学博士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………4英汉缩略对照表…………………………………………………………....7前言………………………………………………………………………....8材料和方法………………………………………………………………..18实验结果…………………………………………………………………..35讨论………………………………………………………………………..51综述………………………………………………………………………..60已发表的英文文章…

2、……………………………………………………..68-2-环介导等温扩增技术在阿萨希毛孢子菌检测中的应用摘要研究背景阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii，T.asahii)广泛存在于自然界中，是一种条件致病真菌，在免疫缺陷、免疫抑制或免疫功能低下宿主能引起导致皮肤或脏器播散性感染，特别是器官移植、艾滋病或肿瘤患者中更易发生。近年来，在免疫功能正常人群阿萨希毛孢子导致的播散性感染的病例也逐渐增多。由阿萨希毛孢子菌引起的播散性毛孢子菌病早期诊断困难，进展非常凶险，疾病的致死率高，通常会累积多个重要脏器，并伴发急性进行性呼吸衰竭，肾衰竭，播散性血管内凝血等症

3、状，预后较差。阿萨希毛孢子菌传统的诊断方法，如组织病理、真菌镜检和培养，耗时长、敏感度低，难以满足临床的需求，越来越多的研究致力于开发取材方便、耗时短、准确客观、免培养的诊断方法，包括抗原检测、影像学检查、原位杂交和PCR诊断，虽然抗原检测、影像学检查已被批准用于侵袭性真菌病的诊断，但在播散性毛孢子菌病的诊断中少有规范和应用。近年来，国内外研究者普遍采用分子生物学技术用于检测毛孢子菌感染，其灵敏度高，周转周期短并可鉴定致病性真菌到种等，有人认为分子生物学技术是诊断真菌感染的金标准。目前国内外实验室常规分子诊断方法主要是传统的PCR技术、实时PCR技术及巢式PCR技

4、术等。伴随着分子生物学的发展，新的核酸扩增技术不断出现。Notomi等于2000年报道了一种新的体外核酸扩增技术，即环介导等温扩增(1oop-mediatedisothermal[12]amplification，LAMP)。该技术能在恒温的条件下，快速、高效、特异的扩增DNA。该技术的原理是针对靶基因的6个特定区域设计4种引物，利用一种链置活性的DNA聚合酶(BstDNApoly-merase)在恒温条件(65℃左右)下催化新链的合成，从而实现核酸的扩增。由于在反应的过程中出现大量的反应副产物焦磷酸根离子，并与镁离子结合生成焦磷酸镁沉淀。对沉淀进行肉眼观察，或者

5、通过浊度仪检测焦磷酸镁白色沉淀的混浊度来判定，也可在反应管中加入荧光染色试剂，在肉眼或者紫外灯下观察，对反应产物进行实时监测。该方法具有高特异性，高效性，快速，简便等特点，目前已被广泛报道应用于细菌，病毒和寄生虫的检测，并取得了理想的效果。随着该方法的普及，近几年，该方法在真菌诊断中的应用亦有报道，但目前尚未有见该法用于毛孢子菌临床检测的报道。本研究应用环介导等温扩增技术，建立了一种新的阿萨希毛孢子菌快速检测方法，具有较高的特异性和敏感性，并能应用于临床标本，具有较高的实际应用价值和科研意义。-1-第二军医大学博士学位论文研究目的：应用环介导等温扩增(1oop-m

6、ediatedisothermalamplification，LAMP)技术特异性检测阿萨希毛孢子菌。比较环介导等温扩增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)与传统PCR法检测阿萨希毛孢子菌的差异。材料与方法针对阿萨希毛孢子菌的IGS1序列而设计的特异性引物，选取15株阿萨希毛孢子作为待测菌株，14株阿萨希毛孢子菌菌株，23株其他临床致病真菌作为阴性对照，对待测真菌中提取DNA进行环介导等温扩增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)反应，之后基于通过肉眼，浊度仪和产物凝

7、胶电泳等三种不同的方式观察扩增结果，验证引物的特异性。通过模板DNA稀释不同浓度进行环介导等温扩增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)反应和传统PCR实验，比较两种检测方法特异性差别。结果：1．应用TA-19引物，14株阿萨希毛孢子菌菌株DNA经环介导等温扩增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)反应后，可见特异性扩增条带和阳性产物显色反应，浊度仪检测可见特征性阳性曲线。其他毛孢子菌菌株和常见临床致病真菌未见阳性反应。2．环介导等温扩增技术和传统的PCR技术检测阿萨希

8、毛孢子菌的