羊种布鲁氏菌外膜蛋白omp31对小胶质细胞的影响及其分子机制研究

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1、分类号：R74单位代码：10752密级：公开学号：201100216宁夏医科大学硕士研究生学位论文羊种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞的影响及其分子机制研究EffectofB.melitensisOmp31ProteintoMicrogliaandItsMolecularMechanism学位申请人：刘爱翠指导教师：王振海教授申请学位门类级别：医学专业名称：神经病学研究方向：中枢神经系统感染所在学院：临床医学院论文完成日期：二〇一五年三月宁夏医科大学研究生院NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sD

2、egreeEffectofB.melitensisOmp31ProteintoMicrogliaandItsMolecularMechanismStudent’sName:LiuAiCuiSupervisor：WangZhenHaiSubjectCategory:MedicalscienceMajor:NeurologySpecialty:CentralnervoussysteminfectionsCollege:ClinicalmedicalcollegeCompletionDate:March.2015宁夏医科大学硕士学位论文中文摘要羊种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小

3、胶质细胞的影响及其分子机制研究摘要目的构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的原核重组质粒pET-30a-omp31，表达并纯化Omp31融合蛋白，通过检测Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞后细胞因子TNF-α、IL-6及HMGB1的分泌情况及TLR4mRNA的表达情况，初步探讨布鲁氏菌外膜蛋白Omp31在引起中枢神经系统损伤中所起的作用及HMGB1/TLR4信号转导通路是否介导参与了中枢神经系统损伤的病理过程，并探讨Omp31融合蛋白对小胶质细胞凋亡的影响。方法从Genbank数据库中获得布鲁氏杆菌外膜蛋白Omp31的全基因序列，设计引物，采用PCR技术扩增出Omp31蛋白的

4、基因序列，通过基因克隆技术构建Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31，表达、纯化布鲁氏杆菌Omp31融合蛋白，并用不同浓度的Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞，同时设置空白对照组，然后用ELISA方法测定促炎细胞因子TNF-α、IL-6及HMGB1的分泌情况；利用流式细胞仪分析其对小胶质细胞凋亡的影响；用RT-qPCR测定TLR4基因水平的转录与表达。多组均数间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。结果经过双酶切及测序验证证明成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31。通过对原核重组质粒pET-30a-omp3

5、1进行蛋白的诱导表达、纯化得到了Omp31融合蛋白，其融合蛋白的分子量为31kDa左右。将不同浓度的Omp31蛋白刺激小胶质细胞，发现该蛋白能诱导小胶质细胞表达和分泌细胞因子TNF-α，IL-6及HMGB1，其中几乎各组TNF-α，IL-6的分泌量均高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，1.0ug/ml组、2.5ug/ml组及5.0ug/ml组引起的HMGB1的分泌量同空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)，其蛋白浓度在2.5ug/ml时TNF-α及HMGB1的表达量最高，蛋白浓度在5.0ug/ml时IL-6的表达量最高，之后随着蛋白浓度的增加细胞因子的分

6、泌量逐渐I宁夏医科大学硕士学位论文中文摘要下降。在小胶质细胞中有TLR4mRNA的表达，其表达量随蛋白浓度不同呈现先增高后降低的趋势，0.5ug/ml组、1.0ug/ml组、2.5ug/ml组及5.0ug/ml组较空白对照组相比均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。经流式细胞学检测发现Omp31融合蛋白能够抑制小胶质细胞的凋亡。结论同空白对照组相比，Omp31融合蛋白刺激组的HMGB1分泌量及TLR4mRNA的表达量明显上升，同时TNF-α、IL-6的表达也明显上调，说明HMGB1/TLR4信号转导通路被激活，该信号转导通路可能介导参与了Omp31蛋白致中枢神经系

7、统损伤的病理过程。同时布鲁氏菌外膜蛋白Omp31也可能对感染的小胶质细胞的凋亡起着抑制作用。关键词布鲁氏菌；Omp31基因；原核表达载体；小胶质细胞；高迁移率族蛋白1；细胞凋亡II宁夏医科大学硕士学位论文英文摘要EffectofB.melitensisOmp31ProteintoMicrogliaandItsMolecularMechanismABSTRACTObjectiveThepurposeofthisstudywastocloneBrucellamelitensisomp31gene,constructitsproka