羊种布鲁氏菌持续性感染巨噬细胞机制研究

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1、分类号：密级：公开学号：2008208009单位代码：10759石河子大学博士学位论文羊种布鲁氏菌持续性感染巨噬细胞机制研究学位申请人郭飞指导教师陈创夫教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向免疫遗传与抗病机理所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2012年5月MolecularMechanismofBrucellaMenlitensisPersisitentSurvivinginMacrophagesADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfo

2、rtheDegreeofDoctorofAgricultureByGuoFei(AnimalGeneticsBreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuMay，2012Shihezi,Xinjiang,China石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签

3、名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一类动物源性人兽共患病，在世界范围内广泛流行，尤其是发展中国家。近几年回升势头迅猛。布鲁氏菌主要毒力表现在能侵入宿主细胞并在其中生存增殖形成持续性感染的能力。布鲁氏菌侵入宿主细胞后逃避与溶酶体融

4、合以及抑制宿主细胞凋亡是其在胞内形成持续性感染的重要原因，目前大量的研究表明自噬与凋亡及溶酶体融合降解途径密切相关，布鲁氏菌激活自噬途径及其相关机制的研究尚不多见。目的：本文以羊种布鲁氏菌参考株16M（以下简称16M）感染巨噬细胞为模型，研究布鲁氏菌感染巨噬细胞后：（1）是否激活巨噬细胞自噬途径。（2）自噬途径的激活对羊种布鲁氏菌胞内生存繁殖的影响。（3）羊种布鲁氏菌激活巨噬细胞的自噬对细胞凋亡的影响。（4）羊种布鲁氏菌激活巨噬细胞自噬对溶酶体与布鲁氏菌融合率的影响.探讨布鲁氏菌感染后激活自噬途径与细胞凋亡之间的关系以及对溶酶体途径的影响，揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制，为

5、布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。方法：（1）通过对自噬泡特异性标记物GFP-LC3阳性点数的统计以及研究自噬最经典的方法电镜技术来监测羊种布鲁氏菌16M（16M）侵染巨噬细胞后细胞自噬活性的变化。(2）16M侵染巨噬细胞后，利用自噬的抑制剂3-MA抑制细胞自噬或利用RNA干扰技术沉默自噬泡形成过程中的必需基因Beclin-l，检测16M胞内CFU；同时用MTT法检测自噬抑制剂3-MA和Beclin-l干扰载体对巨噬细胞活性的影响.（3）用16M侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后，利用自噬抑制剂3-MA干预巨噬细或用RNA干扰技术沉默自噬起始基因Belclin-1后，

6、用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡率，用western-blot检测巨噬细胞自噬被16M激活和被Beclin-1干扰质粒抑制后Caspase-8,9激酶的活性变化以及细胞色素C的水平。（4）用可表达绿色荧光蛋白的质粒pWal-GFP电转化布鲁氏菌,将电转化质粒pWal-GFP的布鲁氏菌侵染溶酶体红色荧光探针Lyso-TrackerRed标记的巨噬细胞,用激光共聚焦显微镜观测布鲁氏菌和溶酶体的共定位区域。结果：（1）与未侵染16M的对照组相比，在16M侵染组中：激光共聚焦显微镜检测到GFP-LC3阳性点数显著增多（p<0.05）；电镜检测到典型的双/多层膜自噬小体结构；western-blot

7、检测显示自噬小体表面微管相关蛋白1的轻链3(LC3-II)的表达量显著提高，LC3-I向LC3-II的转化率在侵染12小时后达到最高水平。（2）在感染16M24h，48h时，自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后与对照组相比侵染组胞内布鲁氏菌数显著降低（P<0.05）；RNA干扰技术沉默自噬泡形成过程中的必需基因Beclin-l后胞内布鲁氏菌数也显著下（p<0.05）。MTTI法检测3-MA和RNA干扰质粒均不影响细胞活性。（3）3-MA