丹参EIL类转录因子EIN3基因的克隆与功能分析

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1、学校代码：10270分类号：Q3学号：152200863硕士学位论文丹参EIL类转录因子EIN3基因的克隆与功能分析学院：生命与环境科学学院专业：遗传学研究方向：药用植物基因工程研究生姓名：王宇指导教师：开国银教授完成日期：2018年5月ADissertationSubmittedtoShanghaiNormalUniversityfortheMaster’sDegreeCloningandFunctionalAnalysisofEILTranscriptionFactorGeneEIN3fromSalv

2、iamiltiorrhizaCandidate:YuWangSupervisor:ProfessorGuoyinKaiSpecialty:GeneticsDepartment:CollegeofLifeandEnvironmentScienceShanghaiNormalUniversityMay2018上海师范大学硕士学位论文摘要摘要丹参是一种多年生草本植物，其根可入药，丹参的主要活性成分包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸，丹参酮属于二萜类，对抗菌消炎、抗肿瘤以及抗氧化有很好的促进作用；而丹酚酸B是目前

3、已知的抗氧化能力最强的天然产物之一；两者均对心脑血管疾病有很好的疗效。应用前景广泛和供求不足的矛盾使其成为代谢工程研究的一个热点。根据AtEIN3在丹参转录组库中本地blast得到一条全长为1797bp的转录因子，命名为SmEIN3。运用基因克隆、进化关系分析、时空表达模式分析、遗传转化及功能验证、调控及互作关系对其功能初步探究，目前取得的结果如下：1、从丹参库里找出一条全长为1797bp的SmEIN3，并将其克隆出来。2、通过系统进化树分析，发现SmEIN3和SiEIN3亲缘关系最相近，其次与SmEIL

4、1、AtEIN3和AtEIL1相近。3、组织表达谱分析表明，SmEIN3基因在叶中表达最高，其次是叶柄，最低的是主根和须根。分别用ABA、GA、SA、MJ、H2O、乙醇、YE、ET等诱导子处理之后，诱导表达谱分析发现SmEIN3响应MJ和SA的诱导。在MJ和SA处理下，基因的表达量均在12h达到最高水平。4、利用瞬时烟草表达系统观察SmEIN3的亚细胞定位。结果显示SmEIN3蛋白定位在细胞核中。这与网站预测以及它作为转录因子的特点是相符合的。5、构建SmEIN3过表达载体和抑制表达载体，转化C58C1农

5、杆菌感受态细胞，侵染丹参外植体，获得稳定遗传的转基因毛转根。基因组PCR鉴定得到11个过表达株系和3个抑制表达株系。qRT-PCR检测丹参酮途径关键酶基因，发现SmDXSII、SmCYP76AH1、SmDXR、SmKSL、SmGGPPS、SmHMGS、SmAACT、SmHMGR、SmCPS在SmEIN3过表达株系中的表达水平上调；在抑制表达株系中的表达水平下调。丹酚酸途径中Sm4CL1、SmCYP98A14、SmHPPR、SmRAS在转基因过表达株系中的表达上调，SmPAL、SmC4H、SmTAT表达下调

6、。而这些基因在抑制表达株系中表达正好与过表达株系相反。6、酵母单杂交实验表明SmEIN3和SmHPPR,SmKSL基因的启动子EBSbox元件结合，Dual-luciferase实验表明SmEIN3能正调控SmDXS2、SmHMGR基因的启动子，并能负调控SmTAT基因的启动子；酵母双杂实验表明SmEIN3与SmJAZ1、SmJAZ2L1和SmMYC2这三者均有相互作用。7、HPLC检测SmEIN3转基因毛状根中丹参酮和丹酚酸的含量，结果显示，与对照相比，过表达SmEIN3提高丹参酮和丹酚酸的含量；SmE

7、IN3抑制表达株系含量则降低。表明过表达SmEIN3基因能促进丹参酮和丹酚酸的积累。1上海师范大学硕士学位论文摘要8、将SmEIN3基因转到模式植物拟南芥中，能够在转基因拟南芥中观察到叶片衰老、不抽薹的表型。过表达SmEIN3能提高丹参中丹参酮和丹酚酸代谢产物的含量，Dual-luciferase实验表明SmEIN3能直接转录激活HMGR、DXSII等关键酶基因的启动子，酵母双杂结果显示SmEIN3与SmMYC2和SmJAZs具有相互作用，暗示乙烯信号通路可能与JA信号通路发生交流，共同调控丹参中次级代谢

8、产物的合成。关键词：丹参酮、丹酚酸、生物合成、转录调控、EIN32上海师范大学硕士学位论文AbstractAbstractSalviamiltiorrhizaisaperennialherbwhoserootscanbeusedasmedicine.ThemainactivecomponentsofS.miltiorrhizaarelipid-solubletanshinoneandwater-solublesalvianol