丹参SmbHLH7转录因子的克隆与功能初探

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1、学校代码：10270学号：152200858硕士学位论文丹参SmbHLH7转录因子的克隆与功能初探学院生命与环境科学学院专业遗传学研究方向药用植物代谢工程姓名曹文治指导教师开国银教授完成日期2018年5月ADissertationSubmittedToShanghaiNormalUniversityForTheMaster’sDegreeThefunctionalstudyofSmbHLH7transcriptionfactorinSalviamiltiorrhizaCandidate:WenzhiCaoSupervisor:ProfessorGuoyinKaiSpecialt

2、y:GeneticsDepartment:CollegeofLifeandEnvironmentScienceShanghaiNormalUniversityMay.2018上师大学位论文摘要摘要丹参（Salviamiltiorrhiza），是唇形科鼠尾草属的多年生直立草本植物，其根和茎均可入药，在治疗心、脑血管疾病方面具有重要疗效。其主要的药用活性成分为脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸。目前，由于传统种植丹参品质下降，导致市场上的丹参酮、丹酚酸供不应求，使得丹参酮、丹酚酸合成通路与代谢工程的研究成为一个热点。茉莉酸（JA）是一类广泛存在于植物体内的植物激素，其已经被证明能够通过

3、调控相关转录因子的表达，诱导植物次生代谢产物的积累，bHLH转录因子示JA信号途径的重要成员之一。本研究首先从本地丹参转录组库中筛选出131条bHLH基因，并根据MJ&YE诱导数据库，选择一条受MJ诱导最为明显的bHLH转录因子，并将其命名为SmbHLH7。随后构建了植物过表达载体，利用农杆菌C58C1介导遗传转化丹参无菌苗获得丹参毛状根，并进行进一步的生化与代谢分析，现阶段取得的成果如下：（1）生物学信息学分析：发现SmbHLH7与芝麻中的MYC2具有较高的同源性，多重序列比对分析表明：SmbHLH7具有一个保守的MYC结构域（N端）和一个HLH结构域（C端）。热图分析表明：

4、在MJ诱导下，SmbHLH7及丹参酮途径关键酶基因SmDXS2,SmAACT,SmCPS1等的响应模式一致性较高。（2）基因克隆：以丹参叶片cDNA为模版，设计引物扩增目的片段，得到一条ORF全长1290bp，共编码429个氨基酸的基因序列。（3）组织表达谱分析：发现SmbHLH7在主根，须根，叶柄中表达量较低，茎中表达较高，在叶中表达最高。这与丹参酮途径关键酶基因SmHMGS、SmHMGR、SmDXR等在组织表达部位上具有一致性。（4）诱导表达谱分析：经不同的外源激素处理后，SmbHLH7的表达水平均有不同程度的上升。经MJ诱导后，SmbHLH7的表达水平从0.5h后开始迅速

5、上升，在2h时其表达量达到最高点，是对照组处理的80倍，不仅如此，SmbHLH7受外源ABA、GA3、ET的诱导效果都很显著，但对SA的诱导响应不明显。（5）转基因毛状根的获得：构建了植物过表达载体pHB-SmbHLH7-YFP，同时通过遗传转化共获得SmbHLH7过表达毛状根株系10个，空载转基因株系11个。（6）关键酶基因表达谱分析：测定了上述株系丹参酮和丹酚酸合成途径中I上师大学位论文摘要的关键酶基因表达水平。发现过表达SmbHLH7，能够明显上调丹参酮合成途径基因SmHMGS、SmGGPPS1、SmCYP76AH1、SmKSL1，同时明显下调丹酚酸合成途径基因SmRAS

6、1,SmCYP98A14,SmTAT1。（7）丹参酮和丹酚酸含量分析：发现SmbHLH7能够上调丹参中丹参酮的含量（15号株系上升最为明显：达到8.89mg/g，而对照组仅为2.17mg/g）；同时抑制丹酚酸的产量。（8）酵母单杂实验：结果表明SmbHLH7可以明显与SmRAS1关键酶启动子互作。（9）Dual-luciferaseassays实验表明SmbHLH7能够直接抑制丹酚酸合成途径基因SmRAS1与SmTAT1的表达。说明其可能直接参与丹参中丹酚酸的生物合成调控，并起到负调控的作用。（10）酵母双杂实验及BiFC实验：酵母双杂及双分子荧光互补实验证明SmbHLH7可以

7、明显与丹参中SmJAZ3L发生互作。综上所述，本论文克隆得到了一条丹参中的bHLH基因：SmbHLH7并阐述了SmbHLH7在丹参酮、丹酚酸及萜类代谢途径中的功能，并初步揭示了其在丹参次生代谢产物合成调控中的作用及其调控机制。这对深入认识丹参酮/丹酚酸的合成调控机理具有重要作用，同时也为对整个丹参酮与丹酚酸合成调控通路的解析提供了一定的实验依据。关键词：丹参，丹参酮，丹酚酸，转录因子，SmbHLH7，代谢工程II上师大学位论文AbstractAbstractSalviamiltiorrhiz