重组bpi蛋白对感染绵羊支原体肺炎的盘羊杂交羊的免疫调节及治疗效果研究

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1、分类号：密级：学号：2012108036单位代码：10759石河子大学硕士学位论文重组BPI蛋白对感染绵羊支原体肺炎的盘羊杂交羊的免疫调节及治疗效果研究学位申请人郭海英指导教师孙延鸣（教授）申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称临床兽医学研究方向动物生殖调控与产科疾病所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月TheimmuneregulationandtherapeuticeffectsofrBPIproteininArgalihybridsheepInfectedwithMycoplasmaovipneum

2、oniaeADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByGuoHai-ying（ClinicVeterinary）DissertationSupervisor:Prof.Yan-mingSunSubmittedtime:Jun,2015ShiheziXinjiangChina本研究受国家自然科学基金资助项目---《BPI在盘羊、巴什拜羊及其杂

3、交后代抗支原体肺炎的作用机理研究》（NO：31160525）资助。ThisresearchissurpportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChinanamedbyThemechanismstudyofBPIonArgali,BashibaisheepandtheirhybridsheepresistingMycoplasmaovipneumoniae.(NO：31160525).摘要目的：本试验以感染绵羊肺炎支原体(MO)的绵羊为疾病模型，使用重组BPI蛋白(rBP

4、I)治疗感染MO的盘羊杂交羊，然后用real-timeQPCR与ELISA的方法，测定BPI和相关细胞因子的含量，用血常规方法检测血液各项生理指标，以研究rBPI对感染MO的盘羊杂交羊的免疫调节效果。方法：（1）绵羊肺炎支原体的人工感染：将冻存的MO菌种进行复壮培养，测定菌液浓度并稀释到6备用浓度10CCU/mL。然后将6只巴什拜羊为A组，12只盘羊杂交羊随机分为B、C组，全部气管内注射绵羊肺炎支原体，每天观察临床症状并测量记录体温。两周后每组随机取3只试验羊的鼻腔分泌物，进行MO的培养与生化鉴定，检测人工感染情况。（

5、2）rBPI对感染MO的盘羊杂交羊的治疗作用：在试验的第4d，C组杂交羊使用纯化的rBPI对其治疗，150mg/只/天，而A组和B组每天注射生理盐水，继续观察临床症状并记录体温。实验结束后将所有羊解剖观察肺脏病理变化，并制作病理切片进行病理评分，对比各组羊的差别。（3）rBPI对感染MO的盘羊杂交羊的内源BPImRNA水平的影响：分别在感染前（0d）、感染后第二天（2d）、感染后五天（5d）、一周（7d）、两周（14d）、三周（21d），采血分离嗜中性粒细胞，用realtime-QPCR方法检测试验羊BPImRNA的相

6、对表达水平。（4）rBPI对感染MO的盘羊杂交羊的免疫调节作用：分别在第0d、1d、5d、7d、14d、21d，采血分离血清，用ELISA方法检测试验羊IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ的含量，比较各组羊细胞因子的表达变化差异。（5）rBPI对感染MO的盘羊杂交羊的血液部分生理指标测定：分别在第0d、7d、14d，采集各组羊的外周血进行血常规检测。结果与结论：（1）鼻腔分泌物用支原体专用培养基培养5d培养液变黄，葡萄糖发酵试验显示培养液由红变黄呈阳性；水解精氨酸试验显示培养液未

7、变色呈阴性；洋地黄皂苷试验显示抑制带>0.3cm为阳性；氯化四氮唑还原实验显示琼脂培养基呈红色；红细胞吸附试验显示菌落表面布满红细胞，溶血试验为β溶血。说明鼻腔分泌物中含有MO，试验羊人工感染成功。（2）A组巴什拜羊在感染后2-3d均表现为食欲减退、体温一过性升高（40-41℃）、呼吸啰音，无死亡病例，剖检后肺表面有轻微出血点；B组杂交羊体温升高（40-41℃）持续较久，有咳嗽、流浆液性鼻涕，甚至严重呼吸啰音及腹泻症状，其中2只死亡，剖检肺表面有不同程度的粉色肉变和肝变，有出血点和出血斑。C组杂交羊起初体温升高、食欲减

8、退、咳嗽症状，剖检肺表面有出血点和出血斑。组织病理学评分结果：A组平均分为9.4，B组平均分19.9，C组平均分为12.8，B组评分显著高于A、C组（P<0.05;P<0.05）。说明杂交羊在治疗后临床症状及肺部炎症减轻。（3）在第7d，C组BPI基因的相对表达水平显著低于A、B组（P<0.05），在第14-21dC组极显著高于B