tgf-β_1smads细胞因子在银屑病皮损中的表达研究

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1從系考轮硕士学位论文TGF-Px/Smads细胞因子在银屑病皮损中的表达研究TheexpressionofTGF-pi/Smadscytokinesintheskinlesionwithpsoriasis作者：柏杨导师：李江涛教授袁国华教授二〇一五年五月 川北医学院硕士研究生学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外’本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体’均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属川北医学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：R期:年t月川北医学院硕士研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权川北医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打H1.保密•，在一年解密后适用本授权书。2.不保密口。作者签名：円期:年炫月円导师签名：‘H期:年>月^！闩 中图分类号R593.2学校代码10634UDC616密级授予单位川北医学院TGF-β1/Smads细胞因子在银屑病皮损中的表达研究TheexpressionofTGF-β1/Smadscytokinesintheskinlesionwithpsoriasis作者柏杨导师李江涛教授袁国华教授培养院系临床医学系授位类别学术学位授位级别硕士学科门类医学学科专业内科学研究方向风湿免疫年级2012级学号201203007二○一五年五月 致谢岁月如梭，三年的时光转瞬即逝。吃水不忘挖井人，在即将毕业之际，怀着感恩之心，我要衷心感谢那些在这三年里指导过、关心过、帮助过我的人。首先我要感谢我的导师宜宾市第一人民医院李江涛教授，一日为师终身为父。感谢这三年里他在学业上和做人上对我的谆谆教导，感谢他的严格要求，帮助我改正的许多缺点，并在这三年的学习生涯中取得了明显进步，师恩终身不忘。感谢我的导师川北医学院附属医院袁国华教授，他严谨的学术作风及对医学事业的热爱是我一生学习的榜样。感谢华西医院风湿免疫科杨南萍教授于华西医院学习期间对我临床上的指导以及为医之道上的教育。感谢川北医学院附属医院风湿免疫科的周京国教授、刘剑平教授、谢传美副教授及医院的其它老师，在临床学习期间对我的指导和培养。感谢川北医学院的老师们为我们打下良好的理论科基础，为以后的进一步发展提供助力。感谢华西科技园移植免疫平台的陆燕蓉教授、陈波博士、刘敬平研究员、杨兰研究员及其它老师和学长们在科研上对我的帮助、指导。感谢华西医院皮肤科王琳教授对本实验临床标本提供的支持。感谢各位评审老师百忙之中抽出时间对我们的论文进行评审并提出保贵的意见。最后，还要谢谢家人及亲朋好友在背后对我默默的支持。 TGF-β1/Smads细胞因子在银屑病皮损中的表达摘要研究目的：探讨TGF-β1/Smads信号通路在银屑病发病机制中的作用，期望能为银屑病治疗提供帮助。研究方法：应用免疫组织化学SP法测定58例银屑病（19例寻常型银屑病、20例脓胞型银屑病、19例红皮型银屑病）皮损组织和10例正常皮肤组织TGF-β1、Smad2/3和Smad7蛋白的表达量，以平均光密度值（IOD/area）表示各蛋白的表达强度，比较银屑病组及各亚组与正常组表达差异，并对各亚组进行相互比较。结果：定位表达示：在正常皮肤组织中，TGF-β1、Smad2/3和Smad7主要在表皮基底层中表达，在表皮棘层及真皮中无表达或低表达；在银屑病皮损中，TGF-β1在真皮乳头层表达明显，在表皮（包括基底层）低表达或无表达。Smad2/3和Smad7在表皮基底层中表达较正常组明显减弱，在表皮棘层及真皮层低表达或无表达。定量表达示：在银屑病组（0.0209±0.0018）及红皮（0.0182±0.0023）、寻常型（0.0254±0.0033）亚组，TGF-β1平均光密度值（IOD/area）较正常组（0.0091±0.0032）轻度上升，P<0.05,有统计学意义，但脓胞型亚组（0.0144±0.0035）与正常组比较无显著差异，银屑病各亚组间TGF-β1表达无显著差异；银屑病组及各亚组Smad2/3(银屑病组0.0003±0.00006、红皮组0.0004±0.00009、寻常组0.0002±0.00004、脓胞组0.0004±0.00016、正常组0.0017±0.00038)和Smad7（银屑病组0.0002±0.00003、红皮组0.0002±0.00007、寻常组0.0001±0.00003、脓胞组0.0002±0.00007、正常组0.0017±0.00057）平均光密度值较正常组有显著下降，P＜0.05，有统计学意义，银屑病各亚组 间表达无显著差异。结论：①TGF-β1的分布异常在银屑病发病中可能扮演重要角色。②TGF-β1/Smads信号通路受损在促进银屑病表皮增殖中发挥了重要作用。③TGF-β1/Smads信号通路受损，可能减弱TGF-β1对炎症反应抑制，从而促进炎症进一步发展。关键词：转化生长因子-β1；Smads；银屑病；免疫组织化学；细胞因子 TheexpressionofTGF-β1/SmadscytokinesintheskinlesionwithpsoriasisAbstractObjective:ToinvestigatetheroleofTGF-β1/Smadspathwayinpathogenesisofpsoriasis,expectingtoprovideacertaindegreeofreferencefortherapyofthisdisease.Method:TheexpressionofTGF-β1，Smad2/3andSmad7in58casesofpsoriasis(psoriasisvulgaris（n=19）,pustularpsoriasis（n=20）,erythrodermicpsoriasis（n=19）)andnormalskin（n=10）wasdeterminedusingimmunohistochemistrySPassay,andthentocompareamongthegroups.Results:Innormalskintissue,theexpressionofTGF-β1，Smad2/3andSmad7waslocatedinthebasallayerofepidermis,butweakorabsentexpressedinthestratumspinosumofepidermisandthepapillarylayerofdermis.Inpsoriaticlesion,theexpressionofTGF-β1waslocatedinthepapillarylayerofdermis,butweakorabsentexpressedinepidermis.TheexpressionofSmad2/3andSmad7wassignificantlyreducedinthebasallayerofepidermis,andremainweakorabsentexpressedinthestratumspinosumofepidermisandthepapillarylayerofdermis.Quantitativeanalysis:Comparedwiththenormalgroups（0.0091±0.0032）,TheexpressionofTGF-β1inthepsoriasisgroups（0.0209±0.0018）,erythrodermicgroups（0.0182±0.0023）andvulgarisgroups（0.0254±0.0033）wasslightup-regulation(P<0.05),butnostatisticaldifferencetopustulosagroups（0.0144±0.0035）,andnosignificantdifferenceamongthethreetypesofpsoriasiswasdetected.TheexpressionofSmad2/3(psoriasisgroups0.0003±0.00006,erythrodermicgroups(0.0004±0.00009),vulgarisgroups (0.0002±0.00004),pustulosagroups(0.0004±0.00016),normalgroups(0.0017±0.00038)andSmad7(psoriasisgroups0.0002±0.00003,erythrodermicgroups(0.0002±0.00007),vulgarisgroups(0.0001±0.00003),pustulosagroups(0.0002±0.00007)andnormalgroups(0.0017±0.00057）wassignificantlydown-regulatedinpsoriaticlesion,butnosignificantdifferenceamongthethreetypesofpsoriasiswasdetected.Conclusion:①TheabnormaldistributionofTGF-β1mayinvolvedinthepathogenesisofpsoriasis.②ThedamagedofTGF-β1/Smadspathwaymayplayanimportantroleintheproliferateofepidermisinpsoriatic.③ThedamagedofTGF-β1/smadspathwaymayrecedethefunctionofTGF-β1forinhibitingshininflammatory,therebypromotethedevelopofinflammatory.Keywords:Transforminggrowthfactor-betal(TGF-β1);Smads,Psoriasis;Immunohistochemistry;Cytokine 目录前言........................................................1材料与方法..................................................3结果及分析..................................................8讨论.......................................................15结论.......................................................21参考文献...................................................23综述：TGF-β1与银屑病.......................................28参考文献...................................................37附录.......................................................41个人简历...................................................42原创性声明及版权使用授权说明...............................43 川北医学院硕士学位论文前言银屑病是一种免疫介导的慢性、复发性、炎症性疾病。典型的临床表现为鳞屑性红斑或斑块，局限或广泛分布，上覆厚层银白色鳞屑，成层状，像蜡滴（滴蜡现象）；刮去鳞屑可见淡红色发光半透明膜（薄膜现象）；剥去薄膜可见点状出血点。它属于系统性疾病，除皮肤表现外，20%-30%的患者伴有关节损害，罹患代谢综合症和心血管疾病的风险增加。而且，银屑病患者较健康人群更容易的出现焦虑、抑郁情绪等负面[1]情绪，影响生活质量。目前的治疗虽然有效，但不能达到长期缓解。银屑病的患病率在欧美国家是1%-3%，我国约为0.123%，发病年龄范围差异很大，平均发病年龄约27岁，男女比例无明显差异。根据临床特征银屑病分为寻常型、红皮型、斑块型、关节炎型四种类型，其中寻常型最常见，占到银屑病总数的90%以上。银屑病的发病机制目前还不完全清楚，目前认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。银屑病有遗传背景，约20%的银屑病患者有家庭史，若父母均为银屑病患者，其子女银屑病发病率达50%，若父母一方为银屑病患者，其子女发病率约16%，同卵及异卵双胞胎之间的发病一到致性研究也支持遗传因素对银屑病发病的影响。通过全基因组关联研究已确定有PSORS1-9、IL-12B、IL-23R、LCE/3B/3C/3D、ZNF313、ERAP1、[2]TNFAIP3等易感基因位点。在环境因素中，感染、精神紧张、应激事件、妊娠、吸烟、饮酒及某些药物均可能促发或加重银屑病。银屑病皮损组织病理学表现可见淋巴细胞、单核细胞浸润明显，尤其是T淋巴细胞和树突状细胞在表皮或真皮浸润为银屑病重要的病理特征。表明免疫[3]系统参与该病的发生和发展，已经发现有多种细胞因子参与其中，包括1 川北医学院硕士学位论文转化生长因子-β1（TGF-β1）、表皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素（IL-6、IL-23）等等。TGF-β1是一种多功能细胞因子，在细胞增殖及分化、胚胎发育、细胞凋亡、炎症反应等多种细胞活动中发挥有重要作用。在银屑病中有异常表达。酶联免疫吸附测定（ELISA法）：TGF-β1在银屑病患者血液中的[4,5][6]浓度升高，并且与疾病活动度相关联；YuH等用实时荧光定量PCR测定发现：与正常组相比，银屑病患者皮损中TGF-β1的mRNA表达无显著差异，但其受体TβRⅠ及其下游细胞因子Smad2、4、6、7的mRNA[7]表达下调；虞海燕等也用实时荧光定量PCR测定：TGF-β1受体TβRⅠ、TβRⅡ及Smad2、4、6、7mRNA表达都明显低于正常组，在未受累皮肤[8]中的表达与正常组无显著差别；ZaherH等用ELISA法测定：银屑病患[9]者组织水平升高，但无显著性差异；马小玲等用免疫组织化学法测得：[10]TGF-β1及其受体在银屑病表皮基底层表达下调；翟慧娟等用免疫组织化学法测得：银屑病皮损处Smad3、4表达下调，Smad7表达上调。虽然目前我们已经认识到TGF-β1及Smads细胞因子在多种免疫性疾病（包括银屑病）的发生、发展中发挥重要作用，但对其认识还不够全面、深入。本实验应用免疫组织化学SP法测定TGF-β1、Smad2/3、smad7在银屑病及正常皮肤组织中表达，不仅包括表皮，也包括真皮在内，并进一步将银屑病分为寻常型、红皮型、脓胞型三个亚组进行研究。经过数据分析，提出假设，为下一步研究提供方向，并期望能够为银屑病的治疗提供一定的理论基础。2 川北医学院硕士学位论文1材料与方法1.1材料1.1.1标本来源四川大学华西医院和宜宾市第一人民医院病理科保存的石蜡标本58个，其中红皮型银屑病19个，寻常型银屑病19个，脓胞型银屑病20个，正常皮肤组织10个。保存完好，无污染及破损。1.1.2对象选择选择2006年至2013年在四川大学华西医院和宜宾市第一人民医院确诊为银屑病患者58例，患者一般资料详见表1，正常皮肤组织10例。研究对象选择标准如下：①银屑病组所有患者均有典型或较为典型的皮损，并经病理检查证实符合银屑病的组织病理改变，排除其它皮肤病。近3个月内未接受过糖皮质激素、免疫抑制剂生物制剂治疗，停止其他系统治疗和光疗法至少1个月，近3周内皮损未进行过局部治疗。不伴有明显肝、肾功能异常及可能影响研究结果的重大疾病。分组依据：见表2。②正常组标本来自我院骨科手术时修剪的残余的正常皮肤组织，手术患者无系统性疾病及皮肤病。要求活检皮肤为四肢新鲜正常皮肤组织，包括表皮、真皮和皮下组织，大小为0.5cm×1.0cm，局部无感染、出血、溃疡、肿瘤、坏死等，且为不易经常被摩擦部位，年龄、性别不限。所有标本均经10％中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋后制成蜡块备用。3 川北医学院硕士学位论文表1正常皮肤组织和银屑病各亚组临床资料（x±s）性别年龄(岁)病程（年）例数组别(n)男/女范围中位数x±sR中位数x±s正常皮肤组106/428～5537.640.5±7.5///银屑病组5835/2318～5842.341.9±7.61～125.25.3±2.8红皮型亚组1913/633～5843.143.7±6.91～125.95.9±2.7寻常型亚组1910/925～5541.842.4±7.41～115.25.3±2.8脓胞型亚组2012/818～5739.639.8±8.91～104.74.8±2.9表2银屑病分类及诊断依据银屑病类型临床表现病理表现寻常型银屑病初起为红色丘疹或斑丘疹，迅速发展角化过度伴角化不全，角化不全区可见为边界清楚的红色斑块，典型表现有munro微脓肿，颗粒层明显减少或消失，蜡滴现象、薄膜现象、点状出血，可棘层增厚、表皮突整齐向下延伸，乳头层发生在全身各处，常对称。上方棘层变薄，毛细血管扩张并迂曲，周围可见淋巴细胞、中性粒细胞浸润。红皮型银屑病全身皮肤弥漫性潮红，浸润肿胀并伴真皮浅层血管扩张充血更明显，余同寻常有大量糠状鳞屑，之间可有片状正常型。皮肤（皮岛），伴全身症状。脓胞型银屑病在寻常型皮损或正常皮肤上迅速出可见kogoj微脓肿，余同寻常型。现针尖至粟粒大小、淡黄或黄白、浅在性无菌小脓胞，密集分布，可融合，可迅速扩展，常伴全身症状，也可皮损局限于手掌或足趾，常对称分布。关节型银屑病伴有关节病变，皮疹同寻常型。同寻常型。4 川北医学院硕士学位论文1.1.3主要试剂一抗：TGF-β1小鼠抗人IgG1单克隆抗体（货号sc-130348）、Smad2/3小鼠抗人lgG2a单克隆抗体(货号SC-133098)、Smad7小鼠抗人lgG2a单克隆抗体(货号SC-101152)(美国圣克鲁斯生物技术公司)SP试剂盒：包括3%H202去离子水3ml、封闭用正常山羊血清工作液3ml、生物素化二抗工作液（山羊抗小鼠lgG）3ml、辣根酶标记链霉卵白素工作液3ml（货号SP9000）（北京中杉金桥生物技术有限）DAB显色试剂盒；显色剂A：DAB×20倍浓缩液3ml、显色剂B：H2O2×20倍浓缩液3ml、显色剂C：TBS×20倍浓缩缓冲液3ml（货号：AR1022）（武汉博士德生物技术有限公司）抗原修复液：pH6.0柠檬酸盐缓冲液（货号ZLI-9065）（北京中杉金桥生物技术有限）PBS溶液：A液称取71.6gNa2HPO4·12H2O，溶于1000ml双蒸水B液称取31.2gNaH2PO4·2H2O，溶于1000ml双蒸水取81mlA液+19mlB液+17g氯化钠+1900ml双蒸水即可制得PH7.4的PBS缓冲溶液其它试剂：二甲苯、不同浓度梯度乙醇1.1.4主要实验仪器免疫组化实验台北京成威公司.中德合资通用烘箱宾德.德国5 川北医学院硕士学位论文OLYMPUSBX51生物显微镜奥林巴斯.日本恒温水浴赛默飞世尔科技.美国移液器艾本德.德国冰箱海尔.中国1.2实验方法1.2.1实验步骤实验采用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）链酶亲和素一生物素法(SP法，Streptavidinperoxidase)检测银屑病组及正常组皮肤组织中TGF-β1、Smad2/3、Smad7的表达量。免疫组织化学方法是利用抗原与抗体特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。其操作步骤如下：（1）常规脱蜡、水化：二甲苯10min×2、无水乙醇10min×2、95%乙醇5min×1、90%乙醇5min×1、80%乙醇5min×1、70%乙醇5min×1、60%乙醇5min×1、双蒸水5min×2；（2）阻断内源性过氧化物酶活性；3％H202室温孵育10min,PBS洗5min×2次；（3）高温隔热水浴抗原修复；置于PH6.0柠檬酸盐修复液中，92℃以上，持续40min；自然冷却约40min；PBS5mim×3次；（4）封闭细胞Fc受体：封闭用正常山羊血清工作液封闭切片，置室温下孵育15min，倾去多余血清(不洗)；（5）滴加一抗(1：150小鼠抗人IgG型)，冰箱4℃过夜孵育；（6）室温下复温20min,PBS液洗5min×3次；（7）滴加二抗：滴加生物素标记的IgG型山羊抗小鼠抗体，37℃孵育30min，PBS洗5min×2次；6 川北医学院硕士学位论文（8）滴加三抗：滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS液洗5min×2次；（9）DAB显色：1ml蒸馏水加显色剂Ａ、B、C各１滴，混匀，加至标本上。镜下观察适时终止(显色时间约3min左右)；（10）常规苏木素复染、2％盐酸酒精分化、氨水返蓝；（11）脱水、透明：60%乙醇5min×1、70%乙醇5min×1、80%乙醇5min×1、90%乙醇5min×1、95%乙醇5min×1、无水乙醇10min×2、二甲苯10min×2；（12）中性树胶封片。1.2.2检测及定量阴性对照为正常皮肤组织，空白对照用PBS代替一抗，其它操作完全相同。定量方法：所有组织切片均由两位有经验的病理医师在普通光镜下双盲法读片，观察判断细胞因子TGF-β1、smad2/3、smad7在银屑病皮损和正常皮肤切片组织上的表达定位。采用OLYMPUSBX51显微镜进行拍摄，DPController和DPmanager图像软件采集和保存图像，Image-proplus6图象分析软件进行光密度值及染色面积测定。随机选取每张切片5个视野(10×40倍)测定阳性细胞的累积光密度值(IOD)及面积(area)，计算出平均光密度（IOD/area）值，再取其平均值表示各细胞因子的相对含量，其值越大表示抗原含量越高。1.2.3统计学处理数据使用SPSS19.0统计软件分析。当资料服从正态分布或总体方差齐时，采用t检验或方差分析；当资料不服从正态分布或总体方差不齐时采用t’检验。显著性检验水平a=0.05，当P＜0.05时，差异有统计学意义。7 川北医学院硕士学位论文2结果及分析2.1基线比较正常皮肤组和银屑病各亚组在性别、年龄、病程的基线稳定，具有可比性（P＜0.05）。2.2TGF-β1/Smads在皮肤组织上的定位表达分布在正常皮肤组织中，TGF-β1、Smad2/3和Smad7主要在表皮基底细胞中表达，在表皮棘层细胞及真皮中通常无表达或较低表达。在银屑病组皮损组织中，可见表皮层明显增厚，真皮毛细血管增生等。在增厚的表皮细胞（包括表皮基底层）中TGF-β1Smad2/3和Smad7通常是无表达或较低表达；在真皮层中，TGF-β1在真皮乳头层有明显表达；而Smad2/3、Smad7无表达或较低表达。在空白对照组中TGF-β1、Smad2/3和Smad7在表皮、真皮区均未见表达，见图2、4、6。2.3TGF-β1/Smads在皮肤组织上的定量表达比较TGF-β1在银屑病组表达量较正常皮肤组仅轻度上调，银屑病组及红皮型、寻常型亚组的平均光密度均值高于正常对照组，t’检验（P<0.05）,有统计学意义，脓胞型银屑病组平均光密度均值也高于正常对照组，但统计学差异，三亚组组间无显著差异，见表3。Smad2/3在银屑病组表达量较正常皮肤组显著下调，银屑病组及各亚组平均光密度均值均明显低于正常组(P<0.05)，有统计学意义，各银屑病亚组间表达量无显著差异，见表4。Smad7在银屑病组及各亚组的表达量较正常皮肤组显著下调(P<0.05),有统计学意义，各银屑病亚组间比较无显著差异。见表5。8 川北医学院硕士学位论文表3TGF-β1在各组皮肤组织中的表达（x±s）平均光密度值与正常皮肤比较亚组组间比较分组例数(n)（IOD/area）t/t’值P值t/t’值P值正常皮肤组100.0091±0.00323.1870.018银屑病组580.0209±0.0018红皮型亚组190.0182±0.00232.3030.0181.8150.085a寻常型亚组200.0254±0.00333.5390.0110.2320.523b脓胞型亚组190.0192±0.00352.1140.0661.3030.084ca:红皮型亚组与寻常型亚组比较；b:红皮型亚组与脓胞型亚组比较；c:寻常型亚组与脓胞型亚组比较图1TGF-β1在各组皮肤组织中的表达（柱形图）Fig1ThescatterdiagramoftheexpressionofTGF-β1inlesionsofpatientswithpsoriasisandnormalcontrols9 川北医学院硕士学位论文图2TGF-β1（1:150）在银屑病组及正常对照组皮肤组织的表达(SP400)Fig．2TheexpressionofTGF-β1(1:150)inlesionsofpatientswithpsoriasisandnormalcontrols(SP×400)A:寻常型银屑病皮损组织B:红皮型银屑病皮损组织C:脓胞型银屑病皮损组织D:正常皮肤组织E:空白对照组（PBS代替一抗）10 川北医学院硕士学位论文表4Smad2/3在各组皮肤组织中的表达（x±s）平均光密度值与正常皮肤比较亚组组间比较分组例数(n)（IOD/area）t/t’值P值t/t’值P值正常皮肤组100.0017±0.000386.474<0.001银屑病组580.0003±0.00006红皮型亚组190.0004±0.000094.582<0.0011.4190.164a寻常型亚组200.0002±0.000045.510<0.0010.4120.683b脓胞型亚组190.0004±0.000163.7030.0011.3350.190ca:红皮型亚组与寻常型亚组比较；b:红皮型亚组与脓胞型亚组比较；c:寻常型亚组与脓胞型亚组比较图3Smad2/3在各组皮肤组织中的表达Fig3ThescatterdiagramoftheexpressionofSmad2/3inlesionsofpatientswithpsoriasisandnormalcontrols11 川北医学院硕士学位论文图4Smad2/3（1:150）在银屑病组及正常对照组皮肤组织的表达(SP400)Fig．4TheexpressionofSmad2/3(1:150)inlesionsofpatientswithpsoriasisandnormalcontrols(SP×400)A:寻常型银屑病皮损组织B:红皮型银屑病皮损组织C:脓胞型银屑病皮损组织D:正常皮肤组织E:空白对照组（PBS代替一抗）12 川北医学院硕士学位论文表5Smad7在各组皮肤组织中的表达（x±s）平均光密度值与正常皮肤比较亚组组间比较分组例数(n)（IOD/area）t/t’值P值t/t’值P值正常皮肤组100.0017±0.000576.497<0.001银屑病组580.0002±0.00003红皮型亚组190.0002±0.000073.7700.0010.8630.394a寻常型亚组200.0001±0.000034.017<0.0010.2880.775b脓胞型亚组190.0002±0.000073.6920.0011.2050.236ca:红皮型亚组与寻常型亚组比较；b:红皮型亚组与脓胞型亚组比较；c:寻常型亚组与脓胞型亚组比较图5Smad7在各组皮肤组织中的表达Fig5ThescatterdiagramoftheexpressionofSmad7inlesionsofpatientswithpsoriasisandnormalcontrols13 川北医学院硕士学位论文图6Smad7（1:150）在银屑病组及正常对照组皮肤组织的表达(SP400)Fig．6TheexpressionofSmad7(1:150)inlesionsofpatientswithpsoriasisandnormalcontrols(SP×400)A:寻常型银屑病皮损组织B:红皮型银屑病皮损组织C:脓胞型银屑病皮损组织D:正常皮肤组织E:空白对照组（PBS代替一抗）14 川北医学院硕士学位论文3讨论3.1TGF-β超家族TGF-β超家族是一类广泛存在于多个组织，具有广泛调节功能的细胞因子，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡、血管增生等多种生命活动。包括TGF-β、活化素（activins）/抑制素（inhibins）、骨形成蛋白[11](BMPs)、生长分化因子(GDFs)等。TGF-β1/Smads信号通路为其重要的信号传导方式。哺乳类动物中TGF-β有三个亚型（TGF-β1、TGF-β2、[12]TGF-β3），它们功能结构相似，其氨基酸序列约有64%-82%的同源性。3.2TGF-β1相关信号通路[13]在大多数组织（包括皮肤）中TGF-β1为主要存在形式。Smads也分为三个亚型：（1）受体活化型（R-Smad），Smad2/3、Smad1/5/8；（2）通用介导型（Co-Smad），即（Smad4）；（3）抑制型（I-smad），Smad6、Smad7。TGF-β1首先在细胞外与其受体TGF-βR结合，先后激活其受体TGF-βRⅡ、TGF-βRⅠ，TGF-βRⅠ再使细胞内的Smad2/3磷酸化，从而被激活，活化的Smad2/3可与Smad4形成复合体，再进入到细[14]胞核内，参与调节相关靶基因转录。TGF-β1/Smads信号通路中，Smad2/3是TGF-β1的下游信号因子，协助完成TGF-β1信号传导，Smad4是Smad2/3进出细胞核的“桥梁”，而Smad7则能竞争性的抑制Smad2/3结合Smad4进入细胞核，并可通过Smad泛化素调节因子（Smurf1、[15]Smurf2）诱导TGF-β1受体的降解，发挥负向调节功能。它们共同维持TGF-β1/Smads信号通路的动态平衡，这条信号通路被称为典型通路。另外，BMP及其受体能激活细胞内的细胞因子Smad1/5/8，Smad1/5/815 川北医学院硕士学位论文再与Smad4结合，进入细胞核，将生物信号传入核内，而Smad6能抑制[11]BMP/Smads信号通路。除上述通路外，还存在丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路途径、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路、核因子-κB（NF-κB）信号通路等多种不依赖Smads蛋白的TGF-β1[11]信号通路，它们也能参与多种生命活动。各信号通路并非完全独立，[16]而是存在着交叉连接，3.3TGF-β1与自身免疫性疾病TGF-β1在体内分布广泛，能通过自分泌、旁分泌及内分泌形式到[17]达靶组织，发挥生物学效应。并与多种自身免疫性疾病的发生、发展有重要联系。3.3.1TGF-β1/Smads与硬皮病（scleroderma）硬皮病是一种就皮肤变硬和增厚为主要特征的结缔组织病，硬变皮肤活检见网状真皮致密[18]胶原纤维增多，皮肤变薄、表皮突消失、皮肤附属器萎缩。Giacomlli[19]R等用ELISA法测定发现，硬皮病组和正常组，血清TGF-β1浓度无显[20]著性差异；李江涛等应用免疫组织化学SP法测定33例硬皮病及10例正常人皮肤组织中TGF-β1/Smads表达发现：硬皮病皮肤组织中TGF-β1、Smad2/3、Smad4表达量显著高于正常皮肤对照组（P<0.05），有统计学差异；Smad7表达量低于正常对照(P>0.05)，但无统计上无显著差异，TGF-β1/Smads表达量与病情的分类、分期无显著相关性。除抑制硬皮[21]病表皮细胞增殖作用外，ChoJW等发现，TGF-β1的存在使硬皮病患者皮肤中纤维母细胞较正常皮肤纤维母细胞生长更用迅速，并能促进Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达和纤维母细胞功能。故其在硬皮病的发病过程中发挥有重要作用。16 川北医学院硕士学位论文3.3.2TGF-β1与系统性红斑狼疮（SystemicLupusErythematosus.SLE）SLE是一种以多系统损害的特征的自身免疫性疾病，可出现蝶形红斑、盘状红斑、红斑结节、冻疮样皮疹等皮肤受累表现。Guarnizo-Zuccardi[22]P等应用序列特异引物聚合酶链反应法（SSP-PCR）测定细胞因子基因多态性与SLE相关性提示：TGF-β1基因可能是SLE易感基因。[23]ManolovaI等测定了53例SLE患者及66例正常人的血TGF-β1浓度，发[24]现SLE患者血TGF-β1较健康正常人显著降低。XingQ等将42例新发SLE患者与22例正常人比较发现，SLE患者有血TGF-β1水平下降、尿中[25]TGF-β1水平增高。JinT等分析认为：TGF-β1水平和SLE疾病活跃度及器官损害有一定关联性。目前认为TGF-β1可能通过对T细胞功能的调[26,27]节在SLE发病机制中发挥作用。3.3.3TGF-β1与类风湿关节炎（rheumatoidarthritis.RA）荟萃分析提示：TGF-β1TT基因型（T869C）是RA风险相关基因，CC基因组或C等[28]位基因是保护性基因。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性[29]（PCR-RFLP）检测提示：TGF-β1多态性与关节炎破坏进展相关。[30]NiuQ等用流式细胞术及ELISA法检测RA患者外周血发现，调节T细胞数量减少，血TGF-β1水平下降，另外，RA滑膜液中，TGF-β1表达增强，小鼠关节腔内注射TGF-β1，可导致滑膜肿胀、炎症浸润及滑膜增厚等，他们认为TGF-β1通过破坏Th17/Treg的平衡参与RA的发病机制。[31]3.3.4TGF-β1与其它免疫性疾病ShimizuJ等检测了TGF-β1在白塞病患者中的表达：定量RT-PCR法测定：TGF-β1受体mRNA表达增强，免疫荧光法测得定：皮肤CD4+T细胞浸润处TGF-β1表达明显增强。在[32]炎症性肌病患者肌肉组织中也检测到TGF-β1表达强于正常对照组。17 川北医学院硕士学位论文TGF-β1在多种免疫性疾病中表达异常，其机制还需进一步探索。3.4TGF-β1刺激IL-23/Th17轴关于银屑病的发病机制，目前认为IL-23/Th17轴在其发病机制中起[33,34]着至关重要的作用，IL-23能通过TNF-α，IL-20R2和IL-22调节表皮增生、棘层增厚、过度不全角化及正型角化过度；Th17细胞自原始T细胞分化而来，能依次产生前炎症细胞因子IL-17A,IL-17F,IL-22andIL-26，刺激角质细胞使其异常增生，并进一步产生前炎症细胞因子、趋化因子、抗菌肽，刺激炎症区的其它免疫细胞，促使炎症进一步发展，除参与炎症反应，Th17细胞也在血管生成过程中扮演重要角色。IL-23是Th17细胞的上游刺激物，有促进Th17细胞的发育及维持其功能的作用。一组相关的全基因组研究也支持IL-23参与银屑病的发病机制[35]。TGF-β1是IL23/Th17轴中的重要介质，其作用是促进IL-23受体表达，以及促进Th17细胞的分化。同时，TGF-β1还能促进IL-6、IL-1β等炎症[36,37]介质的表达。3.5TGF-β1/Smads促进炎症反应动物实验中，角蛋白5-转化生长因子-β1(K5-TGF-β1)转基因小鼠能使人TGF-β1在小鼠表皮中表达增强，观察到其皮肤出现了明显的炎症反应，但内部器官却受到保护；而TGF-β1基因敲除小鼠，皮肤没有炎症反应，而其它器官出现炎症反应。说明其在不同的条件下，TGF-β1可能表现出促炎或抑制炎症的作用。其机制还不完全清楚，有种解释认为：可能在IL-6存在的条件下，TGF-β1促进Th17细胞的聚集并产生多种炎症因子，加重炎症反应，在IL-6缺乏的条件下，TGF-β1促进原始T细胞产生Foxp3+调节T细胞，然后抑制效应T细胞的活化与增殖，减18 川北医学院硕士学位论文[38,39]轻炎症。银屑病病理改变中真皮层有明显的炎症细胞浸润。而本实验中，观察到TGF-β1在真皮中聚集高于正常皮肤组。动物实验也表[13]明皮肤中TGF-β1表达增强可诱发明显的炎症反应。然后本实验中我们发现在银屑病皮损中TGF-β1的下游细胞因子Smad2/3、Smad7表达明显减弱，提示TGF-β1可能通过非Smad信号通路发挥了促炎症作用，如[37]核因子-κB（NF-κB）信号通路。另外，TGF-β1在炎症早期具有免疫[40]刺激功能，但在炎症中后期具有免疫抑制活性。而Smads蛋白在银屑病皮肤炎症中的作用可能是：当炎症反应链条启动并已出现明显炎症反应时，Smad2/3表达的减弱，导致TGF-β1在炎症中后期抑制炎症的作[41]用缺失，从而促进炎症进一步发挥。TGF-β1/Smads信号通路在银屑病炎症反应中的作用机制还有待进一步深入研究。3.6TGF-β1/Smads促进表皮增殖表皮基底层细胞具有较强的增殖能力，增殖的细胞可进一步发生分化，替代凋亡的细胞，完成细胞的新老更替。本实验中，TGF-β1及Smads在银屑病表皮基底层细胞中表达明显下降，提示TGF-β1/Smads信号通路具有抑制基底细胞增殖的作用，此结论与细胞体外培养实验[42]中TGF-β1具有抑制表皮增殖的作用相符。但在动物实验中，表皮角质形成细胞中高表达TGF-β1的小鼠动物模型(K5-TGF-β1)，其皮损处[43]病理上表现出表皮增生及其它一些类似银屑病的病理表现。此现象与体外实验中TGF-β1抑制细胞增殖的功能相矛盾。目前的研究认为这可能是皮损处炎症反应中的其它细胞因子（如TNF-α、IL-22、IL-23、[44-46]IL-6等）发挥了促进表皮细胞增殖的作用，并且其强度超过了TGF-β1对表皮增殖的抑制作用，导致虽然表皮中TGF-β1表达增强，但19 川北医学院硕士学位论文病理上仍表现为表皮增生。用肿瘤坏死因子拮抗剂K5-TGF-β1转基因小[13]鼠进行治疗，当炎症控制后，小鼠表皮增殖减轻，一定程度上支持了TGF-β1通过刺激产生其它炎症因子间接发挥了促进表皮增殖作用的[43]推测。3.7TGF-β1分布异常与银屑病另外，本实验还观察到，TGF-β1在银屑病皮损中除表达量上调外，还伴有分布异常。与正常组相比TGF-β1的表达在表皮基底层明显减弱，而在真皮乳头层明显增强。过去的实验数据显示：银屑病皮损中TGF-β1的受体及下游细胞因子Smad2/3、抑制因子Smad7的mRNA表达均下降[6,7]。本实验中，其表皮中Smad2/3、Smad7蛋白表达量也明显下降，与mRNA的表达改变相符。基底层细胞中具有协同和拮抗作用的细胞因子Smad2/3、Smad7表达均明显下调。提示Smad2/3表达下降并非抑制因子Smad7表达增强所致，可能是某此因素导致其上游因子TGF-β1减少，然后使Smad2/3表达下调，并进一步引起抑制因子Smad7表达下调。加之皮损中TGF-β1mRNA的表达变化不大，故推测：表皮基底层细胞中的TGF-β1大量以旁分泌形式进入真皮层参与炎症反应，导致表皮中TGF-β1及其下游细胞因子表达下降。同时，因表皮基底层中TGF-β1大量进入真皮层，可以反射性引起TGF-β1在基底层细胞中代偿性分泌增多，故银屑病皮损中总TGF-β1表达量有轻度上调。但此推断还需进一[41]步验证。既往也有文献报道Smad7在银屑病皮损中表达也有所上调，与本实验结果不一致，可能是实验条件和标本选择不同所造成的，以后可增大样本量及改用可靠性更好的实验方法进一步验证。若上述假设得到进一步实验的证实，则能为药物开发提供另一种思路。开发一20 川北医学院硕士学位论文种能抑制TGF-β1从基底层细胞进入周围组织并有一定的抗炎作用的药物，或许能在银屑病的治疗上取得比TGF-β1拮抗剂或激动剂更好的疗效。故进一步深入研究TGF-β1在银屑病发病机制中的作用对治疗银屑病有重要指导意义。同时银屑病的发病多种细胞因子共同参与调控的结果。所以以某个细胞因子为靶点的转基因小鼠模型（如K5-TGF-β1、K5-STAT3、K14-AREG等）虽都有类似银屑病的皮肤表现，但却都不[47]能达到很令人满意的程度。只有进一步弄清TGF-β1与其它细胞因子协同作用机制，才能对银屑病有更全面的认识，对提高银屑病的诊治水平有更多帮助。3.8不足与展望本实验还存在一些不足之前，可以进一步改进。未来可以增加样本数量，并在此基础上依据病情较重及处于病程早期或晚期再进行分组，了解TGF-β1/Smads信号通路与银屑病疾病活跃度及分期的关系。还可用TGF-β1拮抗剂（CTA-192）处理K5-TGF-β1转基因小鼠，观察其皮损改变。将来还可进一步测定，如IL-6、p38、JNK、MAPK等细胞因子再银屑病皮损中的表达。以及进一步追踪TGF-β1/Smads信号通路进入细胞核后能调控哪些与银屑病相关基因的转录等。4结论1、TGF-β1/Smads信号通路可能在银屑病表皮增殖过程中发挥重要作用，其作用与银屑病类型无关。TGF-β1/Smads信号通路在表皮基底层表达减弱，使其抑制表皮增殖作用减弱，同时真皮中TGF-β1表达增强，促进多种炎症因子表达，也间接促进了表达增殖，两者共同导致21 川北医学院硕士学位论文的银屑病表皮异常增生。2、TGF-β1/Smads信号通路表达减弱，可能使TGF-β1在炎症中后期抑制炎症反应的作用减弱，从而促进炎症进一步发病，其作用与银屑病类型无关。3、TGF-β1在银屑病皮损区分布异常在银屑病发病机制中可能扮演重要角色，并与银屑病类型无关。22 川北医学院硕士学位论文参考文献[1]KorkoliakouP,ChristodoulouC,KourisA,etal.Alexithymia,anxietyanddepressioninpatientswithpsoriasis:acase-controlstudy[J].AnnGenPsychiatry,2014,13(1):38-43.[2]ChandraA,RayA,SenapatiS,etal.Geneticandepigeneticbasisofpsoriasispathogenesis[J].MolImmunol,2015,64(2):313-323.[3]CoimbraS,FigueiredoA,CastroE,etal.Therolesofcellsandcytokinesinthepathogenesisofpsoriasis[J].IntJDermatol,2012,51(4):389-395;quiz395-398.[4]NockowskiP,SzepietowskiJC,ZiarkiewiczM,etal.Serumconcentrationsoftransforminggrowthfactorbeta1inpatientswithpsoriasisvulgaris[J].ActaDermatovenerolCroat,2004,12(1):2-6.[5]MekiAR,Al-ShobailiH.Serumvascularendothelialgrowthfactor,transforminggrowthfactorbeta1,andnitricoxidelevelsinpatientswithpsoriasisvulgaris:theircorrelationtodiseaseseverity[J].JClinLabAnal,2014,28(6):496-501.[6]YuH,MrowietzU,SeifertO.DownregulationofSMAD2,4and6mRNAandTGFbetareceptorImRNAinlesionalandnon-lesionalpsoriaticskin[J].ActaDermVenereol,2009,89(4):351-356.[7]虞海燕,MrowietzU.银屑病患者皮损中转化生长因子β受体及SMADsmRNA的低表达[J].中华皮肤科杂志,2004,37(3):159-161.[8]ZaherH,ShakerOG,EL-KomyMH,etal.Serumandtissueexpressionoftransforminggrowthfactorbeta1inpsoriasis[J].JEurAcadDermatolVenereol,2009,23(4):406-409.[9]DoiH,ShibataMA,KiyokaneK,etal.DownregulationofTGFbetaisoformsandtheirreceptorscontributestokeratinocytehyperproliferationinpsoriasisvulgaris[J].JDermatolSci,2003,33(1):7-16.[10]翟慧娟,杨廷桐,李秀杰.Smad基因异常表达在银屑病发病机制中的临床意义[J].空军总医院学报,2010,26(1):42-44+47+63.[11]PardaliE,GoumansMJ,tenDP.SignalingbymembersoftheTGF-betafamilyin23 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川北医学院硕士学位论文综述：TGF-β1与银屑病柏杨综述李江涛袁国华审校摘要：银屑病是一种自身免疫介导的的慢性、炎症性疾病，多种细胞因子（包括表皮生长因子、转化生长因子-β、肿瘤坏死因子-α等）参与其发病。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种多功能细胞因子，在促进银屑病表皮增殖、血管增生及加重炎症反应的过程中起着重要作用。本文对TGF-β1在银屑病中的作用作一简要综述。关键词：转化生长因子-β1；银屑病；发病机制TGF-β1inpsoriasisAbstract:Psoriasisisaimmune-mediatedchronicinflame-matorydisease,avarietyofcytokines(includingepidermalgrowthfactor,transforminggrowthfactor-β,tumornecrosisfactor-α,etc)involvedinthepathogenesisofpsoriasis.Transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)isamultifunctionalcytokine,whichplaysanimportantroleinpromotingthehistopathologicchangesofepidermalproliferation、inflammatorycellinfiltrationandangio-genesisinpsoriasis,Inthispaper,theroleofTGF-β1inpsoriasisisreviewed.Keywords:TGF-β1;psoriasis;pathogenesis1.前言银屑病是一种自身免疫介导的的慢性、炎症性疾病。典型的临床表现为鳞屑性红斑或斑块，表面覆有银白色鳞屑，鳞屑下可见淡红色发光半透明膜，剥去薄膜可见点状出血点，皮肤局限或广泛分布，除皮肤损28 川北医学院硕士学位论文害外，还可出现关节炎及消化系统损害，并增加心血管疾病发病风险。银屑病发病年龄差异很大，平均发病年龄约27岁，男女比例无明显差异，根据临床表现分为寻常型、红皮型、斑块型、关节炎型四种类型，其中以寻常型最常见，占到银屑病的90%以上。银屑病组织病理学表现为表皮增生、血管扩张及增殖及多种炎症细胞浸润，尤其是T淋巴细胞和树突状细胞在表皮或真皮浸润为重要特征。其发病是遗传因素和环境因素共同作用的结果，感染、应激事件、妊娠、吸烟、饮酒及某些药物均可能促发或加重病情，已经证实有PSORS1-9、IL-12B、IL-23R等多个易感[1]基因位点。发病机制目前还不完全清楚，已经发现有多种细胞因子参与[2]疾病的发生、发展，包括转化生长因子-β（TGF-β）、表皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6（IL-6）、白介素-23（IL-23）等等。此文主要探讨细胞因子TGF-β1与银屑病的关系。2.TGF-β1与TGF-β超家族TGF-β是TGF-β超家族的重要成员，除TGF-β外，TGF-β超家族还包括活化素（activins）/抑制素（inhibins）、骨形成蛋白(BMPs)、生长分[3]化因子(GDFs)等细胞因子，并在多种疾病的发病机制中扮演关键角色。TGF-β包括三个亚型（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3），分别定位于染色体[4]19q13、1q41、14q24,其氨基酸序列约有64%-82%的同源性。在人类绝[5][6]大多数组织（包括皮肤）中，TGF-β1为主要存在形式，且活性最强，它是由2条分子量为11kD的亚单位通过二硫键连接而成分子量为25kD[4]的多肽。在体内分布广泛，能以内分泌、旁分泌、自分泌的形式到达各[7]靶组织，参与调节多种生命活动，包括细胞增殖、细胞分化、胚胎发育、细胞凋亡等。29 川北医学院硕士学位论文3.TGF-β1信号通路3.1TGF-β1/Smads信号通路[1]银屑病是一种有遗传背景的免疫性疾病，受多基因调控。TGF-β1能通过其下游细胞因子将生物信号传达至细胞核内，影响基因表达。其中为TGF-β1/Smads信号通路是最重要信号传导途径。Smads分为三个亚型：（1）受体活化型（R-Smad），包括TGF-β受体活化型（Smad2、Smad3）和BMP受体活化型（Smad1、Smad5、Smad8）；（2）通用介导型（Co-Smad），[4]即（Smad4）；（3）抑制型（I-Smad），包括（Smad6、Smad7）。TGF-β2首先在细胞外与其受体结合，其受体（TβRⅡ、TβRⅠ）先后被激活，然后Tβ2RⅠ使细胞内Smad2/3的C端2个丝氨酸残基磷酸化，激活Smad2/3，活化的Smad2/3再与Smad4结合成杂聚肽复合物，进入细胞[8]核调节基因转录，通过与其它转录因子配合能调节上百个目标基因的表[9]达，随后Smad2/3可通过脱磷酸化回到细胞质中，进入下一个核质穿[10]梭循环，Smad7则能够竞争性的抑制Smad2/3与Smad4结合进入细胞内的过程，并能与Smad泛素化调节因子（Smurf1、Smurf2）协同促进[11]TGF-β1Ⅰ型受体（Tβ2RⅠ）降解，从而阻碍TGF-β1信号向下转达，起负向调节作用。另外，BMP受体能激活细胞内的Smad1/5/8,，活化的Smad1/5/8也可与Smad4结合进入细胞核，将信号传递到核内，Smad6[12]对BMP/Smads信号通路起负向调节作用。3.2非Smads依赖信号通路除上述信号通路外，TGF-β1还存在p38/JNKMAPK通路、PI3K/AKT通路，Erk-MAPK通路等多种信号传导途径，这些信号通路不依赖细胞因子Smads，也称为非Smads依赖信号通路，它们也参与多种生命活动，30 川北医学院硕士学位论文[12]对下游细胞因子可起到促进或抑制作用。Smads信号通路与非Smads[3]信号通路并非完全独立，相互之间及与其它信号通道间能相互影响，例如，TβRⅠ不仅能激活Smad2/3,还能激活PI3K、p38、JNK、ERK等多种[12]细胞因子。而干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、IL-1β能通过刺激Smad7从[13,14]而对TGF-β1/Smads信号通路产生抑制作用。非Smads信号通路还能调控部分与银屑病相关细胞因子的表达。例如：p38/JNKMAPK及PI3K/[15]AKT信号通路参与VEGF表达的调控，PI3K/AKT信号通路既能调控炎症因子IL-22的表达，也能与ERK一同调控自身刺激因子IL-15在银[16,17]屑病中的表达。这些非Smads下游因子在R-Smad不依赖Co-Smad[18]进入细胞核的过程可能也有着重要作用。4.TGF-β1在银屑病中的异常表达TGF-β1在肿瘤及自身免疫性疾病中常有异常表达。在银屑病患者中，其血TGF-β1水平较正常人有所升高，并且与疾病活动度相关，可作为辅[19,20]助判断病情活动的指标之一。实时荧光定量PCR发现：与正常健康组对照，银屑病患者皮损中TGF-β1mRNA表达无显著差异，但其受体TβRⅠ及TβRⅡ及其下游细胞因子Smad2、Smad4、Smad6、Smad7mRNA[21,22]表达均下调，而免疫组化实验中，TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ及Smad2/3[23,24]在银屑病皮损组织表皮中的表达较正常对照也有所下调，提示TGF-β1表达异常在银屑病的发生、发展有密切相关性。5.TGF-β1与银屑病动物模型为进一步了解TGF-β1表达水平在银屑病发病机制中的因果关系，利用转基因技术获得角蛋白5-转化生长因子-β1(K5-TGF-β1)转基因小鼠模型，使人TGF-β1在转基因小鼠表皮中表达增强。然后观察到小鼠皮肤出31 川北医学院硕士学位论文现了类似人类银屑病的组织病理学改变，包括表皮增生、炎症细胞浸润、[25]新生血管形成等。参照人银屑病，以生物制剂、紫外线A治疗后，小[5,26]鼠皮肤炎症明显减轻。在另一种转基因小鼠中，观察到小鼠皮肤炎症[5]的严重程度与TGF-β1表达强弱有明显对应关系。另一方面，由于朗格汉期细胞的发育及活化需要TGF-β1，故TGF-β1基因敲除小鼠缺少朗格汉[27]斯细胞，不出现皮肤炎症性改变。这些都提示TGF-β1表达异常在银屑病的发病中起重要作用。除K5-TGF-β1小鼠模型外，利用转基因技术控制整合素、VEGF、IL-1R等细胞因子在小鼠表皮的表达，得到的多种模拟银屑病的动物模型，都能出现一定程度类似人类银屑病的病理改变，[28]但都不能达到很令人满意的程度。这些提示TGF-β1及其信号通路在银屑病发病机制中虽然有很重要作用，但并不是独一无二的。6.IL23/Th17轴近年来的研究认为IL23/Th17轴在银屑病的发病机制中起着至关重[27,29]要的作用。IL-23是一种异质二聚体，其在银屑病皮损中表达增强，能通过TNF-α，IL-20R2、IL-6和IL-22等调节表皮增生、棘层增厚、过度不全角化及正型角化过度，Th17细胞自原始T细胞分化而来，能依次产生促炎症细胞因子IL-17A,IL-17F,IL-22andIL-26，刺激角质细胞使其异常增生，并进一步产生促炎症细胞因子、趋化因子、抗菌肽，刺激炎症区的其它免疫细胞，促使炎症进一步发展，在银屑病的发病中起着至关重要的作用。IL-23是Th细胞的上游刺激物，有促进Th细胞的发育及维持其功能的作用，一组相关的全基因组研究也支持IL-23在银屑病机制[30]中的重要作用。TGF-β1是IL23/Th17轴中重要的介质，它不仅促进IL-23受体表达，而且和IL-6是原始T细胞在转化成Th17细胞过程发挥重要32 川北医学院硕士学位论文作用。另外，TGF-β1还能增加IL-1β分泌，进而促进Th17细胞的分化、[31]增殖。7.TGF-β1与银屑病病理表现7.1TGF-β1与炎症反应TGF-β1最初被认为是一种抗炎因子。动物实验显示，一方面，TGF-β1不足和其信号通路受损的小鼠多个器官出现炎症细胞浸润，但皮肤没有出现炎症浸润；另一方面，K5-TGF-β1转基因小鼠虽然表皮过度表达TGF-β1出现明显炎症细胞浸润，但内脏器官却因系统中TGF-β1水平升高而受到保护，说明TGF-β1对炎症反应有促进和抑制双重作用。有一种解释认为：在IL-6存在的条件下，TGF-β1促进Th17细胞的聚集，Th17细胞能产生多种炎症因子，加重炎症反应，在IL-6缺乏的条件下，TGF-β1促进原始T细胞产生Foxp3+调节T细胞，然后抑制CD4+和CD8+效应T细胞的活[27,32]化与增殖，减轻银屑病症状。除了促进IL-23/Th17轴表达，TGF-β1还能通过调控一种在银屑病皮肤中表达增强的小RNA分子（MiR-31）触[1][33]发炎症反应链。Kallimanis,P.G等发现在用TNF-α受体拮抗剂治疗银屑病时，随着病情好转，TGF-β1表达水平也下调，提示TGF-β1与TNF-α可能相互影响。过去的研究显示：在炎症早期TGF-β1具有免疫刺激功能，[34]可聚集炎症细胞；但在炎症中后期具有免疫抑制活性。在银屑病炎症早期，TGF-β1可通过促进IL-23/Th17轴表达与多种炎症介质一起发挥促炎作用，在炎症中后期，TGF-β1下游细胞因子表达减弱使其抑制炎症作用[24]下降，也促进了炎症进一步发展。7.2TGF-β1与表皮增殖对于不同类型的细胞，TGF-β1可表现对细胞增殖的促进或者抑制作33 川北医学院硕士学位论文[35]用，在大多细胞中，其表现为抑制细胞增殖。其中，TGF-β1对纤维细胞、成骨细胞或其它间叶组织等间质起源的细胞表现为生长刺激作用，对上皮或神经外胚层来源的细胞则起生长抑制作用，通过对细胞周期素(cyclin)、细胞周期素激酶(cdk)等相关因子的调控，使细胞停滞在G1期[4]是其抑制细胞生长的重要机制。细胞周期从G1晚期过度到S期而需要激活cyclinD/cdk4、6和cyclinE/cdk2复合物，TGF-β1能激活cdk抑制剂2115）（P和P)的转录和抑制其生长促进因子（cMYC和Id1-3）的转录，从[36]而使细胞停滞在G1期。体外细胞培养提示：TGF-β1具有抑制表皮细[37]胞增殖的作用。但动物实验中，K5-TGF-β1转基因小鼠高表达人TGF-β1导致表皮增生，与TGF-β1在人银屑病表皮中表达下调不一致，也与体外培养中TGF-β1具有抑制表皮细胞增殖的作用相矛盾。原因可能是TGF-β1高表达诱发了明显的炎症反应，炎症反应过程中刺激产生了多种炎症介质，这些炎症介质发挥了促进表皮细胞增殖作用，即TGF-β1通过促进其[27]它炎症介质的表达间接促进了表皮增殖，并且其促表皮增殖的强度超[1]过了TGF-β1表达增强对表皮增殖的抑制作用。在另一组实验中，用肿瘤坏死因子拮抗剂对K5-TGF-β1转基因小鼠进行治疗，当炎症控制后，小鼠表皮增殖减轻，一定程度上支持了炎症反应刺激了表皮增殖的推测。故TGF-β1在银屑病患者表皮增殖中的作用有：①表皮中TGF-β1表达下调，使其抑制表皮增殖作用减弱；②真皮层中的TGF-β1促进多种炎症因子的表达，如IL-1β、IL-6、IL-23、IL-22等，这些细胞因子能刺激表皮[29]增殖。7.3TGF-β1与血管增生及损伤TGF-β1在血管增生中的机制较为复杂。实验中发现，TGF-β1既能诱34 川北医学院硕士学位论文导血管生成，也能通过调节VEGF表达，激活VEGF受体Ⅱ，诱导血管[38][49]内皮细胞凋亡。另外，在基因敲除的小鼠中，会出现血管生成障碍。在多种肿瘤性疾病中也观察到：TGF-β1抑制剂可能刺激肿瘤血管成生，也可能抑制肿瘤血管生成。有研究显示：激活Smad2具有抑制肿瘤血管生成的作用，而激活Smad3却能促进肿瘤血管生成。这些都表明：TGF-β1对肿瘤的血管增生有双重调节作用，不同条件下，激活不同的TGF-β的[3]下游信号因子，发挥刺激或抑制血管生成。而银屑病中其主要发挥了促血管的作用，其详细机制还需进一步研究。银屑病患者还伴有心血管风[40]险增高，但研究发现TGF-β1对血管损伤具有保护性作用，在动物实验[41]中，也未观察到TGF-β1高表达对动脉粥样硬化有明显影响。8.总结与展望银屑病的发病机制十分复杂，疾病受多个基因组调控，诱发因素多种多样，且有大量细胞因子参与。TGF-β1既通过Smads等细胞因子将生物信息传递到细胞核内，影响基因层面的表达，又作为一种炎症介质在组织层面，介导银屑病皮肤炎症，还通过血液系统到达各个器官，产生全身性影响。部分银屑病患者出现破坏性关节炎症及心血管损害，血液中TGF-β1浓度升高到底扮演怎么样的角色还有等进一步研究。在疾病的发生、发展过程中，TGF-β1能激活多种下游因子，通过多种信号通路直接或间接调控细胞的增殖、迁移及炎症反应等，并与表皮生长因子、肿瘤坏死因子等共同影响疾病的进程。银屑病发病机制的复杂性给临床治疗带来了不小的挑战。目前治疗虽然有效，但还不能根治，且伴有一定遗传风险。疾病不仅给患者造成身体上的痛苦，还带来巨大的心理创伤及经济压力。而激素及免疫剂等35 川北医学院硕士学位论文治疗药物长期使用也伴随着一系列副作用。近年来，生物制剂在自身免疫性疾病（包括银屑病）中的应用得到了进一步推广，以肿瘤坏死因子-α受体（TNF-α）拮抗剂使用最多，包括依那西普、阿达木单抗等，且取得了很好的疗效。但仍有部分病人对TNF-α受体拮抗剂治疗反应欠佳，或因对药物中的一些成分过敏，或因伴有病毒性的肝炎、结核病、肿瘤性疾病，不宜使用TNF-α受体拮抗剂治疗。开发其它类型的生物制剂就成为一种必要，目前已开发出多种针对不同靶点的生物制剂，如托珠单抗（IL-6）、阿那白滞素（IL-1）等。将TGF-β1作为靶点也是一种选择。另一方面，生物制剂对银屑病的治疗虽然疗效好，但其价格过于昂贵，限制了其广泛使用，而且其仍然不能达到根治目的。需要继续寻找一种能让病情持续缓解，且价格相对低廉的治疗方法，这就要求对银屑病的发病机制有更深入的了解，要对病程中各细胞因子的信号传导通路有一个统筹的认识，这还需要基因组学、蛋白组学技术及分析方法上也取得进展。离为银屑病患者彻底解决病痛，我们还有很长的路要走。36 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川北医学院硕士学位论文附录英文缩写表英文缩写英文词汇中文词汇TGF-βtransforminggrowthfactor-beta转化生长因子-βBMPbonemorphogeneticprotein骨形成蛋白ILInterleukin白介素TNF-αTumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αVEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应mRNAMessengerRibonucleicAcid信使核糖核酸SPStreptavidinperoxidase链酶亲和素-生物素JNKJunN-terminalkinaseJun氨基端激酶PI3Kphosphoinositide3-kinase磷脂酰肌醇-3-羟激酶SLESystemicLupusErythematosus系统性红斑狼疮Th17Thelpercell辅助性T细胞AREGAberdeenRenewableEnergyGroup表皮层双向调节因子STAT3signaltransducerandactivatoroftranscription3信号转导及转录活化因子MAPKMitogen-activatedproteinkinase丝裂原激活蛋白激酶NF-κBnuclearfactor-κB核因子-κB41 川北医学院硕士学位论文个人简历姓名柏杨性别男出生年月1987、11籍贯四川达州民族汉政治面貌预备党员学历硕士研究生外语水平六级培养方式联合培养学院临床医学院专业内科（风湿免疫）个迄止时间学习或工作单位职务人2006.09-2009.7成都医学院学生简历2009.9-2012.6达州市中心医院轮转医师2012.9-至今川北医学院学生科研情TGF-β1/Smads信号通路在银屑病皮损中的表达研究况社会多次参与社会义诊活动实参加过风湿免疫专业每年全国年会、四川省年会及其它多个学践术活动情况42