利用酪蛋白激酶ⅰδ磷酸化修饰半乳糖凝集素-3

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1、硕士学位论文tionofGalectin>3byCasein指导教师:台桂花教授•级T科：生物学_.芬愈免科:生物化学与分子生物学研究方向：糖生物学'.>、分位类型：学术硕士独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：円期:乂/('〇/厂/又学位论文使用授权书本学位论文作

2、者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：、临巧指导教师签名：km)円期：r2^y1〇ti7>日期：>学位论文作者毕业后去向：工作单位：________________________________电话:通讯地址：___

3、_____________________________邮编:摘要半乳糖凝集素-3（Galectin-3）是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型蛋白，其分子量约为31kDa。作为一种肿瘤相关蛋白，Galectin-3在肿瘤细胞中高表达，与细胞生长、粘附、凋亡以及血管生成、炎症反应、免疫调节、肿瘤发生和转移等密切相关。酪蛋白激酶I（CaseinKinaseI）是丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶，共有7个亚型（α，β，γ1，γ2，γ3，ε，δ），分子量为22到55kDa，等电点大于9。多分布于真核细胞中的细胞核、细胞质和

4、纺锤体中。CaseinKinaseI有重要的生理功能，它参与很多生理生化过程，如生命节律、细胞信号转导、DNA修复和DNA翻译等。文献报道，Galectin-3能被CaseinKinaseIδ磷酸化，细胞内30%Galectin-3以磷酸化的形式存在，但磷酸化的Galectin-3的功能却不清楚。为此，本论文作为研究磷酸化Galectin-3功能的前期工作，探索了CaseinKinaseIδ磷酸化Galectin-3的生化反应条件，检测方法以及磷酸化位点，为大量制备磷酸化的Galectin-3和深入研究其功能

5、奠定基础。具体研究内容和成果如下：首先，构建CaseinKinaseIδ表达载体，并表达纯化CaseinKinaseIδ蛋白。主要过程包括：从人结肠癌细胞HCT-116中提取细胞总RNA，经过反转录获得cDNA。根据NCBIGeneBank收录的CaseinKinaseIδ序列设计引物，以cDNA为模板，扩增出CaseinKinaseIδ的目的基因序列。经过测序结果比对，确认目的基因序列正确。对目的基因与载体进行酶切、连接、转化，构建了pET28aCaseinKinaseIδ表达质粒。用Ni-NTA亲和柱提取

6、和纯化目的蛋白。经过SDS-PAGE检测，获得的目的蛋白为CaseinKinaseIδ蛋白。然后，建立两种检测CaseinKinaseIδ催化Galectin-3磷酸化的方法。通过HPLC对Galectin-3磷酸化反应体系中ATP消耗情况进行检测，我们发现CaseinKinaseIδ能够将Galectin-3磷酸化，反应消耗了ATP；通过Native-PAGE与Westernblot对Galectin-3磷酸化反应产物进行检测，我们发现在磷酸化反应后有被Galectin-3特异性抗体所识别的磷酸化条带产生。

7、基于以上实验结果，我们认为这两种检测方法都可以用来检测由CaseinKinaseIδ催化的Galectin-3磷酸化反应。此外，我们对磷酸化反应条件进行了优化。当固定底物Galectin-3的量为25μg，ATP为200μM时，优化得到了反应条件，即CaseinKinaseIδ的量为0.375μg，反应温度为20oC，反应时间为10min。最后，对Galectin-3的磷酸化位点进行探究。考虑到CaseinKinaseIδ为丝氨酸选择性蛋白激酶，我们设计引物将Galectin-3的丝氨酸（6位、12位、96位

8、和188位）定点突变为丙氨酸。经电泳验证、测序比对，我们得到了仅有目标位点发生突变的4种突变体质粒。之后，我们诱导突变体蛋白表达，并用Lactose-SepharoseCL6B凝胶柱对突变体蛋白进行分离纯化。通过对比突变型与野生型Galectin-3的磷酸化反应情况，我们发现当6位的丝氨酸发生突变时，磷酸化条带消失，磷酸化反应不能发生。据此我们得出III结论：由CaseinKinaseIδ催化的Ga