浅议iux标记毒死蜱降解菌β菌株和土壤中定殖动态研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文Iux标记毒死蜱降解菌β菌株和土壤中定殖动态研究姓名：王昀璐申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：花日茂20100601摘要0IIIIIlllI[IIIIllIIIIY1735216本实验从农药生产废水的污泥中驯化、分离出一株能够稳定降解毒死蜱的菌株B菌株，通过菌落的形态特征和菌株16SrRNA分析，将该菌株鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)。采用电转化法将含发光酶基因luxAB的质粒pTRl02导入毒死蜱降解菌B菌株，将转化子Lux．13分别释放到不同处理的土壤中考察存活能力和对毒死蜱的降解

2、效应，为进一步构建高效稳定的基因工程菌提供参数。实验结果如下。1．经分离和定向筛选，获得3株具有降解毒死蜱能力的菌株，在相同的接菌量下，当毒死蜱浓度为lOmg·L。1时，72h的降解率分别为9．3％、17．7％、10．1％；96h对毒死蜱的降解率分别为15．7％、30．5％、14．O％。选择降解率最高的B菌株作为进一步研究对象，在毒死蜱浓度为10mg·L-1，5mL降解体系中添加19／L蛋白胨，500laL菌液时，能够取得较好的降解效果，在48h，72h和96h的降解率分别为19．95％、34．54％和44．52％。通过菌落的形态特征和菌株16SrRNA分析将B菌株鉴定为

3、微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)。2．以培养3．5h左右，达到对数早期(OD600=0．5)的菌液制备感受态细胞，质粒浓度16．5lag·mL"1，电压2．5kV，电击时间3ms时的转化率最高，可达2．73x102个转化子／陷质粒DNA。转化子Lux．13分别在抗牛素平板和LB平板中传代lO次，仍具有发光活性和对Km的抗性，说明质粒pTRl02在转化子中可以稳定遗传。3．分别测定了转化子Lux．B和B茵的最优生长条件、生长曲线和对毒死蜱的降解率。Lux．B的最优生长条件为pH=6．8，温度30*(2，而B菌株在pH=7．5，

4、温度35℃时生长最快；二者的生长趋势没有差异，0．3h为延滞期，3．12h为对数生长期，之后进入稳定期和衰亡期；将培养了12h的转化子Lux．13和B菌液取出，当毒死蜱浓度为10mg·Ld时，Lux．B在48h、72h、96h对毒死蜱的降解率分别为46．91％、59．9％、83．29％，而B菌在48h、72h、96h对毒死蜱的降解率分别为30．89％、25．36％、40．32％，转化子对毒死蜱的降解能力比出发菌株提高了近一倍。4．设置了未灭菌土+毒死蜱20mg·kgJ+Lm【．B，灭菌土+毒死蜱20mg．kg。1+￡，m【．B，未灭菌土+Lux．13，灭菌土+Lux—B，

5、未灭菌土+毒死蜱20nag·kg～，灭菌土+毒死蜱20mg·kg_6个处理，考察了转化子Lux．B在土壤中的竞争能力和毒死蜱的降解能力。结果表明，Lux．B在土壤中的数量变化规律是先上升后下降，但是在灭菌土壤中的下降趋势较为缓慢，数量比较稳定，在未灭菌土壤中下降的趋势较快这说明土著微生物对外来微生物的生存影响较大，并且在加毒死蜱的处理组中Lux．B数量多于不加毒死蜱的处理组数量，说明Lux．B能够以毒死蜱为营养物质生存；未灭菌土+毒死蜱20mg·k91+Lux．B处理组中毒死蜱降解速率最快，其次是灭菌土+毒死蜱20mg·kg～+Lux．B，再次是未灭菌土+毒死蜱20mg．

6、k茁1，灭菌土+毒死蜱20mg·k91组降解最慢，说明微生物对毒死蜱的降解起着重要作用，并且Lux．B对毒死蜱的降解作用强于土壤中的土著微生物，二者可以产生协同作用共同降解毒死蜱。关键词：毒死蜱，微生物降解，B菌，Lux—B，发光酶基因，土壤定殖ⅡAbstractInthisstudy,astablechlorpyrifos-degradingstrain13wasscreenedandisolatedfromsludgeofpesticideproductionwastewater,whichwasidentified髂Stenotrophomonasacidamini

7、philathroughmorphologicalcharacteristicsand16SrRNAanalysis．PlasmidpTRl02thatcontainedluxABgeneswasintroducedintochlorpyrifos—degradingstrain13byelectroporation．TransformantsLux—Bwerereleasedtodifferenttreatmentsofsoilinordertoinvestigatesurvivalconditionanddegradati