猪流行性腹泻病毒（pedv）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救

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1、学校代码：10255学号：2130635硕士学位论文猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救ConstructionofPEDVvaccinetransfervectorandrescueofrecombinantvirus学科专业：生物工程作者：陈冰清指导教师：孟清李震答辩日期：2015年5月27日东华大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我

2、对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：陈冰清日期：2015年5月29日猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的急性"接触性"高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水。PED的波及范围广，在全球均有病例报道。近几年，该病在中国广泛蔓延，造成了严重的经济损失，引起了中国各研究单位对其

3、病原PEDV的关注。目前，PEDV商品化疫苗保护效力在逐年降低，主要有两个原因，一是目前商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，二是减活疫苗毒株由于体外适应传代培养而被过度弱化。因此，新型疫苗的开发具有重要意义。本研究旨在通过靶向RNA重组反向操作平台，将2013年流行的3株细胞适应毒株的S基因分别替换掉原疫苗株（DR13）S基因，最终装配出3株重组疫苗毒株作为疫苗候选毒株，为后期研发的新一代减毒活疫苗奠定基础。本研究分为两个部分。第一部分：构建猪流行性腹泻病毒基因工程疫苗载体。选择三株2013年流行的细胞适应毒株KF804028,KF650372,KF650375的SI猪流行性腹

4、泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救基因作为免疫原性基因。根据Genbank中KF804028，KF650372,KF650375的S基因的序列，通过引物小片段(三条基因共94段)进行overlapPCR，形成一级片段，将融合得到的一级片段连接pJET-Blunt载体进行克隆并且测序。选择测序正确的Blunt载体，用引物进行PCR扩增，形成13段正确的一级片段。将相邻有21bp碱基重合区域的一级片段再次进行PCR片段融合，形成二级片段，同样的方法，逐级放大至四级片段，合成出3段PED流行毒株S(4161bp)基因。PED流行毒株S(4161bp)基因通过同源重组

5、的方法与p-PEDV-ΔSDR13连接，并且克隆测序，从而获得正确的重组质粒，即猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体。三个重组质粒分别命名为pPEDV-DR13ΔS/KF804028S、pPEDV-DR13ΔS/KF650372S、pPEDV-DR13ΔS/KF650375S。第二部分：重组病毒的拯救。将已经构建好的三个携带流行的细胞适应毒株S基因的重组质粒体外转录成RNA，通过电转，使流行毒株的S基因整合进入PEDV病毒基因组，再将重组的PEDV（rPEDV）感染VERO细胞，从而获得能够在VERO细胞上产生CPE并且连续传代的重组PEDV。三个重组病毒分别命名为PE

6、DV-DR13ΔS/KF804028S、PEDV-DR13ΔS/KF650372S、PEDV-DR13ΔS/KF650375S。关键字：猪流行性腹泻病毒，疫苗载体，重组病毒，病毒拯救II猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体构建及重组病毒拯救CONSTRUCTIONOFPEDVVACCINETRANSFERVECTORANDRESCUEOFRECOMBINANTVIRUSABSTRACTPorcineepidemicdiarrhea(PED)isahighlycontactingtransmitteddiseasethatischaracterizedbyacuteent

7、eritis,vomit,diarrheaanddehydration.ThecausativeagentofPEDisPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV).Inrecentyears,thediseasewidelyspreadinChina,resultinginseriouseconomiclosses,attractingmuchattentionofvariousChineseacademicinstitutions.Currently,protec