重组人乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其抑制剂筛选

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1、＇类号－＾？？密绞公化ＵＤＣ６３０全曰制硕±专蓝学位研究生学位论文重組人公賺胆碱酿酶的表达纯化及其抑制剂筛选作者姓名；乂怖巧指导教师；书向华副教授专业学位名称；农业備ｒ倾Ｉ：领域名称；ｉＬ＿ｉ研究方向：林业与化物巧术ｉ所在学院：林化ｊ化物巧术学院论文提交日期：２０１５年１２Ｗ１８日浙狂农林大学２０１５年１２月独创性声明，２０２ＦＲ０８０本人声明，所呈交的学位论文是受浙江农林大学科研发展基金（基金编号：１），在指导教师指导下，通过自己的努力取得的成果，并且是自己撰写的，资助。尽我所知除了

2、文中作了标注和致谢中己经作了管谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不拉含在浙江农巧大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料一。与我同对本研究做出．都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，贡献的同志。如被查有严重侵犯他人知巧产权的行为由本人承担应有的责任。＾；日期１７学位论文作者亲笔签名；Ｗ文？论文使用授权的说明本人完全Ｔ解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借网Ｉ；学校可从公布论文的全部或部分内容可采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。，在年后解巧可

3、适。□本授保密＿用权书不密论文属。保本学位于不保密，＂＂Ｖ（）请在方框内打、＞ｉｉ１位论：批文作者签名：日学亲笔期＾０ｊ。，签：Ｂ期：心）指导名／教师亲笔方ZhejiangAgriculture&ForestryUniversityMasterDegreeThesisExpressionandpurificationofrecombinanthumanacetylcholinesteraseandscreeningofitsinhibitorsCandidate:WuHuaixiuSupervisor:WangXiangjunAssoci

4、ateSupervisor:QianYongchangSpecialty:ForestryDateofSubmission:October06,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaDecember,2015摘要摘要乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)作为一种存在于胆碱能突触间隙的由蛋白质分子构成的生物催化剂，属于生物神经传导中的一种关键性的酶。它不仅参与细胞的生长以及发育，同时对神经的再生和神经元的发育也有促进作用，并对维持人体神经系统的正常生理功能占有着非

5、常重要的地位。乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）是AChE的水解底物，ACh会受AChE的催化发生裂解反应，导致ACh的缺失，从而使得各神经信号传递失败。而ACh水平的降低或活性的异常则是造成阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）发生的主要原因。近年来，通过提高ACh的水平来治疗AD，这已经成为目前主要的治疗方式。因此，通过抑制AChE来恢复或提高ACh的水平是治疗AD持续有效的方法。乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesteraseinhibitor,AChEI)能够选择性的抑制脑内AChE的活性，使ACh在大脑内的存留时

6、间延长，提高AD病人的胆碱神经功能，同时也能有效缓解病人的认知能力障碍降低病人。迄今为止，对于轻、中度的AD治疗AChEI已经成为主流产品。经美国FDA批准上市的6种AChEI，它们分别是他克林(Tararine)、加兰他敏(Galanthamine)、利伐司替明（Rivastigmine)、石杉碱甲(HuperzineA)以及复方新药Namzari和多奈哌齐(Donepezil，E2020),但是已经发现的AChEI还有较多缺点存在，例如半衰期短、毒性大以及较严重的胆碱能外周系统的副作用等，这使得它们在临床应用上面受到一定限制。因此,寻找发现作用时间长、副作用小的

7、新一代AChEI仍是目前治疗AD药物的研究热点。本研究旨在利用体外人胚肾（HEK293）细胞建立表达重组人乙酰胆碱酯酶（Recombinanthumanacetylcholinesterase,rhAChE）的表达系统，使用pCMV-AChE质粒对其进行瞬时转染，分泌表达酶液到培养基，并通过对酶动力学的研究来考察重组表达蛋白的酶活性。使用DEAE-SepharoseFF亲和层析对高效表达的重组蛋白进行纯化，以获得纯度较高、活性较强的重组人乙酰胆碱酯酶，从而建立重组人乙酰胆碱酯酶抑制剂的体外评价筛选模型，并应用该模型从天然产物及其衍生物中筛选其中药抑制剂和对一系列