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《乙酰胆碱酯酶抑制剂活性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、——实验设计乙酰胆碱酯酶抑制剂活性研究大纲一、研究背景；二、研究内容；三、实验材料及方法；四、实验数据分析；四、后续工作展望。一、研究背景乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及其抑制剂乙酰胆碱酯酶在人体中主要存在于神经肌肉组织的突触后膜上,已知其主要功能是催化乙酰胆碱的分解,在胆碱能神经纤维的信号传导中扮演重要角色。乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱的分解，直接造成神经信号传递失败,引起老年痴呆症。AChE抑制剂AChE抑制剂可竞争性或非竞争性的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱正常释放，神经冲动正常进行，
2、可起到治疗老年痴呆症的作用。二、研究内容1.实验模型：硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代胆碱,硫代胆碱与显色剂二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)迅速作用,生成在412nm处有光吸收的黄色物质,在酶催化反应的稳态阶段其OD值即可代表起始反应速率。2.AChE抑制剂对AChEIC50值的测定(IC50:即抑制率为50%时的抑制剂浓度).3.样品中AChE抑制剂对AChE的抑制类型研究。三、实验材料及方法实验主要仪器、试剂1.仪器：分光光度计2.主要试剂：乙酰胆碱酯酶(AChE);50mmol/L、pH
3、8.0的PBS;15mmol/L二硫二硝基苯甲酸(DTNB)溶液(用50mmol/L,pH8.0PBS配制),15mmol/L硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine,ATch,用50mmol/L,pH8.0PBS配制),4%十二烷基硫酸钠(SDS)等。三、实验材料及方法试验方法样品提纯及处理试验选择适当的底物浓度硫代乙酰胆碱标准曲线的绘制。AChE抑制剂对AChEIC50值的测定抑制剂对α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定三、实验材料及方法1.样品提纯及处理。提取样品后，烘干后，用PBS缓冲液定容到终浓度10mg/L。2.通过
4、实验选择适当底物浓度范围。反应体系中的酶量为120μL15mM/3mL。通过一系列的底物浓度，确定最适浓度范围。三、实验材料及方法3.硫代乙酰胆碱标准曲线的绘制。分别吸取20，40，60，80，100，120μL15mM硫代乙酰胆碱标准液，加入等量显色剂二硫二硝基苯甲酸（DTNB)，以PBS缓冲液定量至3mL测定412nm处吸光值。横轴为5mL测试液中硫代乙酰胆碱微摩尔数，纵轴为吸光值，绘制标准曲线。（用于后面的浓度定量。）三、实验材料及方法4.AChE抑制剂对AChEIC50值的测定2.65mLPBS(pH8.0),50μL乙
5、酰胆碱酯酶(0.85U/mL),100μL15mMDTNB和样品溶液100μL加入试管，37℃预热2min，然后加入100μL15mM硫代乙酰胆碱（起始浓度是0.5mM），在37℃保温20min后立即加入1mL0.4％SDS终止反应，将所得溶液立即在412nm下测量吸光值并根据下式计算抑制率：抑制率(％)=[A对照-(A样品-A样品空白)]/A对照×100。按照公式计算抑制率，以横坐标为酶促反应体系中抑制剂的浓度，纵坐标为抑制率，绘制曲线，计算其抑制率为50%时的抑制剂浓度，即为IC50。三、实验材料及方法5.抑制剂对乙酰胆碱酯
6、酶抑制类型的确定（1）抑制作用是否可逆在酶促反应体系中加入不同浓度的酶液，加入一定量抑制剂，以酶浓度为横坐标，以初速度为纵坐标，绘制曲线。根据曲线形态判断抑制作用是否可逆。（2）抑制动力学常数的测定及类型判定以不同浓度的硫代乙酰胆碱为底物，加入一定量抑制剂或不加抑制剂，测定反应速度。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Dixon作图法，确定抑制动力学常数并判断抑制类型。四、实验数据分析可逆抑制，判断其抑制类型。竞争性抑制?or非竞争性抑制?or反竞争性抑制?四、实验数据分析米氏方程判断可逆不可逆四、实验数据分析四、实
7、验数据分析四、实验数据分析四、实验数据分析二、研究内容Dixon作图法求Ki只要以[I]为横坐标，以1/v为纵坐标，采用1个以上的[S]，给出不同[S]时的直线，由这些直线的交点即可求得Ki.四、实验数据分析五、后续工作展望阿尔茨海默病(Alzheimerpsdisease,AD)又称早老性痴呆(preseniledementia),是发生于老年和老年前期以进行性痴呆为特征的大脑退形性病变。老年人中AD的发病率较高。随着我国人民生活水平的不断提高和健康卫生事业的不断发展,不少城市的人口老龄化现象日益严重,如北京、上海等地,60岁
8、以上人群中就约有5%AD患者。AD的临床表现为进行性认知功能减退,并伴随行为障碍及情绪异常等,直至生活不能自理。其发病率和死亡率较高,故AD日益成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一。AD病人的胆碱能系统受到损害导致突触部位乙酰胆碱含量降低,从而使病人的学习和
