牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程（定稿）

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1、ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/TXXXXX—XXXX牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程CodeofpracticefordetectionofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilk-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/XXXXX—XXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14检测原理15主要试剂配制26主要仪器设备27质谱检测及数据处理参数28检测方法28.1样本采集28.2蛋白提取28.3蛋白质的消化28.4质谱鉴定39结果判定39.1SDS-PAG

2、E鉴定39.2A2型β-酪蛋白的判定310废弃物的处理311检测过程中防止交叉污染的措施3附　录　A（资料性附录）主要试剂配制4附　录　B（资料性附录）主要仪器设备6附　录　C（资料性附录）蛋白检测参数及结果813DB37/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧总站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业学院畜牧研究所。本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志

3、花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲跻峰。13DB37/XXXXX—XXXX牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程1　范围本标准规定了牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测方法。本标准适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和实验方法GB/T19495.2—2004　转基因产品检测　实验室

4、技术要求GB/Z35959—2018　液相色谱-质谱联用分析方法通则3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　A2型β-酪蛋白　A2β-casein；A2CSN2β-酪蛋白由224个氨基酸（含有15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I），当第51位、52位、82位、103位、108位、121位、137位、167位氨基酸分别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为A2型β酪蛋白。3.2　A2奶A2milk所含β酪蛋白为A2型的牛奶称为A2奶。3.3　质谱法　Massspectrometry

5、；MS试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。3.4　质荷比　Mass-to-chargeratio离子的质量m与其所带的电荷数z之比，以m/z表示。4　检测原理13DB37/XXXXX—XXXXβ-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51E＞K、p.52E＞K、p.82P＞H、p.103L＞I、p.108M＞L、p.121H＞Q、p.137S＞R、p.167P＞L）（参考序列：GenBankAAA30431.1），而不同氨基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而确

6、定氨基酸突变位点，实现对不同变体型β-酪蛋白检测的目的。1　主要试剂配制实验所用水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃，1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。2　主要仪器设备见附录B。3　质谱检测及数据处理参数见附录C。4　检测方法4.1　样本采集4.1.1　待检测的新鲜牛奶每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50mL，充分混匀后，-80℃保存。4.1.2　待检测的商品化奶粉包装未开封，常温储存。4.2　蛋白提取4.2.1　从-80℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样50μL，或称取奶粉样本30mg。4.2.2　向上述样

7、品中加入500μL裂解液【8M尿素，30mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）】。冰上裂解10min。离心，4℃，20000g，30min。取上清，避免吸到油脂。4.2.3　加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）至终浓度55mM，暗室静置1h。4.2.4　使用考马斯蓝染色法（bradford法）对蛋白质进行定量。4.2.5　对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定（如附录C.1）。4.3　蛋白质的消化4.3.1