抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素介导的MAPK信号通路的影响

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1、湖北中医学院博士学位论文抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素介导的MAPK信号通路的影响姓名：刘林申请学位级别：博士专业：中医内科学指导教师：张赤志20070519原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他任何个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期：年月日学位论文使用授权说明本人完全了解湖北中医学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本；学校有

2、权保存学位论文的印刷本；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布学位论文的部分或全部内容。(保密论文在解密后，遵守此规定)论文作者签名：导师签名；同期：年月同湖北中医学院博士学位论文中文摘要目的肝纤维化(1iverfibrosis，LF)为各种慢性肝疾患所导致的一系列损伤—修复，最终肝组织内细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)过度沉积的反应。由于发生的机制比较复杂，至今对肝纤维化的了解还很有限，因此制约了肝纤维化治疗的发展。肝星状细胞(HepaticStellateeell，HSC)作为ECM的主要生成细胞，被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。

3、在肝纤维化的发生发展机制中，对肝星状细胞激活的启动、维持，细胞外基质也起着重要的作用。HSC与ECM之间存在着复杂的相互作用，而其相互作用主要经整合素介导。黏着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)是整合素信号途径中连接整合素与下游信号分子的媒介，是胞内多个信号途径的交汇点。其中，以FAK为中心的整合素信号转导通路主要是Ras-ldAPK途径，细胞外信号调节激酶1／2(extracellulaksignal—regulatedkinase，ERKl／2)是MAPK家族中研究最为清楚的成员，其通路Ras-RAF--MEK—ERK参与细胞多种活动。抗纤软肝颗粒

4、组方在临床上有良好的疗《效，现将其制成适应临床需要的颗粒剂。在既往研究的基础上，应用体外细胞培养技术，从肝星状细胞与细胞外基质的相互作用着手，以整合素、FA[、ERKl／2为研究切入点，研究抗纤软肝颗粒对肝星状细胞整合素信号通路的影响，由此阐释抗纤软肝颗粒抗肝星状细胞增殖与诱导凋亡的作用机制。方法：(1)首先根据处方中丹参、莪术及鳖甲所含化学成分的理化性质及其药瑶作用，以提取丹参酮IIA和莪术挥发油为目的，确定抗纤软肝颗粒的制备制成工艺，用正交设计的直观分析优化几种辅料的用量确定最终的制剂处方。(2)考察成品的体外溶出度；同时对之进行全面的质量控制研究，制定质量标准。(3)

5、运用体外细胞培养技术，以HSC-T6细胞系为研究对象，分为空白包被+10％生理盐水血清组、FN包被+10％生理盐水血清组、FN包被：1-5％kxr组、FN包被+10％kxr组，FN包被+20％kxr组。按以上分组进行药物干预，各组FN(3pg／m1)均于kxr加入前30分钟加入，干预后继续培养48h．(4)采用MTT法测细胞增殖，采用甲苯胺蓝染色方法测定细胞黏附率；Annexinv-PB／7一ADD法测定Hsc凋亡。(5)应用免疫细胞组织化学方法检测HSC整合素0【5D1蛋白的表达。(6)应用免疫细胞组织化学方法检测HSCFAK蛋白的表达，采用RT-PCR法测定FAKmRN

6、A的表达。(7)应用免疫细胞组织化学方法检测HSCERKl蛋白的表达，湖北中医学院博士学位论文采用RT-PCR法测定ERKlmRNA的表达。结果：(1)丹参的渗漉最佳工艺为：用90％的乙醇进行渗漉，流速为0．6ml／min，乙醇用量为12倍，浸泡时间为16h；鳖甲超微粉碎后置显微镜下观察，可见粒径小于5um的多于50％，粒径小于10um的多于90％；莪术挥发油的最佳提取工艺为加水8倍，浸泡时间为0．5h，煎煮5h。莪术挥发油的最佳包合工艺为挥发油：D—cD(1：4)，搅拌时间为60min，包合温度为50U，以10000r／min的转速进行包合。制备工艺中确定以糊精为辅料，药

7、物：糊精：1：0．5，以50％乙醇为润湿剂，加入0．4％倍CMC作为助悬剂，过16目筛制粒，50"C干燥，10目筛整粒。(2)含量测定方法学考察实验中，其回收率合格，精密度，稳定性和重现性良好，说明了所制定的含量测定方法的合理性和可行性；样品在考察期各项指标无明显变化，均符合规定。(3)与FN组比较，kxr各组均可以抑制HSC增殖，存在显著差异(P<0．01)，kxr各组均可以诱导HSC凋亡，与Flq组及空白对照组比较存在显著差异(P