《凝胶层析分离技术》PPT课件

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1、第十章凝胶层析法第十章凝胶层析法第一节凝胶的条件和类型第二节基本原理第三节凝胶层析的实验技术第四节凝胶层析的应用第一节凝胶的条件和类型层析凝胶必须具备下列条件：凝胶层析中常用凝胶类型层析凝胶必须具备下列条件凝胶必须是化学惰性的凝胶的化学性质必须是稳定的凝胶上没有或只有极少量的离子基团凝胶必须具有足够的机械强度凝胶层析中常用凝胶葡聚糖凝胶(dextrangel，Sephadex)聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel，Bio-GelP)琼脂糖凝胶(agarosegel，Sepharose)琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex)葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构

2、(Sephadex)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的部分结构(Bio-GelP)琼脂糖凝胶(Sepharose)(Sepharose)琼脂糖凝胶的部分结构第二节基本原理一、凝胶的结构与分子筛效应二、凝胶床总体积三、分配系数（Kd）四、有效分配系数（Kav）五、分子量与Ve的关系一、凝胶的结构与分子筛效应动画演示二、凝胶床总体积Vt：柱床“总容积”，Vo：即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积。Vg：凝胶本身的容积；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg，三、分配系数（Kd）0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化Ve：为实际测得的洗

3、脱容积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积；Ve＝Vo十KdVi四、有效分配系数（Keff）将Vt-Vo代替Vi，则：即：Ve＝Vo十Keff(Vt-Vo)实际上，Keff是将以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而洗脱剂(Ve-Vo)为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，五、Ve与相对分子量的关系Ve=K1-K2lgMK1、K2为常数，Ve可用如下表达式代替，Ve-Vo（分离体积），Ve/V

4、o（相对保留体积），Ve/Vt（简化洗脱体积），Keff（相对洗脱体积）在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的差异第三节凝胶层析的操作技术一、凝胶的选择与处理二、凝胶装拄制备三、样品上柱及洗脱四、实验操作五、凝胶柱的保养和凝胶的保存一、凝胶的选择排阻范围与粒度的选择凝胶用量的计算排阻范围的选择粒度的选择粒度的选择凝胶用量的计算干凝胶用量（g）：πr2h/膨胀度（膨胀度：床体积/克干胶）理论用量×（1+10%）凝胶的处理SephadexG-25G-75G100G-150G-200（中）湿球粒度μm100-200120-20020-200120-200120-200吸水值ml/g干胶2.5

5、±0.27.5±0.510.0±1.015.0±1.520.0±2.0床体积ml/g干胶4-612-1515-2020-3030-40球蛋白分离范围KD1-53-804-1505-3005-600二、凝胶装拄制备柱结构（φ、h）的选择装柱柱鉴定柱结构（φ、h）的选择三、样品上柱及洗脱加样量的控制分析：1-2ml/100ml床体积制备：10-30ml/100ml床体积洗脱液的选择控制凝胶收缩影响洗脱的因素流速对蛋白质分辨率的影响操作压与流速的关系流速对蛋白质分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响凝胶柱层析操作压操作压与流速的关系加样量对分辨率的影响I.加养量少时，A、B二种

6、物质充全分开。II.加养量适当时，A、B二种物质刚刚分开。III.加养量太大时，A、B二种物质只能部分分开。四、凝胶层析的操作技术凝胶的处理柱层析系统的安装凝胶装拄样品上柱及洗脱Vo、Vi、Vt的测定标准曲线的制作及Kd和Kav的计算凝胶柱的保养和凝胶的保存1、凝胶的处理①将称好的干粉倾人过量的洗脱液中，室温下充分溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热溶胀3-5小时，这样还可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。②为了保证流速稳定，获得较好的实验结果，使用前用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗粒大小一致，。2、柱层析系统的组装柱层析系统的安装3、

7、凝胶装柱。①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液；③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。④连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。（防止空气进入凝胶床）4、样品上柱及洗脱①加样量的控制分析：1-2ml/100ml床体积，制备：10-30ml/100ml床体积②洗脱液的选择：洗