层析分离技术（7）反相层析课件.ppt

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1、第七章层析分离技术（7）本章内容7.1层析技术导论7.2凝胶过滤层析7.3离子交换层析7.4亲和层析7.5固定金属离子亲和层析7.6疏水作用层析7.7反相层析7.7反相层析一、基本原理二、反相介质的种类三、特点及用途四、影响因素五、高效液相色谱简介7.7反相层析一、基本原理反相层析（Reversed-phasechromatography,RPC）利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差异进行分离纯化的层析技术。反相层析属于分配层析，溶质在固定相（非极

2、性介质）和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性：溶质的疏水性越大，其在固定相中的分配系数越大。烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此，RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。7.7反相层析二、反相介质的种类反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键和非极性分子层。硅烷化反应式如下：其中，硅烷化试剂中R1和R2多为甲基，R为C4、C8、

3、C18烷基或苯基，一般简称为C4、C8、C18柱等另外，高分子聚合物也可作为反相介质，如：聚丙烯酸酯-C187.7反相层析三、特点及用途一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。为了得到更好的分离效果，有时加入一定浓度的三氟乙酸（TFA）适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。由于反相

4、介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在RPC过程中容易变性失活。因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的反相介质和流动相。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用

5、的80%左右。7.7反相层析三、特点及用途相似之处：均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不同进行色谱分离。不同之处：①固定相的疏水程度不同；②流动相组成不同；③操作方式不同；④应用范围不同。反相色谱与疏水作用色谱的比较7.7反相层析四、反相层析的影响因素在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因素主要包括：流动相的组成、洗脱模式、层析柱尺寸、流速、温度等。1.流动相2.洗脱模式3.层析柱的尺寸4.流速5.温度1.流动相1)流动相的组成：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流动相极性越

6、低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的有机溶剂比例会逐渐提高，以使各样品组分按疏水性由弱到强的顺序洗脱；对有机溶剂的要求：与水互溶、由较低的紫外吸收及较低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。2）流动相的pH值：反相层析的流动相条件多在低pH值下（pH2-4）层析介质（如硅胶）在高pH下不稳定；很多组分在低pH下具有较好的溶解性；低pH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离；为了使流动相保持在低pH下，在流动相中加入酸（如三氟乙酸（TFA））。2.洗脱模式由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相

7、结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成随时间而变化。通常可采用阶段洗脱和梯度洗脱。最理想的洗脱条件是通过多次实验优化后得到的。3.层析柱的尺寸层析柱的尺寸由其内径和柱长所决定，内径影响层析的规模，但对分辨率没有影响，柱长对分辨率的影响则与溶质的种类有关。对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改善分辨率，而多肽、核酸等生物

8、大分子对柱长的敏感程度较低。4.流速流速对于反相层析的影响是多方面的，一般来说，流速对于小分子的分离影响较大而大分子对流速变化敏感性较低。通常过高的流速会导致涡流扩散严重，影响样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗脱峰宽度变大分辨率下降；但过低的流速可能会导致样品组分纵向扩散加剧，也会使分辨率下降，且分离时间较长，不利于样品的稳定和较大规模的分离；5.温度温度对于反相层析的分离结果有较大的影响。提高温度能够降低流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变宽现象，从而改善分辨