禽病原性大肠杆菌E516株与尿道致病性大肠杆菌U56株毒力基因相关性与体内外表达差异的研究

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1、扬州大学硕士学位论文禽病原性大肠杆菌E516株与尿道致病性大肠杆菌U56株毒力基因相关性与体内外表达差异的研究姓名：高清清申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：高崧;刘秀梵20100501高清清：禽病原性大肠杆菌E516株与尿道致病性大肠杆菌U56株毒力基因相关性与体内!外表达差异的研究于葡芰尿道感染是一种严重危害人类健康的常见病，40％一50％的妇女至少经历过一次尿道感染，临床表现多样(尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎等)，仅在美国，每年即有大约8百万人罹患该病，住院患者约30万。迄今，尿道致病性大肠杆菌(uropathogeni

2、cEscherichiacoli，UPEC)是所有尿道感染中最常见的病原体。禽大肠杆菌病是部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的局部或全身性感染的疾病，包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(HjRITe氏病)、气囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎／卵黄囊感染。APEC和UPEC均能引起肠道外感染，具有广泛的致病潜能。基于这种广泛的致病潜能，UPEC和APEC被归为新型致病性大肠杆菌——肠道外病原性大肠杆

3、菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC)。APEC和UPEC引起肠道外感染可能与它们的毒力特性有关，如黏附素、铁摄取系统、毒素、保护素和侵袭素等，这些毒力特性使它们能够在宿主环境中生存进而产生疾病。诸多研究证明，APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。本研究选取代表性APEC、UPEC分离株，比较它们的种系发生分型及毒力基因的分布，并通过SPF鸡对它们的致病性进行鉴定，同时比较APEC和UPEC在鸡和小鼠体内外竞争性生长情况；通过感染实验小鼠和鸡，应用相对定量反

4、转录PCR测定受试毒力基因在体内的表达水平，从而揭示APEC、UPEC毒力基因在同～宿主体内的表达规律，最终为弄清APEC与UPEC是否作为对方毒力基因贮库这一关键问题提供依据。相对定量PCR对APEC和Ⅵ，EC毒力基因在体内表达水平的检测结果，结合PCR检测毒力基因的分布以及对SPF鸡致病性试验的结果，说明APEC和UPEC在毒力基因方面的相关性。1．APECE516株和UPECU56株毒力、毒力基因相关性的研究选取同属01血清型禽致病性大肠杆菌分离株E516和人尿道致病性大肠杆菌扬州大学硕士学位论文U56株，应用单一和多重PC

5、R技术比较它们的种系发生分型及毒力基因的分布，并通过SPF鸡对它们的致病性进行鉴定，同时以肠出血性大肠杆菌代表菌株933和非致病性大肠杆菌代表菌株K．12MGl655作对照；并比较APECE516株和UPECU56株在鸡和小鼠体内外竞争性生长情况。结果显示，E516株和U56株种系发生型一致，在毒力基因相似性高：对1日龄SPF鸡致病力测定结果表明U56株能产生与E516株相似的病变，但是致病力略低于E516；鸡和小鼠体内竞争性试验结果显示U56竞争力略低于E516，这可能与两者仍存在不同的已知或未知的毒力因子有关。上述研究部分佐证

6、了APEC可能是UPEC的来源或UPEC的毒力基因储存库的推论。2．检测ompT和．屉以相对定量PCR方法的建立及其在体内外表达水平的解析本研究用嵌合荧光(SYBRGreenI)标记，以编码甘油醛3．磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因，建立了用于ompT和乃DB基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR(reaatimequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,qRT-PCR)。运用该定量PCR分别建立了内参基因gapA和目的基因ompT与屉D曰的3个标准

7、曲线，这些标准曲线的斜率和线性关系均符合要求，表明所建立的定量PCR体系的扩增效率高、定量准确。定量PCR对ompT和．店DB基因在感染鸡体内及小鼠体内的表达水平的解析结果表明，相对于体外培养，APECE516株ompT在鸡体内和小鼠体内的表达分别上调了3．73和1．45倍，弦拈在鸡体内上调了1．30倍，在小鼠体内表现下调趋势，下调率为0．84；UPECU56株ompT在鸡体内和小鼠体内的表达分别上调了1．52和2．57倍，．居DB在鸡体内和小鼠体内的表达分别上调了2．15和1．37倍；而对照菌株EHEC933和K-12ompT与

8、．尼柏在鸡体内和小鼠体内的表达均表现下调。上述结果提示我们，APEC、UPEC毒力基因ompT和feoB在鸡攻毒模型和小鼠尿道感染模型中的表达水平基本一致，多表现为上调，即它们可能是APEC和UPEC的致病基因。关键词：禽病原性大肠杆菌；尿道致病性