人HGLPcDNA的克隆和原核表达

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维普资讯http://www.cqvip.com斟拳电扛第415卷第2期2001年1月简报a)T=1_0℃，[MMA]047tool·L～，[AIBN]0[FeCI3】o『间苯二甲酸ln】：2：4IAIBN异丁腈的初始浓度越低，产生的聚甲基丙烯酸甲酯presenceofⅡiphe“ylpb0spbine：Aneasywaytowell—controgedPMMA．Macromolecules．】998．3I(2)545~547的分子量越高，但所有测得的分子量均高于理论计WangJS．MatyjaszewskiK。Living’／controlledradicalpolyme-算值．原因可能如上面分析的一样，在反应初期由于rizationTransition—metal—catalyzedatomtransferradicalpoiyme—产生了过多的自由基，存在一定的偶合链终止反应．rizationinthepresenceofaconvelttiona]radicalinitiator．Macromo]ecules，】995．28(22)：7572—7573而FeCI／问苯二甲酸在DMF中络合物的结构已在XiaJ．MatyjaszewskiKControlled／‘Living’radicalpolyme-FeC12／I可苯二甲酸催化的MMA的ATRP中讨论过】．rizationHomogeneousreverscatomtransferradicalpo]yme—总之，应用偶氮二异丁腈，三氯化铁／问苯二甲酸rizationusingAIBN,aSthelnltiator．Macromolecuies．】997．30(25)：7692—7696作为引发体系可以成功实现甲基丙烯酸甲酯的反原ZhuShenmln，WangWenxin，TuWenping，eIalReverseatom子转移自由基聚合．该聚合反应具有活性／可控聚合transferradicalpolymerizationofstyreneusingBPOasthe的特征：分子量随单体转化率线性增加，分子量分布initiatorunderheterogeneouscondltionsActaPolymerica．【999，50：267—269较窄．这种新型引发体系可用于合成高分子量、窄分YahDeyue．WangWenxin，TuWenping‘Living’／controlled子量分布的聚甲基丙烯酸甲酯．与其他应用于反原ra61calpo]ymerlzationinitiatedbyredoxsystemPolymer子转移自由基聚合的引发体系相比，问苯二甲酸的Preprims．】999．4o(2】：358~359XiaJ．Mat”aszewskiKHomogeneousrevergeatomtransfer易获得性及无毒性使其具有良好的开发前景radicalpolymerizationofstyreneinitiatedbyperoxides致谢丰工作为国家自热科学科学基金资助项目(批准号：Macromolecules．1999．32(I6】5】99—520259673002)8ChenXiaoping．QiuKunyaanSynthesisofwell—definedpotyfmethylmethacryiatv1byradicalpolymerizationwithanew参考文献LnitiationsystemTP凹fFeC【3『PPh3Macromotecu]es1999IWangJS．MatyjaszewskiKControlled／‘Living’radicalpoiyme-32(26)：87】_一87l5rizationAtomtransferradicalpo]ymerizatioltinthep~senceof9ZhuShenmin，"fanDeyxte．Atomtransferradicalpolymerizationoftransition-metalcomplexesJournaloftheAmericanChemicalmethylmethacrylatecatalyzedhyiron‘chl0nde，IsODh|ha】jcacidSociety．】995117：5614-56]5systemMacromo]ecules．2000．33(22)：8233~82382MoineauG，DuboisPh，J~r6meR．eta1．Alternativeaton2transfer(2000-07-07收藕，2000-】0一I6收修改稿)radicalpolymerizationforMMAusingFeelandAIBNinthe人HGLPcDNA的克隆和原核表达周海军黄晓玮周严李光涛阴彬马艳玲彭小忠袁建刚强伯勤(中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院，中国人类基因组北方研究中心，北京100005联系^．E-mail：yuanjg@mall+eastnetcn)摘要克隆了人HGLPeDNA，编码蛋白具有G蛋白偶联受体类似的7个跨膜区，具有视紫红质样G蛋白偶联受体超家族的基序(motif)．Northern杂交分析发现HGLP广泛表达．将HGLP的N，c端非跨膜区片段克隆到pET30a表达载体中，在Ecoli中获得了高教表达．关键词G蛋白偶联受体HGLPeDNA原核表达G蛋白偶联受体是最大的膜受体超家族之一，位点(丝氨酸，苏氨酸)的c端位于细胞内，第5，6螺其典型结构是：具有7个跨膜Ⅸ螺旋，糖基化的N端旋问的环(100p)与G蛋白结合，从而传递受体信号，位于质膜外，形成配体结合结构域；带有多个磷酸化在细胞的很多信号传导途径中具有重要功能⋯．G蛋ll6www．sclchlna．com 维普资讯http://www.cqvip.com简报第46卷第2期2001年1月斟．：筝屯^白偶联受体除了在生理活动中扮演着重要的角色外，游引物CI：5GG!￡TCCCATTCCTTACTC它与疾病的关系也很密切，G蛋白偶联受体的突变可CATTTTGG3)引物分别含有nI和HindⅢ，以造成多种疾病．而且许多药物是以G蛋白偶联受fⅡ和rpnI酶切位点以含全长HGLPeDNA的体为靶子而发挥作用．阳r陛克隆为模板，用高保真的耐热DNA聚台酶我们通过对人胎脑cDNA文库规模化测序直接(ExpandhighfidelityPCRsystem，购自德国分离、克隆了一条全新的eDNA，其推测的ORF编码BoehringerMannheim公司)扩增．PCR产物HGLP-N，一个具有555个氨基酸，分子量为63_3ku的蛋白质，HGLP-C分别连入pQE40／41载体，pQE40／41含DHFR其mRNA在多种组织中表达新蛋白具有7个跨膜蛋白，将DHFR及DHFR．HGLP—N，DHFR—HGLP-C区，这类似于G蛋白偶联受体的结构．Motif分析将重组序列切下克隆到pET30a原核表达载体中其归为视紫红质样的G蛋白偶联受体超家族据此(2)重组蛋白的表达及表达产物的SDS—PAGE电泳分我们将新克隆的cDNA命名为HGLP(humanG—pro—析．阳r陛质粒转入BL21菌后用1mmol／LIPTG诱导teincoupledrecepterlikeproteingene)．为了进一步表达，12％的SDS-PAGE检测表达蛋白，考马斯亮蓝研究人HGLP的功能，我们将该基因的N，C端编码染色．区克隆到pET30a载体中进行了原核表达．2结果1材料和方法2．1eDNA阳性克隆的筛选及其核苷酸序列与编码(i)HGLPcDNA的筛选与序列分析．(1)eDNA氨基酸的分析克隆的筛选．我室在构建LZAPExpress胎脑文库时，从~．ZAPExpress胎脑文库随机挑取的克隆，测随机挑取895个克隆，5测序150—300bp，然后进行序、序列分析后在GenBank库中比较发现了一个新序列分析，挑取具有全新ES有同源EST但元全长序列的克隆，其cDNA序列及其推测的氨基酸序列见eDNA或是其他物种有同源蛋白而无人全长eDNA的图1．所测cDNA长度为2286bp，编码一长555个氨克隆共362个，进行克隆环化．经5，3测序、序列基酸、分子量为63．3ku的蛋白(GenBank编号为分析后挑出一部分全长可能性较大、与GenBank库AF132733)根据可读框的搜寻，确定位于43～45bp比较为新序列的克隆，进行全序列测定．其中新基因的ATG是翻译起始点，1705～1707bp的TAA是翻译HGLP的cDNA就是这样发现和克隆的．(2)eDNA序终止密码子．在可读框5上游有一个框内终止密码．列的网上分析．DNA和蛋白质的同源性比较使用亲疏水性分析发现HGLP有7个穿膜区(图2)．比较Blast软件与NCBI，EBI．DDBJ的数据比较蛋白的motif，发现我们所克隆的eDNA编码的蛋白(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)穿膜区的预测采用序列中具有许多视紫红质样的G蛋白偶联受体超家Hofmann的方法J．基序(motif)分析运用motifFinder族的motif(图1)，将其归类为视紫红质样的G蛋白程序(http：／／www,mofifgenome．adjp)．偶联受体超家族．(Ⅱ)HGLP基因组织表达谱分析．以HGLP52．2HGLP的染色体定位端510bp编码区为杂交探针，对成人8种组织进行随着人类基因组计划的发展，人基因组序列草图Northernblot(购自Clonetech)杂交．操作步骤按产品可由公共数据库获得．利用相应软件，将HGLP与人说明书中的方法进行．基因组序列比较发现HGLP基因定位于人染色体(iii)HGLP蛋白N，C端的融合表达．(1)HGLP15q15的大约62kb的范围里，具有20个外显子(图3)．蛋白N，C端编码区表达载体的构建．根据HGLP2．3组织表达谱分析eDNA的序列设计引物Nu和N1扩增其N端编码区，Cu和c1扩增其C端编码区(N端上游引物Nu：5GG多组织Northern杂交显示HGLP只有一个转录!△GGAAAGATCCTCTTCAGAAATACC本，大小约为3kb．说明我们克隆的cDNA并不全，3，下游引物NI：5CCC△△ⅡGGGA]1AGTC但根据框内5终止密码子可判定编码区已全．该基TTcAAGTGTGAGG3；C端上游引物Cu：5GA因在成人8种组织中均有表达，其中以胰腺、肺和胎△鱼!!TTCACCATTGTCTGAGGAAG3，下盘较多(图4)．www．sclchIna．eom 维普资讯http://www.cqvip.com斟毒扛第46卷第2期2001年1月简报^G^阳GGGu圈：fA；AⅢTG∞CI瑚TTC03Tm^∞蝴~ⅢhCrCmCAⅢcGm∽TG螂TGⅢ^A脚G^鬟掘GCGC狮,CG哪C,C鲫I㈣GGGTO㈣3Ⅲ~TTc^ⅢGG3"G娜TTⅢG㈣螂㈨㈣州㈣曼i㈣AA^^_L0VLOCTGTCATTCTTCTGC3"TCTGGIlAC,CIcACC∞IC,~tCC^CTGTOGm3"TCAGTGCGGG^ccGC,CA^ccGTAPVILLLLGAHPSPLSFFS^GPATVC,CIC,CtGCC6,~tCC∞TCCAA^TGGCAc^TT~CGAT^。cGTCGGGG^^AA^TT^1TTT,~tGtTTTGG,~tAAGATC^AADRSKWHIPIPSGKNYFSFGKICTCT代hGAAATA~CAcT,~tTCTTCCTGA^0竹1GlAT∞AGAACC3"TGTGA~CI'GTCTT3"GAAT^T^ACCTGGLFRTTIFLKFDGEPCDLSLNITWTCTG^^A^GCC,CIGATTGTT^CAATGAA．~tTCTA^CTTCAAfiC,CAGAAG^AGThG^GTTGTAtT他GAAYLKSADCYNEIYNFKAEEVELYLE^MCTTA^GG^^AAAhGAfiGCITGTCfi∞^^ATCC^^AC^TeATCA^^A"GTt~CArl蛐CTC,C^GTG^AKLKEKRGLSGKIqTSSKLF0NCSEC3"CT'f3"AA^蝌cAG^ccTITTcT∞^6,~tTTTT^TGcAT∞^CTGCcTtITTIA∞^0AA~hGGAGC,CTLFKT0TFSGDFMHRLPLLGEK0E^PAilGAG^AT∞A^C^A^CCTI^ccm^TTGG^GACA¨^ccGc^^TGcATGA^CCATTGC^AACTTGGC^^KENGTNLTFIGDKT^MHEPL口TW0GAIGCACcAIACATTTtI^TTfiTAChTATTGGCATT3"CATCCTC^AAGGAATCATCAA^^G^^AATTc^CD^PYIFIVHIGISSSKESSKESLhGT^^TCtTTtI,~tCC^∞ACI"fiTTG^^GTG^AGGGTCCCnT强^TAC~TC^CAtITGAAGACTAT3"TGSLFTMTVEVKGPYEYLTLEDYPL^TGAT3"TtTTTC^WGTGATGTGTATIGTATfiTCcTGTT103TGTTCTGTGGCTGGc^TGGTCTGCCT∞—L—卫——jIVYVLFGvLwLAws^cT^CTGGhGAG,~tTCTCCTGAG^ATTCTTTIGGATI∞TGCTGTC^TCTT~CTfiC,GA^TGCTTG^GA^^C,CTL旦RDLLR10FwIG^vIFLGMLEK^GTcT代IhTflOG6^^TTTCAG^^TATCCG^T^C^从G触G^ATCIGtCCGGTGCTTIGATCcTTGc^GAG!EEF0IRYKGESV0G^LILAECTGCTTTChG^AACGcTC^CTGGcTC触^ccCT0GTCAGcATAfiTC^GTCTG∞ATATG∞^1cGTCLSAVKRSLAR1LvSIsLGYGIvAAGCC^cGC~TT∞AGTCACTCTTCAT^AGfiTTGT^GnGCAG融GccCTCT^TCTtTTGTTCICTGGCA丁G!!!!G^^GGGGTC~TC^G^GIT,~tCTGGGGccCACT∞TCTTGCTTCCTTGC,CCTTThTCCccT丁GGCTTICCTA一旦—星——L—上旦^qTDL^sLAFIPL^FLGAcACTGccTIGTGCTGGTO3ATAT3"TA订AC,CCTGACI"C^AAc^hTGACTAIT,~tAMC"cGG^∞^Ac—————————L————JFISLTqTMKLLKLRRN^”GT^ACTCWTTGIATCfiGCAITTC^cc^^CACGCTTA”TTGGc^GTGC,CAC,CATCC^”GTGITTIVKL——L————FTNTLIL^vAAsIvFATCAt~1粥ACA^cc^％GTTCAGA^nfi3"GAC^TGT㈨T∞G^CTGGcGGGAGCTGT∞GT^G^CG^T—LL———!—KFRIVTC0SDwRELwvDDC,CCATeT∞C∞TTGCTfiTTCTCCATG^TCCTCmGTCATCATGGTICTCTO3CGACC^TOTC,CAMCAAc』!!!￡!18￡§他C,~tG^∞柚TT踟TG明cC喜笔m跎TCAⅢCC,~tTm％TOⅢT∞ⅢGm0AA搅G^GG^GGAG捌GA泓tGⅢAAC^鳓A“㈣GG^㈣GCⅢOT,~tT啪G㈨6"1"6刚^M㈣螂GM㈣蚍蛳咖Ⅲ㈣曼耄㈣㈣B￡￡§PLSEEEEEDE0KEPMLKEAGCTITGAA(mm^^A^TGAGAAGT^cc^^Ac^^G^^c。C^GGAAATAGTAA^6TT^Ac^^AGCAC^GSFEGMKRSTKqEPKGNSKvKK^口G^^GATGATTTGA^GTGGGTAGAAG,~tGAATGIIccTTCTTcTGTG^C^G^TGT^C,CACTTCCAC,CCCfTCTGEDDLKWVEENVPSSVTDV^LP^LLGATTC&fiATG^GG^^∞^ATGATCACAcAcTTTGAA^∞TccAA^,~tTGG∞AATGGG,~t^G^TTTC,C／~DSDEERMITHFERSKMEGTT^从GATC,eoCT,~tCCATc^GGG^AGAGATCAGC^TCTGTGICAG76"1"ICTGT^∞GcTCcATGGG^TT^^AGG^^GCAATGACATeC1GATCTGITCCTTGATCtitC,GGcATT6GAGTTGGCG^GAfGTGTCAG^ACA,~tAG,~tG^^c^TCTtACTG^AA^CAAGTTCATA^GATG^G^^MATCT^∞^GCTTCTnm^cA^CTGC丁GCCCccTTTCCWCc^G^CTcT触C^TGGATGTTC^TGcA^cTT^AGTGTGT％TTccTGA^cT"CTGTAATGTT1c^T"TTT^从TCTGAc^AACTA^从AGTTn^cGTcTTCTAA^A∞TTGTcATC^^C^cc^T^^TATGT^mTcc^∞AGCAACTGcCTGT^^TTT”^m^”T^GGG^GTT^cAT^GG％^TGGGGG“^”G”T^CCTTTC^TTTTccT∞G^^GTCAAGGTT^cATCTTGCAG^GGT丁GTTTTG^GAA^MAGGGCccT1cT矾GTTAAGGAGCc^T^G"CT^Tc^^TG^TcAA^A∞^AA^^AA^M^^AA^^AA^圉lG肼，cDNA序列及推测的氨基酸序列图下面线部分表示G￡P具有的视紫红质样的G蛋白偶联受体超家族基序118www．搴clchlna．com 维普资讯http://www.cqvip.com简报第46卷第2期2001年1,el辫_警屯矗d2o40'6080’i)o’】粕±06±拍±’3如’30‘4440。40。26图2HGLP蛋白亲疏水性示意图箭头所指为推测的穿膜区2468101214图3HGLP基因组结构示意图3讨论3kbHGLP蛋白具有7个跨膜区，这类似于G蛋白偶联受体的结构．虽然对于G蛋白偶联受体整个家族[3-actin来讲，氨基酸序列几乎没有什么保守性，但通过寻找进化发育上相关的基序(motif)，可以将新的成员归图4fIGLP多组织NorthernNot1～8依次示成』、组织心、脑、胎盘、肺肝、骨骼肌肾、胰腺类．Motif分析将HGLP归为视紫红质样的G蛋白偶联受体超家族，推测HGLP是一个G蛋白偶联受体．2．4原核表达G蛋白偶联受体在细胞功能中发挥重要作用它将含DHFR，DHFR．HGLP-N和DHFR．HGLP．C片可以介导人体多种激素的信号传递：如肾上腺皮质激段的pET30a~阳性质粒转入BL21菌中，IPTG诱导表达素(epinephrine)、卵泡刺激素(FSH)、甲状旁腺素融合蛋白12％SDS．PAGE结果如图5第6，8道可见(parathyroidhormone)、甲状腺刺激激素(TSH)和垂体加有大量的外源蛋白．参照蛋白分子量标准，外源蛋白压素(vasopressin)等’．它可以介导人体的嗅觉、味觉大小与HGLP的N，C端多肽分子量09．6和9．8ku)和视觉1．因为嗅觉受体、视紫红质及3种色觉视锥加上D／-IFR蛋白分子量(26h)之和(456和35．8h)大细胞受体都是属于G蛋白偶联受体．此外，许多神经致相同，可见IPTG诱导后表达的外源蛋白就是我们肽类和神经递质的受体也是G蛋白偶联受体’推测的目的蛋白：HGLP的N，C端融合蛋白．有的G蛋白偶联受体还与发育有关”．这些G蛋白偶ku】2345678联受体和相应配体结合后，激活G蛋白，然后经第2信使传递信息，引起细胞内相应的生理反应．G蛋白偶联受体除了在生理活动中扮演着重要的角色外，它与疾病的关系也很密切G蛋白偶联受体的突变可以造成多种疾病如尿崩症”，最近研究表明HIV一1病毒侵入T细胞和药物的成瘾性也与G蛋白偶联受体有关由于测序技术的发展，新发现的G蛋图5HGLPN，C端融合蛋白12％SDS．PAGE图白偶联受体超家族的新成员越来越多，而对于新克隆I，2示转入pEIB0a‘质粒的BL21菌诱导前后：3．4示DHFR阳性质牡的G蛋白偶联受体来讲，其中有许多是配体和功能并诱导前后：5、6示DHFR．HGLP-N阳性质粒诱导前后．7，8示DHFR．HGLP·C阳性质粒诱导前后不明确的孤儿G蛋白偶联受体(orphanGPCR)，确定孤www．sclchlna．(：o111 维普资讯http://www.cqvip.com辫荦屯杠第46卷第2期2001年1月简报·自态·第6届全国扫描隧道微显微学会议在厦门召开第6届全国扫描隧道微显微学会议(STM’6)于2000年12月20~23日在厦门大学召开，会议由厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室主办．大会共收到论文77篇，来自全国(包括香港地区)科研院所和高等学校的91名代表出席了会议会议学术委员会主席白春札院士做了题为“SPM在纳米科技中的重要作用”的开幕报告；代表们就表面纳米科学、表面组装与生物、材料科学及仪器和技术等研究领域的成果进行了报告交流．会议还组织了议题为“中国的SPM研究现状和发展方向”的圆桌讨论会，共同研讨国际最新发展趋势和我国扫描探针显微学今后的研究重点．另有7个国内外SPM仪器厂商和公司参加了仪器展览并介绍了仪器发展的最新成果．本次会议的学术报告反映了我国SPM在原子、分子水平和纳米尺度上物理、化学性质研究的新成果和新进展，以及由此引申的纳米材料和器件等的潜在应用．主题内容包括表面纳米结构(包括金属、半导体)的制备和性能、表面有机分子组装和修饰、生物分子相互作用和SPM针尖操纵、材料表面纳米尺度上行为等的研究：在仪器和技术方面则体现出SPM与其他表面技术联用的趋势在圆桌讨论会上，代表们在肯定了我国SPM仪器研制人员对国内SPM研究的贡献后对我国SPM仪器研制现状和水平表示出忧虑，一致认为我国在SPM仪器研制方面应加强联合，尽快建立适合研制起点高、创新性强的SPM仪器设备的体制、环境和条件，以进一步推动我国纳米科技和扫描探针显微学的发展．120www．sclchlna．corn