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学校代码104599学号或申请号Z201416223密级专业硕士学位论文细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒的研制与性能评估作者姓名：杨红云导师姓名：朱大恒专业学位名称：生物工程培养院系：生命科学学院完成时间：2016年5月 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterDevelopmentandPerformanceEvaluationofaDrychemicalenzymaticmethodMultitestKitforBacterialVaginosisByHongyunYangSupervisor:Prof.DahengZhuBioengineeringSchoolofLifeScienceMay2015 学位论文原创性声明，，是本人郑重声明：所呈交的学位论文本人在导师的指导下独立进行研究所取得的成果，本论文不包含任何巧他个人。除文中己经注明引用的内容外或集体Ｕ经发表或撰写过的科研成巧。对本文的研究作山重要贡献的个人和集体，均己在文中明确方式标巧。本声明的法律贵任由本人承担。学位论义作巧：科日期：別４年＾月学位论文使用授权声明本人化导师指导下完成的论文及相关的恥务作品，巧階Ｖ产权归陆郑州火学。根据郑州乂学巧关保留，同意学校保留或向固家有关部、使用学位论义的规定ｎ或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被资阔和借阅；本人授权郑州大学可，巧Ｗ采用影印、ｌｉＵＩ夺本学位论文的全部或部分编入巧关数据库进行检索缩印或者巧他赁制手段佛存论文和汇编本学伎论文。本人离校后发丧、使用学一位论文或与该学位论文。接相义的学术论文或成巧时，巧署名单位仍然为巧。州大学。保密论文巧解密后应遵守此规走巧位论文作巧：「：么Ｉ期＾＂１训良年５１７ 摘要细菌性阴道病（bacterialvaginosis，简称BV）是妇产科常见疾病，对妇女危害较大，在妇科、产科及施行外科流产术前对BV进行快速有效的诊断具有十分重要的意义。检测BV使用的样本为阴道分泌物，其成分比较复杂，再加上BV本身不是单一细菌而是厌氧菌群感染，这就给BV检测带来很大困难，目前国内临床上尚缺乏快速有效的产品诊断BV。国外开发的BVblue产品，用酶法检测BV使此难题得以突破，但其成本高，漏检、操作复杂等因素影响其在国内的推广应用。为了满足国内对BV快速检测的需求，本论文主要用干化学酶法研制了细菌性阴道病联合试剂盒，以期获得灵敏度好、特异度高、方便、快速、经济的产品，应用于女性阴道疾病BV的诊断。研究方法和结果：1.主要原材料研究：设计了专用反应板、比色卡、对载体、底物、质控品进行筛选，并制定了相应的质量标准。2.主要工艺研究：筛选出4-氨基安替吡啉、唾液酸底物B、L-脯氨酸对硝基苯胺、溴甲酚绿作为过氧化氢、唾液酸苷酶、脯氨酸氨肽酶和pH值指标的底物，通过系列正交实验和优化实验获得每个指标的最佳配方。最终形成了产品的工艺流程图。3.体系研究：样本为阴道分泌物，加样量为30μl，反应时间为37℃15分钟，结果读取时间为温育结束后5分钟内。4.分析性能研究：对三批试剂盒分别进行检测限、特异性、准确性、重复性及批间差的考核，均满足要求。5.稳定性研究：试剂盒37℃加速破坏9天性能符合要求；模拟运输37℃震荡7天性能符合要求；实时稳定性12个月性能符合要求；反应板拆封后可稳定4小时；阴道分泌物样本采集后应在1小时内使用。6.阳性判断标准的确定：检测100份正常样本和各50份过氧化氢、脯氨酸氨基肽酶、唾液酸苷酶阳性样本，使用ROC曲线法确定这3个指标的阳性判断标准。I 7.临床研究：检测681例临床样本，BVblue试剂盒和Amsel法金标准对比结果有显著性差异，灵敏度为85.58%；本试剂盒唾液酸酶孔结果与BVblue试剂盒结果无明显差异；本试剂盒4个指标联合检测结果与Amsel法金标准对比，灵敏度为98.08%，特异性为99.48%，阳性预测值为97.14%，阴性预测值为99.65%，总符合率为99.27%。因此本试剂盒比BVblue试剂盒检出率高性能更好。结论：自行研制的细菌性阴道病联合试剂盒，方便快捷、性能稳定、灵敏度高、特异性好，能较好的应用于临床BV的诊断。关键词:细菌性阴道病快速检测试剂盒开发工艺研究性能评估临床研究II AbstractBacterialvaginal(BV)isacommondiseaseofobstetricsandgynecology,whichismuchharmfulforwomen.QuickandefficientdiagnosisofBVisimportantbeforegynecology,obstetricssurgicalandabortion.SamplesofBVarevaginalsecretions,whosecompositioniscomplicated.BVisnotinfectedbyasinglebacterialbutagroupofanaerobicbacterial,whichisdifficultforBVtest.Currently,thereisfewofefficientandeffectiveproductsforBVdiagnosis.BVbluethatdevelopedabroad,usedenzymaticmethoddetectingBVandsolvetheproblem.Butitshighcost,falsenegative,complexoperationandsoonfactorsaffectedthepopularizationandapplicationinourcountry.InordertomeetthedomesticdemandforrapiddetectionofBV,westudiedonebacterialvaginaldiseasekitsbydrychemicalenzymatic,whichhadgoodsensitivity,highdegreeofspecific,convenientoperatingandlowcosts,whichwouldapplytotheBVdiagnosis.Methodsandresults:1.Themainmaterial:designedonespecialreactionplate,colorcard.Filteredcarrier,substratesandqualitycontrol,andformulatedtherelevantqualitystandards.2.Themaintechnologicalresearch:selected4-Aminoantipyrine,sialicacidsubstratesB,L-prolineparanitroaniline,bromocresolgreenashydrogenperoxide,salivaacidglycosidesenzyme,prolineaminopeptidaseandpHindicatorssubstrates,Throughaseriesoforthogonalexperimentandoptimizationforeachindexoftheoptimalformula,flowdiagramoftheproductisformed.3.Thereactionsystemresearch:thesamplesofthiskitarevaginalsecretions,andthebestsampleamountis30μl,thereactionat37℃for15minutes,andreadtheresultafterincubationfor5minutes.4.Analysisoftheperformancestudy:analysisedthelimit,specificity,accuracy,repeatability,andassessmentofthreebatcheskits,andmeettherequirements.5.Stabilitystudies:thekitperformancewasstableandcouldmeettherequirementsacceleratedat37℃for9days.TheperformancecouldmeettheIII requirementstosimulatethetransporttestat37℃for7days.Itsperformancewasstablein12monthsunderconventionalstorageconditions.Thereactionplateonceopenedcanbestableforfourhours.Vaginalsecretionssamplesaftercollectedshouldbeusedwithinanhour.6.Positivestandardstudies:tested100normalsamplesand50positivesampleseachofhydrogenperoxide,prolineaminopeptideenzymeandsalivaacidglycosidesenzyme,usingROCcurvemethodtoestablishthethreeindicatorsofpositivejudgmentstandard.7.Clinicalresearch:thereissignificantdifferencebetweenBVbluekitandAmselgoldenstandardin681testcasesofclinicalsamples,andthesensitivityofBVbluekitis85.58%.ThereisnosignificantdifferencebetweenBVbluekitandtheindexfactorsialidaseofourkit.TheresultsofourkitusingfourindicatorsjointdetectioncomparedtoAmselgoldstandard,thesensitivitywas98.08%,specificitywas99.48%,positivepredictivevaluewas97.14%,negativepredictivevaluewas99.65%,andthetotalcoincidenceratewas99.27%.ThiskithasbetterdetectionperformancethanBVbluekit.Conclusion:ThebacterialvaginaldiseasejointdetectionkitsselfdesignedanddevelopedcanbetterappliedtoclinicaldiagnosisofBVwithconvenientandquickoperation,stableperformance,highsensitivity,andgoodspecificity.Keywords:bacterialvaginaldisease;rapiddetection;kitdevelopment;processresearch;performanceevaluation;clinicalresearchIV 目录第一章前言...........................................................................................1第二章主要原材料研究.......................................................................42.1实验材料及设备..........................................................................................42.1.1实验材料............................................................................................................42.1.2实验设备............................................................................................................42.2反应板的设计、制作及质量标准..............................................................52.2.1反应板的设计制作............................................................................................52.2.2反应板的质量标准............................................................................................52.3比色卡的设计制作及质量标准的确定......................................................62.3.1比色卡的设计制作............................................................................................62.3.2比色卡的质量标准............................................................................................62.4反应板的载体纸片的选择及质量标准的确定..........................................72.4.1载体纸片的选择................................................................................................72.4.2载体纸片的质量标准........................................................................................72.5底物的选择及质量标准的确定....................................................................82.5.1底物的选择..........................................................................................................82.5.2底物的质量标准..................................................................................................82.6质控品的选择及质量标准的确定..............................................................82.6.1质控品的选择....................................................................................................82.6.2检测限质控品和阳性质控品............................................................................82.6.3特异性质控品....................................................................................................92.6.4阴性质控品........................................................................................................9第三章试剂盒组份制备工艺研究.....................................................11V 3.1实验材料及设备........................................................................................113.1.1新出现的实验材料..........................................................................................113.1.2新出现实验设备..............................................................................................113.2样品稀释液的制备工艺研究....................................................................123.2.1成分的研究......................................................................................................123.2.2分装量的选择..................................................................................................123.3反应板的制备工艺研究............................................................................133.3.1过氧化氢试剂垫成分研究..............................................................................133.3.2唾液酸苷酶试剂垫成分研究..........................................................................143.3.3脯氨酸氨基肽酶试剂垫成分研究..................................................................173.3.4pH值试剂垫成分研究....................................................................................173.3.5试剂垫包被液加样量的选择..........................................................................183.3.6试剂垫干燥方法的确定..................................................................................183.3.7试剂垫干燥条件确定......................................................................................183.3.8反应板制备形成工艺流程图：......................................................................19第四章试剂盒反应体系研究.............................................................204.1实验材料及设备..........................................................................................204.1.1新出现的实验材料............................................................................................204.1.2新出现实验设备..............................................................................................204.2样本要求....................................................................................................204.2.1样本的类型、采集及处理..............................................................................204.2.2样本中干扰物质..............................................................................................214.3反应模式的确定........................................................................................224.3.1反应步骤的确定..............................................................................................224.3.2样本用量对比..................................................................................................234.3.3反应时间的确定..............................................................................................234.3.4颜色判定时间的确定......................................................................................24第五章试剂盒分析性能研究.............................................................26VI 5.1实验材料及设备..........................................................................................265.1.1新出现的实验材料..........................................................................................265.1.2新出现实验设备..............................................................................................265.2检测限........................................................................................................265.3特异性........................................................................................................275.4准确度........................................................................................................275.4.1阳性质控品检测结果......................................................................................275.4.2阴性质控品检测结果......................................................................................285.5重复性........................................................................................................285.6批间差........................................................................................................30第六章试剂盒稳定性研究.................................................................316.1实验材料及设备..........................................................................................316.1.1新出现的实验材料..........................................................................................316.1.2新出现实验设备..............................................................................................326.2反应板的稳定性研究................................................................................326.3检测限质控品和阳性质控品的稳定性研究............................................326.4试剂盒的加速稳定性研究........................................................................336.5成品试剂盒的模拟运输稳定性研究........................................................366.6试剂盒的拆封稳定性研究........................................................................376.7成品试剂盒的实时稳定性研究................................................................38第七章试剂盒阳性判断标准研究.....................................................467.1建立阳性判断值的方法............................................................................467.2阳性判断值建立的过程与结果................................................................467.2.1过氧化氢指标..................................................................................................467.2.2唾液酸酶指标..................................................................................................487.2.3脯氨酸氨基肽酶指标......................................................................................50第八章试剂盒的临床研究.................................................................53VII 8.1实验材料及研究方法................................................................................538.1.1实验材料..........................................................................................................538.1.2主要仪器设备..................................................................................................538.1.3样本量..............................................................................................................538.1.4样本的采集及试验设计..................................................................................538.1.5数据统计分析方法..........................................................................................548.2临床研究结果及分析................................................................................548.2.1过氧化氢孔临床结果......................................................................................548.2.2唾液酸孔临床结果..........................................................................................558.2.3BVblue试剂盒临床结果.................................................................................558.2.4考核试剂评估结果..........................................................................................568.3结论与讨论................................................................................................56结论与讨论.............................................................................................58参考文献.................................................................................................61缩略词表.................................................................................................64个人简历、在学期间发表学术论文及研究成果.................................65致谢.......................................................................................................66VIII 第一章前言阴道感染为常见的妇科病，且容易反复多发。一般情况下，正常育龄妇女阴道内寄生着多种微生物，如：乳酸杆菌、肠球菌、表皮葡萄球菌、阴道加德纳菌、大肠杆菌以及厌氧菌属的动弯杆菌、拟杆菌、消化链球菌等，这些微生[1-5]物通常保持一定的比例，维持着阴道内的生态平衡。健康女性阴道内环境利于乳酸杆菌的生长，是阴道的有益菌群，其含量占[6,7]阴道微生物种类的90%以上。95%以上的乳酸杆菌可以分解阴道上皮细胞中的糖原，使其转化成乳酸，产生的乳酸使阴道内pH值保持在3.8-4.5左右，呈[8]弱酸性，使适应碱性环境的病原微生物如厌氧菌群的繁殖受到抑制。在众多的乳酸杆菌中，大部分可以代谢产生过氧化氢，这些能产生过氧化氢的种类在维持阴道自净功能及抗感染中起着重要作用，一般情况下，过氧化氢浓度的高低直接反映乳酸杆菌数量的多少。据此可通过检测H2O2的浓度来间接反映乳酸杆菌功能正常与否。当乳酸杆菌在数量上减少时，阴道的菌群平衡状态被破坏，外来病原体容易入侵，进而大量繁殖，导致阴道炎症。临床上常见的阴道感染主要有：外阴阴道假丝酵母菌病（又称念珠菌外阴阴道炎）、细菌性阴道病、支原体感染、滴虫阴道炎。BV是指一类在细菌学上表现为阴道正常菌群(产H2O2乳酸杆菌)数量减少或消失，正常平衡存在的厌氧菌群（阴道加德纳菌、消化链球菌、普雷沃菌、[9]动弯杆菌、人型支原体、拟杆菌等）数量异常增多的临床症候群。随着近几年卫生意识的提高及洗液等外用药的宣传和不合理使用，使BV在妇产科成为常见疾病，感染率也有赶超正常人群的趋势，达到10%-50%，存在人群、人种和地域差，一般在10%-40%，且容易复发，复发率在15%-30%。BV的致病机理目前仍研究不透彻，直到1984年在斯德哥尔摩有关此病的国际会议上才将其正式[10,11]命名为细菌性阴道病。[12]BV的临床意义主要在产科，研究表明BV患者容易妊娠失败，羊水感染，[13-15]组织学绒毛膜羊膜炎，造成胎膜早破、早产，若进行剖腹产易形成剖腹产[16]后子宫内膜炎，以及一些其他的妊娠不良和并发症的危险因素。特别是对小[17]孩的影响，容易造成低体重小孩，或者直接感染，造成新生儿肺炎、新生儿脑膜炎等，并可能带来各种后遗症。另外也有数据显示，BV与盆腔炎、输卵管1 炎、不孕症、宫外孕、泌尿系感染、滴虫阴道炎、念珠菌外阴阴道炎、人免疫[19][20]缺陷病毒、衣原体感染、及妇科肿瘤有关。BV的临床症状并不明显，瘙痒，白带增多，呈现鱼腥样臭味，但50%以上[21、22]的患者也会没有这些症状。检测BV所用的样本为阴道分泌物，阴道是一个多菌群的微生态环境，纷繁复杂，这就给BV的诊断带来难度，因此临床上寻求客观、准确、简便、经济、快速的诊断方法，辅助临床诊断和治疗BV，降低并[23、24]发症具有重要意义。正常状态下，育龄妇女阴道内寄生有二十多种微生物，这些微生物通过相互制约，相互协调，处于菌群平衡状态，使阴道微生态保持平衡。阴道菌群复[25-27]杂，BV又不是单一细菌导致的疾病，单一的加特纳菌鉴定BV意义不大，因此对BV的诊断技术进展缓慢，在临床上实际应用也比较乱。Amsel等人（1983年）提出四项临床指标做为诊断BV的标准。即①阴道分泌物外观异常，稀薄如奶油状；②阴道分泌物的pH值检测大于4.5；③阴道分泌物于载玻片上滴加一滴10%氢氧化钾溶液，用鼻子去闻释放出的氨味或鱼腥样臭味，即胺试验阳性；④显微镜染色镜检发现线索细胞。这4项指标存在其中3个，线索细胞是必要[28、29]条件，就可以确诊BV。该方法近30年来，在临床上依然被认为是诊断BV的“金标准”，习惯上称之为Amsel法。此方法临床实际开展难度较大，涉及两个科室，由此衍生出单一指标的应用，单纯利用胺试验阳性诊断BV，单纯利用镜检线索细胞诊断BV，但单一指标准确性受影响且开展起来要求有一定的经验，且主观性强。另外一个BV的诊断方法是阴道分泌物革兰氏染色菌群分析，[30]即Nugent评分法。此方法普遍用于革兰氏染色菌群分类学研究，因为临床大夫需要尽快得到结果以判定是否需要进行治疗，但阴道分泌物的革兰氏染色需要较高的专业知识，所以其在临床上使用很少。在BV的检测方面，近年来对引起BV的致病菌所代谢的特异性酶类的生化[31-36][37]检测研究比较多，以唾液酸酶酶法的BVBLUE试剂盒最具代表性，它是美国Gryphus公司在90年代开发的，其申请了专利，并获FDA认证，因其相对传统方法的简便性、能快速出结果、准确性也能保障的优势在欧美国家大量使[22,23]用。但由于其底物价格昂贵，造成试剂盒本身成本高，在国内的临床应用受到限制。有学者研究发现，引起BV的厌氧菌群中,部分加德纳菌、拟杆菌及普雷沃菌唾液酸酶活性明显,而消化链球菌和动弯杆菌唾液酸酶活性不明显。导致[38-40]的BV的厌氧菌加德纳菌和动弯杆菌产生脯氨酸氨肽酶，因此，可以通过2 检测阴道分泌物中脯氨酸氨肽酶的活性是否增加来指示BV。本论文首次提出通过同时检测脯氨酸氨基肽酶活性和唾液酸苷酶活性来检测BV，避免单一酶标志物检测导致的漏检，从而更准确的检测BV。鉴于阴道的复杂微生态环境及BV本身的特点，即：正常菌群严重减少，厌氧菌群大量增加及pH升高等，本论文所研究的细菌性阴道病联合试剂盒同时用唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、过氧化氢和pH四个指标在一个反应板上检测阴道分泌物，加上联合判断模式来诊断BV，准确、简便、快速，是实验室检测技术的发展方向。依据特异性酶水解相应特异性底物分解得到的显色基团与相应的显色物质反应而显色原理，显色深浅与酶活性高低直接相关。四个指标集合于一个反应板实现了底物的微量使用，一份标本可以同时检测四个指标，短时间（15分钟）可以同时读取结果，利用标准比色卡判断是否感染细菌性阴道病。该产品研究的经济、社会效益在于开发出成本低廉、性能优良的国产细菌性阴道病联合检测试剂盒，使产品的设计更符合产品的定义本身。本论文通过实验室研究和临床应用前评价考查了开发的试剂盒的性能指标，该产品应用干化学酶法，准确、快速、方便，可以满足门诊的快速有效诊断的需求。3 第二章主要原材料研究2.1实验材料及设备2.1.1实验材料唾液酸底物B郑州伊美诺生物L-脯氨酸对硝基苯胺sigma4-氨基安替吡啉阿拉丁固紫B盐上海泽龙生物工程有限公司溴甲酚绿国药集团化学试剂有限公司唾液酸酶Sigma蛋白酶ASigmaTOOS国药集团化学试剂有限公司过氧化脲国药集团化学试剂有限公司3MM色谱层析纸美国Corning公司反应板深圳金灿华实业有限公司大肠杆菌(ATCC25922)河南省药品检定所金黄色葡萄球菌(ATCC25923)河南省药品检定所2.1.2实验设备pH计上海雷磁PHS-3C型分析天平AL204梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司水浴箱上海精宏DKB-8A型温育器科析仪器微量移液器（10、200、1000μl）美国Bio-Rad公司微量振荡器金坛科析仪器ZW-A型真空干燥机南京瑞奥电热科技有限公司比浊仪法国Biomerieux公司立式冷藏陈列柜江苏星星家电设备有限公司4 2.2反应板的设计、制作及质量标准2.2.1反应板的设计制作反应板为专用检测板，由板面和板底扣合而成，以方便载体纸片不掉出，卡上有一排四个反应孔，卡内可分别放入大小一致载体纸片，可以同时包被四种标志物，材质以不影响反应为主，考虑到四个指标中过氧化氢指标对材质比较敏感，选择过氧化氢指标作为性能影响检测。由于孔的大小直接和成本较贵的酶底物包被量相关，选择卡面孔内径4mm直径时容易出现滴加样本时试剂蓬于上面的情形，于是选择卡面孔内径为5.4mm，由于卡面扣入卡底，卡底内径设计为6.0mm。为便于观察选择大孔套小孔的内外孔结构起到放大的作用便于观察颜色；卡的厚度满足反应盛样本的需求的情况下尽可能的薄，以防止孔深不便于观察，最终选择4.2mm厚度。设计图如下：图1.1反应板外观图2.2.2反应板的质量标准外观：反应板应洁净、平整、完整无破损，卡为扣合式卡，卡体上有四个内外孔且内外无污渍，通体白色。尺寸：反应板的尺寸应满足如下：表1.1反应板尺寸标准板面孔内径板底孔内径板长板宽板厚度四孔卡5.4±0.1mm6.0±0.1mm70.0±0.1mm30.0±0.1mm4.2±0.2mm5 性能检测：配制过氧化氢指标包被液加于反应板孔内，放置5分钟不变色。2.3比色卡的设计制作及质量标准的确定2.3.1比色卡的设计制作细菌性阴道病联合试剂盒所用的比色卡为专用比色卡。是经过大量临床验证的色块要求，此比色卡包含12个色块，（比色卡外观见图1.2）。每个色块上均模切一个与四孔卡外孔大小一致的孔，待显色反应后可将比色卡置于反应孔的上方，使反应孔位于比色卡的比色孔中心，移动比色卡读取反应孔与比色卡颜色一致的色标读数，得出结果。此比色卡非常方便能快速判读结果。且能为临床结果提供客观的颜色识别效果，能更好判断，使结果更准确。图1.2比色卡外观图2.3.2比色卡的质量标准外观：比色卡对应有4个部分，共有12个色块，要求字体清晰无误，色泽亮丽无污物。依据《四色配色手册》：上海科学技术文献出版社2003年版2011年3月第5次印刷。表1.2比色卡各色块标准过氧化氢孔（第1孔）结果界定-±+黄0红20蓝0黄5红10蓝0黑黄10红5蓝0黑过氧化氢孔（第1孔）四色配色黑5006 唾液酸酶孔（第2孔）结果界定-±+黄10红0蓝0黄20红30蓝10蓝10红60黄40唾液酸酶孔（第2孔）四色配色黑5黑0黑0脯氨酸氨基肽酶孔（第3孔）结-±+果界定脯氨酸氨基肽酶孔（第3孔）四黄10红0蓝0黄30红0蓝5黑黄50红0蓝5黑色配色黑500pH孔（第4孔）结果界定4.14.44.6黄10红0蓝0黄20红20蓝0黑黄5红20蓝0黑pH孔（第4孔）四色配色黑5002.4反应板的载体纸片的选择及质量标准的确定2.4.1载体纸片的选择经滤纸、滤膜、无纺布、玻璃纤维、色谱层析纸等材质的选择，即分别进行过氧化氢、唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、pH值进行性能检测、渗入性考察及加速稳定性后的各性能考察，最终选择厚度为0.6mm的3MM色谱层析纸作为包被四种试剂的载体，显色好，渗入性好且不影响四种试剂的性能。考虑到试剂成本高，选择纸片的直径越小越好，同时满足颜色易于识别，选择6.0mm直径的3MM色谱层析纸。2.4.2载体纸片的质量标准1）外观：干净、批间及批内颜色一致。2）尺寸：直径6.0mm。3）试验影响：待检载体纸片与合格载体纸片同时制备相应试剂垫，检测检测限质控品，特异性质控品，结果要求渗入性一致，显色结果一致。7 2.5底物的选择及质量标准的确定2.5.1底物的选择根据检测过氧化氢、唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、pH值的反应原理，及快速反应的需求选择的底物分别对应为4-氨基安替吡啉、唾液酸底物B、L-脯氨酸对硝基苯胺、溴甲酚绿。2.5.2底物的质量标准（1）外观：包装应完整、无破损、无污渍，标示清晰，厂家、规格无误，固体试剂颜色及结晶状态批间无明显差异。（2）密封性：包装应密封完好，无吸潮变质现象。（3）试剂外观：应均一无杂质、无污渍。（4）试验影响：待检底物及合格底物同时制备试剂垫，检测检测限质控品，特异性质控品结果一致，且满足37℃加速破坏7天，检测限质控品和特异性质控品结果满足要求。2.6质控品的选择及质量标准的确定2.6.1质控品的选择由于酶购置和使用都比较方便，因此唾液酸酶孔和脯氨酸氨基肽酶孔均选择酶溶液建立质控参考品，分别为神经氨酸酶和蛋白酶E；对于过氧化氢孔选择过氧化脲作为此孔的质控品参考品物料，因过氧化脲的主要活性成分是过氧化氢，且是固体易于保障批间配制差异；三种质控参考品均采用高低两个浓度，具体浓度的确定以临床检测为准。对于pH值孔采用pH4.6和pH4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。2.6.2检测限质控品和阳性质控品表1.3检测限质控品的浓度及检测结果项目检测限质控品要求检测结果过氧化氢10mg/ml过氧化脲呈色不得浅于“±”的颜色±唾液酸酶0.03U/mL唾液酸酶呈色不得浅于“±”的颜色±8 脯氨酸氨基肽酶100U/mL蛋白酶E呈色不得浅于“±”的颜色±pHpH4.4的柠檬酸缓冲液呈色不得深于“4.4”的颜色±表1.4阳性质控品的浓度及检测结果项目阳性质控品要求检测结果过氧化氢20mg/ml过氧化脲呈色不得浅于“-”的颜色-唾液酸酶0.06U/mL唾液酸酶呈色不得浅于“+”的颜色+脯氨酸氨基肽酶200U/mL蛋白酶E呈色不得浅于“+”的颜色+pHpH4.6的柠檬酸缓冲液呈色不得浅于“>4.5”的颜色>4.52.6.3特异性质控品a）大肠杆菌(ATCC25922)特异性质控品(简称特异性质控品D)：挑取营养琼脂平板35℃-37℃培养24h-48h的大肠杆菌(ATCC25922)菌落于0.85%生理盐水中充分混匀使其浊度为1麦氏，即得大肠杆菌(ATCC25922)特异性质控品。b）金黄色葡萄球菌(ATCC25923)特异性质控品(简称特异性质控品J)：挑取营养琼脂平板35℃-37℃培养24h-48h的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌落于0.85%生理盐水中充分混匀使其浊度为1麦氏，即得金黄色葡萄球菌(ATCC25923)特异性质控品。表1.5特异性质控品的检测结果特异性质控品D特异性质控品J项目要求检测结果要求检测结果过氧化氢++++唾液酸酶----脯氨酸氨基肽酶----2.6.4阴性质控品选取0.85%生理盐水作为阴性质控品。9 表1.6阴性质控品的检测结果项目要求检测结果过氧化氢阴性+唾液酸酶阴性-脯氨酸氨基肽酶阴性-pH阴性-10 第三章试剂盒组份制备工艺研究3.1实验材料及设备本部分只显示新出现的实验材料及设备，其他见前面相关内容。3.1.1新出现的实验材料一水合柠檬酸北京益利精细化学品有限公司柠檬酸钠北京益利精细化学品有限公司巯基乙醇国药集团化学试剂有限公司氯化钠国药集团化学试剂有限公司BB2蛋白保护剂武汉博士德生物工程有限公司海藻糖国药集团化学试剂有限公司Proclin300SIGMATris国药集团化学试剂有限公司HRPSIGMA磷酸氢二钠天津市科密欧化学试剂开发中心磷酸二氢钾天津市科密欧化学试剂开发中心氯化钾天津市科密欧化学试剂开发中心氢氧化钠天津市科密欧化学试剂开发中心聚乙二醇6000天津市科密欧化学试剂开发中心念珠菌(ATCC10211)河南省药品检定所沙保罗琼脂琼脂平板郑州安图生物工程股份有限公司3.1.2新出现实验设备超低温冰箱美国赛默飞世尔科技普通显微镜OlympusCX41包装机上海金标生物科技有限公司压卡机上海金标生物科技有限公司11 联检分析仪郑州安图实验仪器有限公司3.2样品稀释液的制备工艺研究3.2.1成分的研究考虑到本检测涉及到4项指标，主要是针对酶的检测，由于同时还要兼顾医院处理后样本可能培养，因此选择了既适用于培养又不干扰酶检测的生理盐水，为了防止稀释液长期放置后长菌影响样本的检测，故在生理盐水中加入了Proclin300，加入浓度以我公司产品经验浓度。考察加入Proclin300的生理盐水是否对样本的培养有影响。A:0.85%生理盐水B:0.85%生理盐水+0.005%Proclin300分别用上述2种稀释液配制2麦氏的念珠菌(ATCC10211)菌悬液，稀释到4310cfu/ml、10cfu/ml，取100μl涂沙保罗琼脂琼脂平板，放置在37℃的培养箱中培养。24小时后观察平板，统计结果如表2.1所示：表2.1稀释液配方选择单菌落数目AB410cfu/ml161177165172179173310cfu/ml213027262930以上结果可知，念珠菌(ATCC10211)经稀释液A和稀释液B分别处理后的生长情况基本一致。为了防止稀释液长菌的风险，选择0.85%生理盐水+0.005%Proclin300作为样本稀释液。3.2.2分装量的选择考虑到稀释液用于样本处理，处理后的样本液满足检测4项指标用量要求，且达到最佳反应，我们以50μl/滴，滴加8滴处理样本，洗脱不同拭子后剩余样本量在200μl~290μl，然后以30μl、35μl、40μl进行4项检测，20μl加样量样本过少，温育过程容易干，而40μl的加样量本底色加深，因此选择30μl的加样量，保障反应的进行，又不影响底物成本的增加，这样四个孔需要120μl的样本量，样本残留80μl~170μl，说明样本稀释液加8滴能满足检测量的需要，且对检测无12 明显影响，而反应量选择约30μl/孔即可。同时考虑试剂残留等因素，分装量16±1ml/瓶。3.3反应板的制备工艺研究此产品属于干化学酶法，整个产品的组成一瓶样品稀释液，20个反应板，因此反应板四个试剂垫的配方研究是关键，四个试剂垫相当于四个各自独立的系统，检测不同的物质，为了便于分析颜色结果以筛选出最优的配方，研发阶段引入联检分析仪进行颜色数值的读取分析，配方筛选以阳性结果颜色深，阴性结果或是干扰结果颜色浅好，也就是二者的差异大好。考虑到临床样本单人份样本量少，不易保存且可重复性差的问题，我们选用BSA配制酶检测限质控品和阳性质控品，大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)作为干扰性质控品，配方筛选参照下面公式：△M=A限+A阳-D-J其中△M为阳性结果与干扰性结果的差值，A限为相应检测限质控品联检分析仪检测值，A阳为相应阳性质控品联检分析仪检测值，D为大肠杆菌(ATCC25922)干扰性质控品联检分析仪检测值，为金黄色葡萄球菌(ATCC25923)干扰性质控品联检分析仪检测值。对于pH孔则采用△N=A4.6-A4.4，其中△N为pH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液与pH为4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液检测结果的差值，A4.6为pH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液质控品联检分析仪检测值，A4.4为pH为4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液质控品联检分析仪检测值。3.3.1过氧化氢试剂垫成分研究反应原理为在过氧化物酶作用下样本中的过氧化氢释放出新生态氧，在4-氨基安替吡啉存在下，使TOOS氧化呈红色或紫红色，通过初步试验筛选出显色好的方案基础上进行上下设计正交试验，来确定各主要组份，实验结果见表2.2：表2.2过氧化氢试剂垫配方筛选四因素三水平正交试验结果因素4-氨基安替TOOS过氧化物酶巯基乙醇实验结果比林（mg/ml）（g/100ml）（g/100ml）（%，v/v）△M值试验10.310.010.0051513 试验20.320.020.0128试验30.330.030.0211试验40.610.020.028试验50.620.030.00523试验60.630.010.0118试验70.910.030.0112试验80.920.010.029试验90.930.020.00514表2.3过氧化氢试剂垫配方筛选正交试验直观分析表4-氨基安替比林TOOS过氧化物酶巯基乙醇因素（g/100ml）（g/100ml）（g/100ml）（%，v/v）均值118.00011.66714.00018.000均值216.33320.00017.33319.333均值312.33315.00015.3339.333极差5.6678.3333.33310.000由此直观分析表2.3可以看出，巯基乙醇浓度是对结果影响最大的因素，而过氧化酶则是影响最小的因素。四因素最佳的水平组合是：4-氨基安替比林3mg/ml，TOOS20mg/ml，过氧化物酶0.2mg/ml，巯基乙醇0.01%，也就是试验2方案，经再次确认此组合确实反应好，选择试验2方案作为最终配方。3.3.2唾液酸苷酶试剂垫成分研究反应原理为样本中含有的唾液酸酶，会和特异性底物唾液酸底物B反应，在固紫B盐的作用下呈现红色或紫色，呈色深度与唾液酸酶活性成正比。酶反应主要和缓冲液、pH及底物浓度相关，下面分别研究：3.3.2.1不同pH的影响14 通过试验及临床研究发现唾液酸底物B反应的最佳条件为酸性，即pH约在4.0~4.5范围，选择不同pH的0.1M柠檬酸缓冲液进行对比研究，实验结果见图2.1：图2.1不同pH值的0.1M柠檬缓冲液唾液酸酶试剂垫△M值结果由图2.1可以看出，使用0.1M柠檬酸-柠檬酸钠pH在4.5优于其它pH，显色最好。3.3.2.2不同底物浓度影响底物浓度与产品成本和显色效果产生主要影响，对比不同浓度唾液酸底物B，实验结果见下表：表2.4唾液酸底物B浓度的选择浓度(mg/ml)0.20.250.30.350.4△M值1013.413.413.513.4结果显示随着唾液酸底物B浓度的增加，显色趋于稳定，出于成本的考虑选择0.25mg/ml。3.3.2.3唾液酸酶试剂垫配方筛选正交试验结果15 考虑到反应体系中不加入固紫B盐，37℃温育反应15分钟，呈现蓝色，灵敏度欠佳，因此增加了固紫B盐（偶氮盐）缩短显色时间增加显色的视觉效果。由此根据单因素分析结果，对0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、底物浓度、海藻糖4浓度及固紫B盐浓度四因素，采用L9（3）正交表，配制成9种不同的试剂垫，37℃破坏7天后检测唾液酸酶孔的△M值。4表2.5唾液酸酶试剂垫配方筛选L9（3）正交试验结果0.1M柠檬酸底物B浓度固紫B盐浓海藻糖浓度实验结果因素缓冲液pH（mg/ml）度（mg/ml）（mg/ml）△M值试验14.20.220.20.29试验24.20.250.30.513.5试验34.20.280.40.810.8试验44.50.220.30.812.5试验54.50.250.40.212试验64.50.280.20.511试验74.80.220.40.512试验84.80.250.20.813试验94.80.280.30.214.5表2.6唾液酸酶试剂垫配方筛选正交试验直观分析表0.1M柠檬酸缓底物B浓度固紫B盐浓度海藻糖浓度因素冲液pH（mg/ml）（mg/ml）（mg/ml）均值111.10011.16711.00011.833均值211.83312.83313.50012.167均值313.16712.10011.60012.100极差2.0671.6662.5000.334由此直观分析表2.6可以看出，固紫B盐浓度是对结果影响最大的因素，而海藻糖则是影响最小的因素。四因素最佳的水平组合是：pH为4.8的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，唾液酸底物B浓度0.25mg/ml，固紫B盐浓度0.3mg/ml，16 海藻糖浓度0.5mg/ml。将此最佳组合和正交试验9个试验中结果最好的试验9方案重新验证，两者的△M值均为14.6，考虑到底物成本，配方筛选的结果为：pH为4.8的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，唾液酸底物B浓度0.25mg/ml，固紫B盐浓度0.3mg/ml，海藻糖浓度0.5mg/ml。3.3.3脯氨酸氨基肽酶试剂垫成分研究反应原理为脯氨酸氨基肽酶水解特异性底物呈现黄色，呈色深度与脯氨酸氨基肽酶活性成正比。主要特异性底物为L-脯氨酸-对硝基苯胺，通过试验及临床研究发现此底物最适反应条件为偏碱性，经不同pH缓冲溶液的验证，pH值在7.0~8.0的Tris-HCl显色最好，实验结果见表2.7：表2.7不同pH对脯氨酸氨基肽酶试剂垫显色影响pH6.57.07.58.08.5脯氨酸氨基9191918.812肽酶△M表2.8L-脯氨酸対硝基苯胺浓度的选择浓度（mg/ml）236810脯氨酸氨基1016191919肽酶△M不同浓度底物实验结果见表2.8，显示L-脯氨酸-对硝基苯胺浓度为6mg/ml，pH值在7.0~8.0的Tris-HCl缓冲液时显色最佳。3.3.4pH值试剂垫成分研究通过临床及相关资料发现女性阴道正常白带的pH为酸性环境，即pH小于4.5，如果感染BV或滴虫，pH值会明显升高，大于4.5，有的甚至达到6，因此选择指示剂为溴甲酚绿作为考察，用0.02M的NaOH作为溶剂，。表2.9溴甲酚绿浓度对pH试剂垫显色影响浓度（mg/ml）23681017 pH值试剂垫1016191919△N不同浓度溴甲酚绿实验结果如表2.9，分析可知采用0.02M的NaOH，6mg/ml溴甲酚绿作为pH值试剂垫的最佳配方。3.3.5试剂垫包被液加样量的选择过氧化氢试剂垫、唾液酸苷酶试剂垫、脯氨酸氨基肽酶试剂垫、pH试剂垫分别采用每纸片5μl、10μl及15μl的分装量，发现5μl扩散不均匀，需要精度太高，变异较大，不易控制，且加到纸片上与未加的纸片难以区分，实际生产时难以操作；分装量为15μl时，纸片完全浸润，稍有溢出，容易损耗试剂，每个纸片的实际加样量也难以控制；最终我们选择了10μl分装量，扩散均匀且无溢出，加样量适中，容易操作。3.3.6试剂垫干燥方法的确定影响干燥的因素有分装量、温度、湿度及时间；干燥的方式有烘干、抽干和真空干燥三种方式。考虑到过氧化氢试剂垫、唾液酸苷酶试剂垫、脯氨酸氨基肽酶试剂垫、pH试剂垫需要固化的试剂本身性质，不耐高温且接触空气的时间不能太长，结合分装量小的特点，选择真空干燥，不受湿度的影响。3.3.7试剂垫干燥条件确定对各试剂垫分别进行真空干燥，设定不同干燥温度和时间，干燥的程度和放入的湿试剂垫的量有关系，此验证均按满箱操作为准，由于干燥温度高于45℃对底物有影响，因此干燥温度选择25℃和37℃进行考察，干燥后观察各纸片外观及干燥后放入37℃加速破坏7天后分别进行检测限质控品、阳性质控品及特异性质控品检测，判断标准纸片外观变化、质控品检测不符合要求均判为不合格，否则合格。具体结果见表2.10：表2.10各试剂垫干燥温度和时间影响过氧化氢唾液酸酶脯氨酸氨基肽酶pH25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃10min××××××××18 20min××××××××30min×√×√×√×√40min×√×√×√×√50min√√√√√√√√注：“√”表示合格，“×”表示不合格。结果显示：25℃干燥不能达到完全干的目的，最终选择37℃干燥30分钟。3.3.8反应板制备形成工艺流程图根据研究与测试，形成工艺流程图如图2.2。图2.2反应板制备工艺流程图图2.2反应板制备工艺流程图19 第四章试剂盒反应体系研究反应体系研究主要包括样本的采集和处理、样本用量、反应条件、试剂用量和温育时间等。4.1实验材料及设备本部分只显示新出现的实验材料及设备，其他见前面相关内容。4.1.1新出现的实验材料四环素上海新亚药业有限公司头孢噻肟钠上海新亚药业有限公司旋盖滴瓶沧州盛丰塑胶制品有限公司塑料试管江苏康健医疗用品有限公司女性拭子江苏康健医疗用品有限公司快速革兰氏染色液珠海贝索生物技术有限公司4.1.2新出现实验设备隔水式电热恒温培养箱江苏常州首创设备有限公司海尔冰箱青岛海尔4.2样本要求4.2.1样本的类型、采集及处理采集：样本类型为阴道分泌物,用无菌拭子或无菌棉签取阴道分泌物，拭子或棉签于阴道后位或后穹窿处旋转10-20秒，以能清晰看到分泌物附着为准，所采样本应新鲜。处理：样本因是阴道分泌物，阴道分泌物成分复杂，主要包含宫颈分泌的黏液、阴道黏膜的渗出物、子宫和阴道脱落的表皮细胞，菌等。阴道分泌物的多少受体内雌激素水平影响，采集样本也一般使用无菌拭子或无菌棉签，采集20 的量都不会太多，易干，放置时间长，容易导致分泌物中的菌死亡，或者成分的分解变化，pH产生变化，因此分道分泌物样本要求采集1小时内进行稀释处理。4.2.2样本中干扰物质对于此产品干扰主要是药物、精子和带血样本，采样应避开用药期（停药3天）、性生活后和经期。此产品是根据颜色判断结果，若样本为带血样本，血液本身含血红素，会干扰颜色的判断，因此带血样本不可用于本产品的检测。精子本身含有丰富的酶活，精子的存在影响大部分酶的检测。在阴道的酸性环境下，性生活后的精子存活时间不超过8小时，酸度越强，死亡越快。取新鲜精液1份，用该产品的反应板检测为阴性的阴性样本稀释成精子数量为5-12个/HP，即2-3个精子/油镜视野时，检测四个指标的情况见下表：A：检测限质控品（pH孔为4.4缓冲液）B：阳性质控品（pH孔为4.6缓冲液）C：阴性样本D：阴性样本稀释精液使含精子数为5-12个/HP表3.1含精子样本对检测的影响四个指标ABCD过氧化氢±-++唾液酸酶±+--脯氨酸氨基肽酶±+-+pH≤4.5>4.5≤4.5>4.5结果显示精子样本对过氧化氢和唾液酸酶指标无影响，对脯氨酸氨基肽酶和pH指标有影响，会造成脯氨酸氨基肽酶指标假阳性，pH值偏高，因此应避免24小时内性生活。对于药物的干扰，因临床药物品种较多，药物对酶的检测可能产生干扰，选取了临床常用四环素及头孢进行验证看是否有影响，方法一般选择在临床样本中添加干扰物质纯品的方法进行验证，每种干扰物质的考查选择两份低高浓21 度的阴道分泌物样本，每份样本分成两份，其中一份作为对照，在另外一份中添加待考察的干扰物质，以未添加干扰物质的样本作为对照，试验结果表明13mg/ml的四环素对测定结果有影响，容易造成BV假阴性、4mg/ml的头孢噻肟钠样本对检测无干扰，结果如表3.2和3.3。表3.2四环素药物对检测的影响脯氨酸氨基四环素过氧化氢唾液酸酶pH肽酶对照±±±≤4.5样本1测试+--≤4.5对照-++>4.5样本2测试±±±>4.5表3.3头孢噻肟钠药物对检测的影响脯氨酸氨基头孢噻肟钠过氧化氢唾液酸酶pH肽酶对照±±±≤4.5样本1测试±±±≤4.5对照-++>4.5样本2测试-++>4.54.3反应模式的确定4.3.1反应步骤的确定细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒的反应原理是依据导致细菌性阴道病的厌氧菌特异性酶分解底物得到的显色基团与相应的显色物质反应而显色的原理进行检测，显色的深浅和酶的活性成正比。因是酶反应就需要温度和时间保障反应的正常进行，本试剂盒的反应步骤确定为试管中充分处理样本，在反应孔中各加入1滴样本液，然后放置37℃条件下温育15分钟反应，结束后进行目测判断结果或者联检分析仪读取结果。22 4.3.2样本用量对比在反应体系中，样本的用量直接影响试剂盒的灵敏度等试剂盒性能指标。常见的标本加样量为20µl，30µl，50µl等几个刻度，为确定样本用量经济节省且能满足试剂性能要求的样本量，需综合考虑不同加样量条件下产品性能影响情况，从而确定满足试剂盒性能设计要求的加样量。20µl的加样量在37℃温育15分钟容易导致纸片较干，影响整个反应的进行，而50µl的加样量又导致一些干扰的本底色加重，因此本试剂盒选择30μl作为试剂盒的加样量，以保证较好的灵敏度和临床性能。30μl样本量对检测的影响见表3.4。表3.430μl样本量对检测的影响过氧化氢唾液酸酶脯氨酸氨基肽酶pH检测限质控品±±±≤4.5阳性质控品-++>4.5干扰性质控品D+-->4.5干扰性质控品J+-->4.5阴性样本1±--≤4.5阴性样本2---≤4.5阴性样本3±--≤4.5阳性样本1+++>4.5阳性样本2++±>4.5阳性样本3+±+>4.54.3.3反应时间的确定此产品定位是门诊样本的随到随测，患者需要在30分钟内拿到检测结果，也就是越快越好，既要保障快，又要保证酶反应的时间需求，能在20分钟内完成检测最好，于是我们考察了温育10分钟和15分钟反应情况，通过比较不同的反应时间（见表3.5），可以看出，15分钟的灵敏度更好，且满足临床需求。表3.5不同温浴时间的检测对比过氧化氢唾液酸酶脯氨酸氨基肽酶10分钟15分钟10分钟15分钟10分钟15分钟23 检测限质控品+±-±-±阳性质控品±--±-±干扰性质控品D++----干扰性质控品J++----4.3.4颜色判定时间的确定反应板温育结束后判读时间，分别在1分钟、3分钟、5分钟进行检测限质控品和5份临床样本进行分析，检测限质控品颜色的变化见表3.5，临床样本颜色变化见表3.6；检测限质控品检测结果符合设计要求（满足色块要求）。临床样本检测见表3.7，在1分钟到5分钟内没有明显的变化。因此，本试剂盒颜色判断时间可以温育结束后到5分钟任意时间。表3.6检测限质控品不同测量时间颜色的变化检测限质控品1分钟3分钟5分钟7分钟过氧化氢±±±-唾液酸酶±±±+脯氨酸氨基肽酶±±±+pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5表3.7临床样本不同测量时间颜色的变化样本指标1分钟3分钟5分钟7分钟过氧化氢±±±+唾液酸酶----1脯氨酸氨基----肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢++++唾液酸酶±±±+2脯氨酸氨基±±±+肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.524 过氧化氢++++唾液酸酶±±±+3脯氨酸氨基±±±+肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢++++唾液酸酶±±±+4脯氨酸氨基±±±+肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢++++唾液酸酶±±±+5脯氨酸氨基±±±+肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.525 第五章试剂盒分析性能研究本试剂盒的分析性能评估主要包括检测限、特异性、准确度、重复性和批间差。通过对三批产品（产品批号：20150309、20150312、20150318）的分析性能评估结果进行分析，验证各项指标是否符合实验设计要求。5.1实验材料及设备本部分只显示新出现的实验材料及设备，其他见前面相关内容。5.1.1新出现的实验材料20150309批待评估试剂盒郑州安图生物工程股份有限公司20150312批待评估试剂盒郑州安图生物工程股份有限公司20150318批待评估试剂盒郑州安图生物工程股份有限公司5.1.2新出现实验设备HY-5型回旋式振荡器金坛市科析仪器有限公司5.2检测限用三批检测限质控品检测，目测比对标准比色卡和联检分析仪检测，结果见表4.1，过氧化氢孔、唾液酸酶孔和脯氨酸氨基肽酶孔均满足“±”；pH孔满足“>4.5”的要求，且无明显差异。表4.1三批试剂盒检测限结果20150309批2015031220150318项目要求检测结果检测结果检测结果过氧化氢±±±±唾液酸酶±±±±脯氨酸氨基肽酶±±±±pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.526 由以上结果可知检测限满足质量标准要求。5.3特异性用特异性质控品D即大肠杆菌（ATCC25922）和特异性质控品J即金黄色葡萄球菌（ATCC25923）检测，目测比对联检比色卡和用联检分析仪检测，结果应符合过氧化氢孔“+”；唾液酸酶孔“-”；脯氨酸氨基肽酶孔“-”；pH孔“>4.5”要求。检测结果见表4.2。表4.2三批试剂盒特异性检测结果20150309批检测结果20150312检测结果20150318检测结果项目要求特异性特异性特异性特异性特异性特异性质控品D质控品J质控品D质控品J质控品D质控品J过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------脯氨酸氨-------基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5以上结果可知，特异性结果符合质量标准的要求。5.4准确度用阳性质控品同时检测3块反应板，目测比对联检比色卡和用联检分析仪检测，结果应符合过氧化氢孔“-”；唾液酸酶孔“+”；脯氨酸氨基肽酶孔“+”；pH孔“>4.5”要求；用阴性质控品同时检测3块反应板，目测比对联检比色卡和用联检分析仪检测，结果应符合过氧化氢孔“+”；唾液酸酶孔“-”；脯氨酸氨基肽酶孔“-”；pH孔“>4.5”要求。5.4.1阳性质控品检测结果见表4.3。27 表4.3三批试剂盒阳性质控品检测结果项目要求20150309批检测结果20150312检测结果20150318检测结果123123123过氧化氢----------唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋脯氨酸氨＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.55.4.2阴性质控品检测结果见表4.4。表4.4三批试剂盒阴性质控品检测结果20150309批检测结果20150312检测结果20150318检测结果项目要求123123123过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶----------脯氨酸氨----------基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5以上结果可知，三批产品阴阳性质控品检测结果均符合质量标准的要求。5.5重复性用检测限质控品检测10个反应板，检测结果的一致性应不低于90%。结果见表4.5-4.7。28 表4.520150309批试剂盒重复性检测结果项目一致性20150309批检测结果一致性要求结果12345678910过氧化氢≥90%±±±±±±±±±±100%唾液酸酶≥90%±±±±±±±±±±100%脯氨酸氨≥90%±±±±±±±±±±100%基肽酶pH≥90%≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5100%表4.620150312批试剂盒重复性检测结果项目一致性20150312批检测结果一致性要求12345678910结果过氧化氢≥90%±±±±±±±±±±100%唾液酸酶≥90%±±±±±±±±±±100%脯氨酸氨≥90%±±±±±±±±±±100%基肽酶pH≥90%≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5100%表4.720150318批试剂盒重复性检测结果项目一致性20150318批检测结果一致要求性结12345678910果过氧化氢≥90%±±±±±±±±±±100%唾液酸酶≥90%±±±±±±±±±±100%脯氨酸氨≥90%±±±±±±±±±±100%基肽酶≤≤≤≤≤≤≤≤≤≤pH≥90%100%4.54.54.54.54.54.54.54.54.54.529 以上结果可知，重复性检测结果符合质量标准的要求。5.6批间差取三个批次试剂盒，用检测限质控品检测，每个批次重复检测10次，三个批次检测结果的一致性应不低于90%。结果见表4.8。表4.8三批试剂盒批间差检测结果一致三批批间差检测结果项目性要一致求批次12345678910性第1批±±±±±±±±±±过氧≥第2批±±±±±±±±±±100%化氢90%第3批±±±±±±±±±±第1批±±±±±±±±±±唾液≥第2批±±±±±±±±±±100%酸酶90%第3批±±±±±±±±±±脯氨第1批±±±±±±±±±±酸氨≥第2批±±±±±±±±±±100%基肽90%第3批±±±±±±±±±±酶第1批±±±±±±±±±±≥pH第2批±±±±±±±±±±100%90%第3批±±±±±±±±±±以上结果可知，三批产品无批间差异，检测结果符合质量标准的要求。30 第六章试剂盒稳定性研究稳定性试验的目的是考察产品随存放时间变化的规律，为产品的生产、包装、储存、运输条件提供科学依据，同时通过试验确定产品的保存和使用期限。试剂盒的稳定性研究内容分别为：各组分加速破坏稳定性，内控品的加速稳定性，完整试剂盒的加速稳定性、模拟运输稳定性、试剂盒实际长期保存稳定性，试剂盒实际使用拆封稳定性等。加速稳定性即采用过度的条件来增加产品的化学或物理降解的速度，从而预测其有效期。依据经验推导公式：成品2-8℃储存有效期为18个月应在37℃环境下考核9天；拆封稳定性为保证用户在使用过程中试剂盒的有效性，对试剂盒反应板进行了拆封后的稳定性研究；运输稳定性研究：为保证用户在使用过程中试剂盒的有效性，对试剂盒进行了运输稳定性研究。运输稳定性主要依据试剂盒在运输过程中可以遇到的高温、撞击等影响，模拟运输过程，将试剂盒分别放在37℃条件下，用振荡器连续振荡模拟车载处理9天，取出后与2～8℃条件下对照，验证试剂盒经过常温运输后的有效性；实时稳定性研究：按照试剂盒预期规定的储存方式（2-8℃）储存试剂，考核原则在第0、3、6、9、12个月进行性能考核，考核结束在37℃条件下，再振荡3天，考察实际储存后的运输稳定性。6.1实验材料及设备本部分只显示新出现的实验材料及设备，其他见前面相关内容。6.1.1新出现的实验材料20150112批阳性质控品郑州安图生物工程股份有限公司20150120批阳性质控品郑州安图生物工程股份有限公司20150125批阳性质控品郑州安图生物工程股份有限公司20150112批检测限质控品郑州安图生物工程股份有限公司20150120批检测限质控品郑州安图生物工程股份有限公司20150125批检测限质控品郑州安图生物工程股份有限公司31 6.1.2新出现实验设备分析天平北京赛多利斯仪器有限公司超净工作台YJ-1450DB吴江市净化设备总厂隔水式电热恒温培养箱BG80杭州汇尔仪器设备有限公司加热回旋振荡器HZQ-50H上海一恒科学仪器有限公司6.2反应板的稳定性研究三个批次的反应板经37℃9天的破坏后，与4℃放置的同批次反应板平行对比检测限质控品，颜色无明显变化，组份的稳定性较好。实验结果表明，三批次反应板加速稳定性良好（见表5.1）。表5.1三批次反应板的稳定性对比批次20150309批检测结果20150312检测结果20150318检测结果检测项4℃37℃9天4℃37℃9天4℃37℃9天过氧化氢±±±±±±唾液酸酶±±±±±±脯氨酸氨±±±±±±基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.56.3检测限质控品和阳性质控品的稳定性研究个批次的检测限质控品和阳性质控品经37℃9天的破坏后，与4℃放置的同批次质控品平行对比，用配套的试剂盒（20150309批）进行检测，观察放置加速前后质控品反应颜色的变化，颜色无明显差异，则质控品的稳定性较好。实验结果表明三个批次的检测限质控品和阳性质控品经37℃加速破坏9天后颜色无明显差异，检测限质控品和阳性质控品的加速稳定性良好。表5.2三批检测限质控品稳定性对比批次20150112批检测结果20150120检测结果20150125检测结果检测项4℃37℃9天4℃37℃9天4℃37℃9天32 过氧化氢±±±±±±唾液酸酶±±±±±±脯氨酸氨±±±±±±基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5表5.3三批阳性质控品稳定性对比批次20150112批检测结果20150120检测结果20150125检测结果检测项4℃37℃9天4℃37℃9天4℃37℃9天过氧化氢±±±±±±唾液酸酶±±±±±±脯氨酸氨±±±±±±基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.56.4试剂盒的加速稳定性研究分别制备三个批次的样品稀释液和反应板，两种组份组装成成品试剂盒。三批次的试剂盒均放置37℃破坏9天，若整套试剂盒经过37℃破坏后，试剂盒设定的检测限、特异性、准确性性能指标均能满足，试剂盒的加速稳定性满足要求。实验结果如表5.4-5.9所示，各批次试剂盒经37℃破坏9天，颜色无明显变化，检测限、特异性、准确性性能指标满足要求，依据从加速稳定性推导试剂盒有效期的经验方法，试剂盒的有效期可达到18个月，大于设定的12个月的有效期的标准，最终确定试剂盒实际的有效期还要看实时稳定性的考查结果。表5.420150309批试剂盒检测限、特异性对比结果（第一批）检测限特异性质控品D特异性质控品J项目4℃37℃9天4℃37℃9天4℃37℃9天过氧化氢±±＋＋＋＋唾液酸酶±±----脯氨酸氨±±----33 基肽酶pH≤4.5≤4.5>4.5>4.5>4.5>4.5表5.520150309批试剂盒准确性对比结果（第一批）阳性质控品阴性质控品项目4℃37℃9天4℃37℃9天123123123123过氧化氢------＋＋＋＋＋＋唾液酸酶＋＋＋＋＋＋－－－－－－脯氨酸氨＋＋＋＋＋＋－－－－－－基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5表5.620150312批试剂盒检测限、特异性对比结果（第二批）检测限特异性质控品D特异性质控品J项目4℃37℃9天4℃37℃9天4℃37℃9天过氧化氢±±＋＋＋＋唾液酸酶±±----脯氨酸氨±±----基肽酶pH≤4.5≤4.5>4.5>4.5>4.5>4.5表5.720150312批试剂盒准确性对比结果（第二批）阳性质控品阴性质控品项目4℃37℃9天4℃37℃9天123123123123过氧化氢------＋＋＋＋＋＋唾液酸酶＋＋＋＋＋＋－－－－－－34 脯氨酸氨＋＋＋＋＋＋－－－－－－基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5表5.820150318批试剂盒检测限、特异性对比结果（第三批）检测限特异性质控品D特异性质控品J项目4℃37℃9天4℃37℃9天4℃37℃9天过氧化氢±±＋＋＋＋唾液酸酶±±----脯氨酸氨±±----基肽酶pH≤4.5≤4.5>4.5>4.5>4.5>4.5表5.920150318批试剂盒准确性对比结果（第三批）阳性质控品阴性质控品项目4℃37℃9天4℃37℃9天123123123123过氧化氢------＋＋＋＋＋＋唾液酸酶＋＋＋＋＋＋－－－－－－脯氨酸氨＋＋＋＋＋＋－－－－－－基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5由以上结果可知，整套试剂盒37℃9天的加速破坏，各项性能指标仍满足要求，从加速试验初步推断试剂盒2-8℃保存条件下有效期满足12个月。35 6.5成品试剂盒的模拟运输稳定性研究整个试剂盒放置于微量振荡器上，于37℃温箱震荡放置7天，模拟运输环境下车辆的颠簸，高温对试剂盒稳定性的影响。震荡完毕，与放置4℃的整套试剂盒平行检测检测限质控品、特异性质控品和准确性，若颜色无明显差异则认为试剂盒经过运输后用于临床检验使用与未运输无本质的差别。实验结果如表5.10所示，本试剂盒置于微量振荡器上在37℃震荡7天，各性能指标检测颜色无明显变化，表明本试剂盒运输稳定性良好。表5.10三批试剂盒的运输稳定性20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天过氧化氢±±±±±±±唾液酸酶±±±±±±±检测限脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品D-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5特异性过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品J-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢-------阳性唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋准确度质控品脯氨酸＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶36 pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------阴性脯氨酸质控品-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢100%100%100%100%100%100%一致率唾液酸酶100%100%100%100%100%100%重复性脯氨酸大于100%100%100%100%100%100%氨基肽酶90%pH100%100%100%100%100%100%由以上结果可知，三批试剂盒37℃7天的模拟运输，各项性能指标仍满足要求。6.6试剂盒的拆封稳定性研究本产品主要组成成份就是反应板，而反应板是单人份一包装，因此拆封稳定性主要指的就是反应板打开后多长时间使用是有效的，拆包装袋后反应板暴露于空气中2h、4h、6h、8h和未拆封的反应板同时检测检测限质控品和特异性质控品，并观察纸片外观考察稳定性情况。结果如表5.11所示。表5.11反应板拆封稳定性未放置刚拆封拆封后放置时间项目外观检测限特异性D外观检测限特异性D过氧化氢近白色±＋近白色±＋唾液酸酶黄色±-黄色±-2h脯氨酸近白色±-近白色±-氨基肽酶pH绿色≤4.5>4.5绿色≤4.5>4.54h过氧化氢近白色±＋近白色±＋37 唾液酸酶黄色±-黄色±-脯氨酸近白色±-近白色±-氨基肽酶pH绿色≤4.5>4.5绿色≤4.5>4.5过氧化氢近白色±＋近白色±＋唾液酸酶黄色±-黄色±-6h脯氨酸近白色±-近白色±-氨基肽酶pH绿色≤4.5>4.5绿色≤4.5>4.5过氧化氢近白色±＋颜色暗±＋唾液酸酶黄色±-黄色±-8h脯氨酸近白色±-淡黄色＋±氨基肽酶pH绿色≤4.5>4.5绿色≤4.5>4.5由以上结果可知，反应板拆封后6小时内稳定，8小时过氧化氢孔及脯氨酸氨基肽酶孔试剂垫外观发生改变，且脯氨酸氨基肽酶孔性能影响，为保障产品质量，规定拆开包装袋后要在4小时内使用完毕，要避免空气中挥发性试剂影响。6.7成品试剂盒的实时稳定性研究将三批组装成品试剂盒于2-8℃环境中保存，在生产日期后的第0、3、6、9、12个月时分别取出部分试剂盒，使用企业参考品进行分析性能的检测，评估2-8℃保存条件下试剂盒性能的稳定性情况，三批试剂盒的实时稳定性评估结果如表5.12-5.17所示：表5.12三批试剂盒实时稳定性结果（2-8℃存放0个月）20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天检测限过氧化氢±±±±±±±38 唾液酸酶±±±±±±±脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品D-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5特异性过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品J-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢-------唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋阳性脯氨酸质控品＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5准确度过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------阴性脯氨酸质控品-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢100%100%100%100%100%100%一致率唾液酸酶100%100%100%100%100%100%重复性脯氨酸大于100%100%100%100%100%100%氨基肽酶90%pH100%100%100%100%100%100%39 表5.13三批试剂盒实时稳定性结果（2-8℃存放3个月）20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天过氧化氢±±±±±±±唾液酸酶±±±±±±±检测限脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品D-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5特异性过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品J-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢-------唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋阳性脯氨酸质控品＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5准确度过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------阴性脯氨酸质控品-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢一致率100%100%100%100%100%100%重复性唾液酸酶大于100%100%100%100%100%100%40 脯氨酸90%100%100%100%100%100%100%氨基肽酶pH100%100%100%100%100%100%表5.14三批试剂盒实时稳定性结果（2-8℃存放6个月）20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天过氧化氢±±±±±±±唾液酸酶±±±±±±±检测限脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品D-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5特异性过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品J-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢-------唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋阳性脯氨酸质控品＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶准确度pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5阴性过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋质控品唾液酸酶-------41 脯氨酸-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢100%100%100%100%100%100%一致率唾液酸酶100%100%100%100%100%100%重复性脯氨酸大于100%100%100%100%100%100%氨基肽酶90%pH100%100%100%100%100%100%表5.15三批试剂盒实时稳定性结果（2-8℃存放9个月）20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天过氧化氢±±±±±±±唾液酸酶±±±±±±±检测限脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品D-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5特异性过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品J-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5阳性过氧化氢-------准确度质控品唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋42 脯氨酸＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------阴性脯氨酸质控品-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢100%100%100%100%100%100%一致率唾液酸酶100%100%100%100%100%100%重复性脯氨酸大于100%100%100%100%100%100%氨基肽酶90%pH100%100%100%100%100%100%表5.16三批试剂盒实时稳定性结果（2-8℃存放12个月）20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天过氧化氢±±±±±±±唾液酸酶±±±±±±±检测限脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸特异性品D-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5质控过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋43 品J唾液酸酶-------脯氨酸-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢-------唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋阳性脯氨酸质控品＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5准确度过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------阴性脯氨酸质控品-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢100%100%100%100%100%100%一致率唾液酸酶100%100%100%100%100%100%重复性脯氨酸大于100%100%100%100%100%100%氨基肽酶90%pH100%100%100%100%100%100%表5.17三批试剂盒12个月实时稳定性后再模拟运输3天结果20150309批20150312批20150318批检测指标检测孔要求4℃运输4℃运输4℃运输结果7天结果7天结果7天过氧化氢±±±±±±±唾液酸酶±±±±±±±检测限脯氨酸±±±±±±±氨基肽酶pH≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5≤4.5特异性质控过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋44 品D唾液酸酶-------脯氨酸-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------质控脯氨酸品J-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢-------唾液酸酶＋＋＋＋＋＋＋阳性脯氨酸质控品＋＋＋＋＋＋＋氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5准确度过氧化氢＋＋＋＋＋＋＋唾液酸酶-------阴性脯氨酸质控品-------氨基肽酶pH>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5>4.5过氧化氢100%100%100%100%100%100%一致率唾液酸酶100%100%100%100%100%100%重复性脯氨酸大于100%100%100%100%100%100%氨基肽酶90%pH100%100%100%100%100%100%综上所述，分别对三批成品试剂盒在生产日期后的第0、3、6、9、12个月时进行分析性能的检测，结果显示试剂盒在2-8℃储存12个月后各项性能指标仍符合要求，且又做模拟运输3天，各项性能指标仍符合要求，这与加速稳定性推断的结果相一致，为保证试剂盒在实际应用中的有效性和安全性，将试剂盒的有效期为12个月。45 第七章试剂盒阳性判断标准研究7.1建立阳性判断值的方法为准确地得到本试剂盒的临界色块标准，用金标准方法首先确定100份正常样本，也就是乳酸杆菌大量，无线索细胞，无杂菌，pH≤4.5。然后再用金标准方法确认50份乳酸杆菌少，是BV阳性的样本，统计测得结果的四色配色色块分布，使用ROC曲线设定阳性判断值值（临界阳性色块标准）。7.2阳性判断值建立的过程与结果7.2.1过氧化氢指标表6.1列出了150份正常人样本和50份过氧化氢阳性样本用本试剂盒测定结果的分布情况：表6.1.正常人样本和过氧化氢阳性样本测定结果的分布情况检测结果阴性样本数阴性样本比例阳性样本数阳性样本比例结果＜A6442.67%00%A≤结果＜B6644%12%B≤结果＜C138.67%24%C≤结果＜D43%2448%D≤结果＜E32.00%1326%E≤结果00%1020%其中：根据《四色配色手册-美术设计师必备色谱（第三版）》（上海科学技术文献出版社）的测卡分布色块：A色块为蓝0红5黄5黑0B色块为蓝0红5黄10黑0C色块为蓝0红10黄5黑0D色块为蓝0红20黄10黑0E色块为蓝0红30黄10黑0根据所假设的不同阳性判断值计算特异性、灵敏度（TPR）和假阳性率（FPR），得表6.2。46 表6.2不同阳性判断值下测定的特异性、灵敏度（TPR）和假阳性率（FPR）特异性（%）灵敏度（%）假阳性率（%）色块真阴性率真阳性率FPRA42.67%100%57.33%B86.67%98%13.33%C95.33%94%4.67%D98.00%46%2.00%E100%20%0.00%表6.2所对应的ROC曲线如图6.1：ROC曲线120%100%80%TPR60%40%20%0%0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%FPR图6.1过氧化氢指标ROC曲线此图显示ROC曲线向左上方偏，曲线下面积较大，其临床准确性较好，试剂盒的阳性判断值定在蓝0红10黄5黑0左右时真阳性率（TPR）和假阳性率（FPR）的比例较合适。根据表6.2，不同阳性判断值下测定的特异性、灵敏度（TPR）的关系如图6.2所示：120.00%100.00%80.00%60.00%40.00%20.00%0.00%ABCDE图6.2过氧化氢指标不同阳性判断值值下的特异性、灵敏度（TPR）的关系47 由以上试验数据可知，选择蓝0红10黄5黑0作为阳性判断值色块，可在确保较高的灵敏度与特异性的同时，在检测结果假阳性率控制上也有较好的效果，因此选择蓝0红10黄5黑0作为阳性判断值色块。7.2.2唾液酸酶指标表6.3列出了150份正常人样本和50份唾液酸苷酶阳性样本用本试剂盒测定结果的分布情况：表6.3正常人样本和唾液酸苷酶阳性样本测定结果的分布情况检测结果阴性样本数阴性样本比例阳性样本数阳性样本比例结果＜A6342.00%00%A≤结果＜B6644%00%B≤结果＜C1610.67%12%C≤结果＜D11%2550%D≤结果＜E10.67%1428%E≤结果00%1020%其中：根据《四色配色手册-美术设计师必备色谱（第三版）》（上海科学技术文献出版社）的测卡分布色块：A色块为蓝5红5黄20黑0B色块为蓝5红10黄20黑0C色块为蓝5红20黄20黑0D色块为蓝10红30黄20黑0E色块为蓝10红40黄20黑0根据所假设的不同阳性判断值计算特异性、灵敏度（TPR）和假阳性率（FPR），得表6.4。表6.4不同阳性判断值下测定的特异性、灵敏度（TPR）和假阳性率（FPR）特异性（%）灵敏度（%）假阳性率（%）色块真阴性率真阳性率FPRA42.00%100%58.00%B86.00%100%14.00%C96.67%98%3.33%D97.33%48%2.67%E100%20%0.00%48 表6.4所对应的ROC曲线如下图：ROC曲线120%100%80%TPR60%40%20%0%0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%FPR图6.3唾液酸酶指标ROC曲线此图显示ROC曲线向左上方偏，曲线下面积较大，其临床准确性较好，试剂盒的阳性判断值值定在蓝5红20黄20黑0左右时真阳性率（TPR）和假阳性率（FPR）的比例较合适根据表6.5，不同阳性判断值值下测定的特异性、灵敏度（TPR）的关系如下图6.4所示：120.00%100.00%80.00%60.00%40.00%20.00%0.00%ABCDE图6.4唾液酸酶指标不同阳性判断值值下的特异性、灵敏度（TPR）的关系49 由以上试验数据可知，选择蓝5红20黄20黑0作为阳性判断值色块，可在确保较高的灵敏度与特异性的同时，在检测结果假阳性率控制上也有较好的效果，因此选择蓝5红20黄20黑0作为阳性判断值色块。7.2.3脯氨酸氨基肽酶指标表6.5列出了150份正常人样本和50份脯氨酸氨基肽酶阳性样本用本试剂盒测定结果的分布情况：表6.5正常人样本和脯氨酸氨基肽酶阳性样本测定结果的分布情况检测结果阴性样本数阴性样本比例阳性样本数阳性样本比例结果＜A6342.00%00%A≤结果＜B6644%12%B≤结果＜C1510.00%12%C≤结果＜D21%2550%D≤结果＜E10.67%1326%E≤结果00%1020%其中：根据《四色配色手册-美术设计师必备色谱（第三版）》（上海科学技术文献出版社）的测卡分布色块：A色块为蓝0红0黄10黑5B色块为蓝5红0黄20黑0C色块为蓝5红0黄30黑0D色块为蓝5红0黄40黑0E色块为蓝5红0黄50黑0根据所假设的不同阳性判断值计算特异性、灵敏度（TPR）和假阳性率（FPR），得表6.6。表6.6脯氨酸氨基肽酶不同阳性判断值下测定的特异性、灵敏度（TPR）和假阳性率（FPR）特异性（%）灵敏度（%）假阳性率（%）色块真阴性率真阳性率FPRA42.00%100%58.00%B86.00%98%14.00%C96.00%96%4.00%D97.33%46%2.67%E100%20%0.00%表6.6所对应的ROC曲线如下图：50 ROC曲线120%100%80%TPR60%40%20%0%0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%FPR图6.5脯氨酸氨基肽酶指标ROC曲线此图显示ROC曲线向左上方偏，曲线下面积较大，其临床准确性较好，试剂盒的阳性判断值值定在蓝5红0黄30黑0左右时真阳性率（TPR）和假阳性率（FPR）的比例较合适。根据表6.6，不同阳性判断值值下测定的特异性、灵敏度（TPR）的关系如图6.6所示：120.00%100.00%80.00%60.00%40.00%20.00%0.00%ABCDE图6.6脯氨酸氨基肽酶指标不同阳性判断值值下的特异性、灵敏度（TPR）的关系51 由以上试验数据可知，选择蓝5红0黄30黑0作为阳性判断值色块，可在确保较高的灵敏度与特异性的同时，在检测结果假阳性率控制上也有较好的效果，因此选择蓝5红0黄30黑0作为阳性判断值色块。52 第八章试剂盒的临床研究本产品的临床研究由郑州安图生物工程股份有限公司委托两家省级临床医疗机构，分别为河南省人民医院、郑州大学第二附属医院，对其研制的细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒进行临床研究，评价该试剂盒的临床性能。通过对门诊不同人群样本的临床检测，与细菌性阴道病检测的金标准Amsel法、及美国Cryphus诊断试剂公司的BVblue试剂盒进行进行比较，结合临床诊断分析试验结果，考核该试剂盒的临床性能。8.1实验材料及研究方法8.1.1实验材料用联检分析仪检测待考核试剂盒，批号为20150318批细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒；对比试剂盒为美国Cryphus诊断试剂公司的BVBlue试剂盒；珠海贝索生物技术有限公司的快速革兰氏染色液（批号415012）。8.1.2主要仪器设备联检分析仪（安图实验仪器（郑州）有限公司），专用电热恒温培养箱DH2500A（天津泰斯特仪器有限公司），OLYMPUS奥林巴斯BX51显微镜（清华同方股份有限公司）。8.1.3样本量样本量不少200例，以2015年4月到2015年6月在河南省人民医院和郑州大学第二附属医院就诊的妇科门诊患者，充分收集临床信息，样本选择女性阴道分泌物样本，样本的排除标准为2天内性生活、经期、绝经期、阴道用药及带血样本。共入选样本为681例。8.1.4样本的采集及试验设计严格按照产品说明书进行采集样本，即用无菌拭子或无菌棉签取阴道分泌物，拭子或棉签于阴道后位或后穹窿处旋转10~20秒，以能清晰看到分泌物附53 着为准，所采样本应在1小时内使用。每例共取3份样本，先分别用200微升生理盐水涮洗样本，混匀后，平均分成3份，1份用于BVblue试剂盒检测，1份用于待评估产品，1份用于Amsel法的涂片镜检和胺试验（革兰氏染色镜检乳酸杆菌、线索细胞情况）。采用三个人分别进行测定，记录三种方法的检测结果，BVblue试剂盒和待评估产品的唾液酸酶指标进行比较，待评估产品综合判断结果和Amsel法进行比较，不一致的结果及时复测，复测后的结果仍然不一致的，再追溯至被测个体的临床诊断信息确定。8.1.5数据统计分析方法采用卡方检验进行统计分析，比较待评估产品的灵敏度、特异性、总符合率等指标。8.2临床研究结果及分析细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒通过和BV的金标准Amsel法大量实际临床数据对比分析得出和Amsel法符合率较高的判断BV的联合判断模式，并生成软件，方便使用。具体模式如表7.1所示：表7.1BV联合判断模式脯氨酸氨基模式H2O2唾液酸酶pH判断肽酶1±/---≤4.5正常2O±/+O>4.5BV3O-+>4.5BV4除以上三种的其他模式亚健康注：其中“O”表示任意结果8.2.1过氧化氢孔临床结果细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒的过氧化氢孔和染色镜检乳酸杆菌结果分析结果如表7.2所示。54 表7.2考核试剂过氧化氢孔与染色镜检乳酸杆菌对比分析染色镜检乳酸杆菌项目合计－＋考核试剂－1668174过氧化氢孔＋23484507合计189492681注：乳酸杆菌油镜下平均每个视野≥10个表示为阴性“-”，表示正常；反之“+”，表示不正常。而过氧化氢孔显色标记为“-”，表示阴性，正常。试验结果表明，考核试剂的过氧化氢孔以革兰氏镜检染色乳酸杆菌为标准灵敏度为87.83%；特异性为98.37%；阴性预测值为95.40%，阳性预测值为为95.46%，总符合率为95.45%。检验结果经χ2检验，P<0.05，两者检测结果有明显差异。8.2.2唾液酸孔临床结果细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒的唾液酸酶孔和BVblue试剂盒检测结果分析结果如表7.3所示。表7.3考核试剂唾液酸酶孔与BVblue试剂盒对比分析BVblue试剂盒项目合计－＋考核试剂唾液酸＋92193酶孔－2586588合计94587681试验结果表明，考核试剂的唾液酸酶孔以BVblue试剂盒为标准灵敏度为97.87%；特异性为99.83%；阳性预测值为98.92%，阴性预测值为为99.66%，总符合率为99.56%。检验结果经χ2检验，P>0.05，两者检测结果无明显差异。8.2.3BVblue试剂盒临床结果BVblue试剂盒和Amsel法检测结果分析结果如表7.4所示。55 表7.4BVblue试剂盒与Amsel法对比分析Amsel法项目合计－＋＋89594BVblue试剂盒－15572587合计104577681试验结果表明，BVblue试剂盒以Amsel法为标准检测的灵敏度为85.58%；特异性为99.13%；阳性预测值为94.68%，阴性预测值为为97.44%，总符合率为97.06%。经χ2检验，P<0.05，两者检测结果有明显差异。8.2.4考核试剂评估结果细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒综合判断和Amsel法检测结果分析结果如表7.5所示。表7.5考核试剂综合判断与Amsel法试剂盒对比分析Amsel法项目合计－＋＋1023105考核试剂盒－2574576合计104577681试验结果表明，考核试剂盒以Amsel法为标准检测的灵敏度为98.08%；特异性为99.48%%；阳性预测值为97.14%，阴性预测值为为99.65%，总符合率为99.27%。经χ2检验，P>0.05，两者检测结果无明显差异。8.3结论与讨论本临床研究共检测681份女性阴道分泌物样本，年龄从18-61岁。从考核试剂过氧化氢指标和染色镜检乳酸杆菌检测结果分析，两者有显著性差异，主要是镜检看到乳酸杆菌多，而过氧化氢检测没有的有23例，这主要56 是两种方法学的差异，镜检看到的是形态上的存在多的乳酸杆菌，而过氧化氢检测的结果显示这些乳酸杆菌不具有产过氧化氢的功能；而另外差异的8例，有4例虽说形态上不是典型的乳酸杆菌，但仍具有产过氧化氢的功能，另4例阳性判断值附近。过氧化氢属于乳酸杆菌的功能性检测，这相对镜检的形态学检测有自己的优势，有差异才是其优势所在。从考核试剂唾液酸酶指标和BVblue试剂盒检测结果分析，两者具有较高的符合率且无明显差异，说明干化学的唾液酸酶孔达到了BVblue试剂盒相同的检测结果，但底物的用量却大幅度降低，操作的方便性更是明显，对于有差异的3例，属于临界色附近的样本，由于临界参考色块是个相对的颜色判断标准，并且不同的试剂盒设定的参考范围有所不同，因此不能绝对的区分有病和无病，这样的病例建议同时结合其他检测结果及临床症状进行综合评价，或间隔一段时间进行复检。从BVblue试剂盒和Amsel法检测结果分析，检测的灵敏度为85.58%，具有显著性差异，经分析BVblue试剂盒检测阳性，Amsel法检测阴性的5例中有2例是临界色附近，另外3例pH小于4.4，且镜检视野干净，无厌氧菌，属于唾液酸酶指标检测的假阳性；而对于Amsel法检测阳性，BVblue试剂盒检测阴性的15例样本，其中2例是临界色附近，另外的13例革兰氏染色镜检可看到典型的线索细胞（且大于20%），只是线索细胞上附着的厌氧菌偏短小杆菌，说明单纯的唾液酸酶指标检测会造成漏检BV。这也印证了单一酶指标会造成此酶活性低的厌氧菌导致的BV的事实。从考核试剂盒综合判断模式得到的检测结果和Amsel法检测结果分析，检测的灵敏度达98.08%，且呈现高度符合率和无明显差异。脯氨酸氨基肽酶临界色附近存在念珠菌等的干扰，而脯氨酸氨基肽酶“+”对应颜色，同时pH大于4.5，Amsel法检测为BV，进一步的验证了双酶指标联合pH和乳酸杆菌情况检测BV的准确性大幅度提高，更满足BV的发病机制本身。综上所述，考核试剂盒相比较BVblue试剂盒提高BV了检出率，避免了漏检，能较好用于妇科、产科及施行外科流产术前的BV的快速诊断和疗效观察。57 结论与讨论鉴于BV对妇女及其妊娠的危害，在妇科、产科以及施行外科流产术前进行BV检查具有十分重要的意义。目前BV的检测现状单一指标应用较多，单一的镜检线索细胞的应用，受限于门诊要快速拿到检测结果，临床上只能用湿片镜检的方式看线索细胞，这就使检测的准确性大幅度降低，而且镜检本身经验要求高，主观性强，对于检验者工作者来说一天都对着显微镜，也是不小的挑战，长此以往对眼睛的损害也是不容忽视的；单一的唾液酸酶指标检测，底物成本较高，给临床的推广应用造成一定困难，且势必造成漏检，临床上也迫切需要符合BV本身机理的产品出现，客观、准确、简便、经济、快速的诊断方法，辅助临床正确诊断和治疗BV，降低并发症。本论文的研究以建立成本经济、结果准确、联合判断、简便快速的适用于门诊随到随测的细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒为出发点，通过反应板模具独特的设计制作，实现了微量联合检测的目的，并建立了原材料相应的质量标准。试剂盒组份的制备研究中，四种包被液配方的选择，过氧化氢包被液主要含过氧化物酶0.2mg/ml，4-氨基安替吡啉3g/ml，巯基乙醇0.01%；唾液酸苷酶试剂垫主要包含唾液酸底物B0.25mg/ml和固紫B盐0.3mg/ml；脯氨酸氨基肽酶试剂垫包含pH值在7.0~8.0的Tris缓冲液中加入6mg/ml的L-脯氨酸对硝基苯胺；pH值试剂垫主要包含溴甲酚绿6mg/ml；干燥方式及条件采用四种试剂垫置于平皿内加包被液4小时内送入真空干燥机，37℃干燥30min，之后4种反应垫加入反应板相应孔内，进行包装并组装，形成了产品的工艺流程图。试剂盒的反应体系研究中，做到了只需要加入样本液，不需要额外试剂便可实现检测的一步操作法，样本加入量30μl，反应时间确定为15分钟，采用37℃温育的条件，因是干化学反应，干浴器便可达到温育要求，在桌面便可检测更方便，结果判读时间为温育结束后到5分钟任意时间，为更好的判读结果配备了套孔式比色卡或者用联检分析仪进行读取结果，为临床提供更多选择。试剂盒的分析性能研究中，考查了三批试剂盒的检测限、特异性、准确性、重复性和批间差。测定10mg/L的过氧化脲标准液、0.03U/ml唾液酸苷酶标准液、100U/ml蛋白酶E标准液、pH4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，检测结果对照比色58 板呈色不得浅于“±”的颜色；测定2麦氏大肠杆菌(ATCC25922)菌悬液的特异性质控品D和2麦氏金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌悬液的特异性质控品J应无明显变色；用阳性质控品检测，检测结果对照比色板呈色不得浅于“+”的颜色；用阴性质控品检测，不得出现阳性结果；用检测限质控品检测10次，检测结果的一致性应不低于90%；三个批次的产品同时检测检测限质控品批间变异一致性应不低于90%。试剂盒的稳定性研究中，考查了各组分的加速稳定性、质控品的加速稳定性、整套试剂盒的加速稳定性、整套试剂盒模拟运输稳定性、实时稳定性和拆封稳定性。三个批次的反应板放置在37℃9天的加速稳定性均符合要求；三个批次的整套试剂盒放置在37℃9天考查加速稳定性，加速破坏后检测限、特异性、准确性、重复性无明显变化；试剂盒放置在37℃振荡器上模拟高温运输7天，检测限、特异性、准确性、重复性无明显变化；反应板拆封2h、4h、6h、8h稳定性考察，拆封6h内是稳定的；使用的样本要求新鲜使用，取样本后1小时内使用。制备好的三批成品试剂盒储存于2-8℃冷藏环境下，在生产日期后的第0、3、6、9、12个月时分别取出部分试剂盒，检测限、特异性、准确性、重复性均满足试剂盒设定的标准，实事稳定性12个月后，37℃震荡3天仍满足标准要求，说明12个月的产品效期稳定。使用细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒检测100例健康人样本和50例乳酸杆菌少，BV是阳性的样本，统计测得结果的四色配色色块分布，使用ROC曲线设定阳性判断值值（临界阳性色块标准）得到过氧化氢指标阳性色块判断选择蓝0红10黄5黑0；唾液酸酶指标选择蓝5红20黄20黑0；脯氨酸氨基肽酶指标选择蓝5红0黄30黑0；pH>4.5判断色块选择。由两家省级医疗机构对研制的细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒进行临床研究，通过对不同年龄段人群样本的临床检测，过氧化氢孔和革兰氏染色镜检乳酸杆菌进行比较，唾液酸酶孔与BVblue试剂盒进行比较，BVblue试剂盒与，考核试剂盒综合判断结Amsel法金标准进行比较果同Amsel进行比较，考核该试剂盒的临床性能，对其性能进行评价。临床研究测定共测定681例临床样本，包含18-61岁不同年龄阶段的人群，所测样本有健康体检人群的样本，有患阴道炎的患者的样本。对比测定结果显示考核试剂盒的唾液酸酶孔以BVblue试剂盒为标准测得的灵敏度为97.87%；特异性为99.83%；阳性预测值为98.92%，阴性预测值为为99.66%，总符合率为99.56%。检验结果经χ2检验，P>0.05，两59 者检测结果无明显差异，而BVblue试剂盒和Amsel法金标准比较有显著性差异，检测的灵敏度为为85.58%，考核试剂盒综合判断结果以Amsel法金标准为准测得的灵敏度为98.08%；特异性为99.48%%；阳性预测值为97.14%，阴性预测值为为99.65%，总符合率为99.27%。经χ2检验，P>0.05，两者检测结果无明显差异。表明考核试剂盒双酶指标联合过氧化氢及pH确实提高BV的检出率，灵敏度达到98.08%，更好的用于临床诊断BV及治疗后效果观察。综上所述，本论文建立了既可以目测判断结果又可以联检分析仪检测的细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒，并考查了试剂盒各组分制备的各项工艺参数和试剂盒的检测限、特异性、准确性、重复性、批间差、稳定性等各项性能指标、设定了试剂盒使用的阳性判断标准、并委托两家省级医疗机构进行了临床研究，与进口的BVblue试剂盒及Amsel法金标准平行比对，结果表明本试剂盒开辟了功能性指标联合检测的应用，临床符合率高、检测准确性好、结果客观，操作方便、快速、成本经济、质量可靠的国产诊断试剂将为临床检验提供质优价廉的新选择，一定程度上满足临床检验的需求。本论文研究的重点是干化学酶联合功能性指标微量检测在细菌性阴道病检测上开发应用和评估，目的是研制开发适合中国国情的、临床适用的、操作简便快捷的、低廉的、灵敏度和特异性都比较高的有利于我国卫生健康事业的发展，而且能大幅度降低医疗、卫生防疫、计生委婚检所等的日常检验费用，缩短检验周期，提高检验工效，同时显著提升我国的微生物检测水平，使我国的微生物检测工作能象生化检测和免疫学检测一样，向国际水平靠近并接轨。通过本项目的开展，建立细菌性阴道病干化学酶法联合检测规模化的研发生产基地、销售平台及售后服务团队，引导和服务于细菌性阴道病感染的医学临床检测，辅助有关人员迅速做出检测结论，及时采取有效措施，从而弥补我国在临床细菌性阴道病检测技术上的不足，提高我国居民的生殖健康水平，促进社会和谐。本产品建立了干化学酶法检测平台，在此基础上不断完善，通过不断研究开发逐渐形成了一套完整的临床致病微生物的检测系统，并逐步向全自动检测方向发展。届时可为医疗机构提供一整套临床致病微生物感染检测解决方案，代表了临床致病微生物检测的技术方向之一。60 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致谢本文是在导师朱大恒教授的精心指导与严格要求下完成的，导师严谨的治学态度、求实的科学精神、无私的教诲与指导，给了我深刻的启迪和教诲，受益终身。值此论文完成之际，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢郑州大学生命科学学院领导和老师的培养与教育！感谢郑州安图生物工程股份有限公司为我提供的学习机会，感谢公司领导的关心与帮助！感谢我的家人、同事、朋友在学业过程中给予的指导和帮助，在此谨向他们致以敬意和感谢！66
