Hippo_YAP通路在血管新生中作用及机制研究

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1、分类号：R331学校代码：10062密级：学号：2014601093博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Hippo/YAP通路在血管新生中作用及机制研究TITLETheRoleandMechanismofHippo/YAPPathwayinAngiogenesis一级学科：基础医学二级学科：医学生理学论文作者：鲍乾坤导师：朱毅教授天津医科大学研究生院二〇一七年五月分类号：R331学校代码：10062密级：学号：2014601093学位类别：科学学位专业学位学科门类：

2、医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Hippo/YAP通路在血管新生中作用及机制研究TITLETheRoleandMechanismofHippo/YAPPathwayinAngiogenesis一级学科：基础医学二级学科：医学生理学论文作者：鲍乾坤导师：朱毅教授导师组成员：艾玎教授天津医科大学研究生院二〇一七年五月天津医科大学博士学位论文中文摘要血管新生（angiogenesis）是一项受多条信号通路共同调控的复杂生理过程，在许多疾病及病理生理过程中发挥重要作用。

3、目前已知血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）以及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等细胞因子介导的信号通路，通过调节血管内皮细胞增殖和迁移等功能而参与血管新生的调控。近年来研究提示Hippo/YAP通路同样在内皮细胞促血管新生的功能中扮演着重要角色，但其在血管新生过程中的作用及机制尚未完全清楚。因此，本研究的目的在于明确YAP蛋白在VEGF介导的信号通路中的作用，以及Hippo/YAP通路与其他调控血管新生过程的信号通路

4、之间的关系。在内皮细胞中，VEGF导致YAP蛋白磷酸化水平降低，进而促使YAP蛋白在细胞核中的聚集增加，这一现象呈时间及剂量相关性。小分子干扰RNA抑制内皮细胞中YAP蛋白的表达，可以阻断VEGF导致的内皮细胞增殖、迁移和血管生成的作用。同时，小鼠体内内皮细胞过表达YAP蛋白明显促进了视网膜及肿瘤组织中的血管新生。由于YAP作为转录共激活因子需要与DNA直接结合的转录因子相互作用发挥转录作用，为探寻在内皮细胞中与YAP蛋白相互作用的转录因子，我们利用免疫共沉淀及质谱分析技术，通过蛋白组学分析发现

5、了与YAP蛋白结合的新的转录因子-信号转导和转录激活因子3（Signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3）。进一步我们通过蛋白相互作用结构预测分析，YAP蛋白的SH3结合结构域可能与位于STAT3的结构中第656-687位氨基酸序列结合而发生相互作用。通过构建YAP蛋白SH3结合结构域缺失质粒以及STAT3特殊氨基酸序列结构缺失质粒，采用蛋白质免疫沉淀及免疫蛋白质印迹等方法证实了YAP蛋白与STAT3的结合位点，同时发现这一结合导致STAT

6、3的出核信号被YAP蛋白遮挡。由于YAP蛋白与STAT3的结合影响了CRM1介导STAT3的细胞核输出转运，因而使得内皮细胞过表达YAP蛋白延长了IL-6介导的STAT3在细胞核内的累积时间，并导致了血管生成因子2（angiopoietin-2，ANG2）表达水平的增加。最后我们在建立的视网膜血管新生的模型中，通过给予新生小鼠STAT3活性特异性抑制剂和ANG2中和抗体的干预手段，来检测IL-6/STAT3通路对Hippo/YAP通路介导的内皮细胞血管新生的影响。STAT3抑制剂以及ANG2中和

7、抗体明显减弱了YAP蛋白过表达促进的血管新生，证实了Hippo/YAP通路与IL-6/STAT3通路在体内存在相互作用，并且这一相互作用是I天津医科大学博士学位论文由YAP和STAT3的结合来介导的。综上所述，本研究发现内皮细胞中与YAP蛋白结合的新的转录因子STAT3，两者的结合促进了IL-6诱导的STAT3在细胞核中的聚积，并且增强了对ANG2的转录调控，进而导致内皮细胞增殖、迁移及成血管功能的增强，最终促进了组织中血管新生过程。这一机制的研究为探寻血管新生相关疾病的发生机制提供了理论研究基

8、础，为疾病的治疗提供了新的思路和靶点。关键词：血管新生YAP蛋白信号转导和转录激活因子3血管生成素2出核信号II天津医科大学博士学位论文AbstractAngiogenesisisacomplexprocessgovernedbytheinteractionofseveralsignalingpathwayssuchasvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)andinterleukin-6(IL-6)thathaveacrucialeffectonthereg