microRNA-449a在小鼠神经病理性疼痛模型中的调控作用及其机制

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中文摘要microRNA449a在小鼠神经病理性疼痛模型中的调控作用及其机制研究目的神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP）又称为神经痛，已经成为了严重影响人类健康的疾病难题。研究认为，神经病理性疼痛是因为外周或中枢神经系统的损伤或者功能紊乱导致的慢性疼痛所引起，其临床特征通常表现为为痛觉过敏、自发性疼痛或异常性疼痛等，目前对于神经病理性疼痛的发病机制尚不明确，也尚无有效的治疗方案。大量研究证实，神经病理性疼痛的发病机制复杂，可能与神经系统的外周神经感受器过敏、中枢神经痛感神经元异常重组以及传入神经的异位兴奋等因素密切相关。由于临床上缺乏有效的治疗方案，因此神经病理性疼痛难以有效根治，目前全球范围内的患者数量越来越多，而且由于剧烈的疼痛给患者带来巨大的身体和精神痛苦，已经成为不容忽视的难以治愈的健康问题。在临床上对于神经病理性疼痛的治疗是以抗抑郁药、抗癫痫药以及局部麻醉剂为主，但是上述药物的疗效仍不理想，并且副作用严重，因此明确神经病理性疼痛的发病机制并加快高效低毒药物的研发，已经成为临床研究的热点领域。基因组的表达失衡是引起神经病理性疼痛的关键因素，从基因水平对疾病的发病机制进行阐述具有临床指导意义。miRNA是人体内的一类具有调控基因组表达功能的内源性因子，参与调控细胞的增殖凋亡，组织分化和功能维持等方面的作用，miRNA在真核细胞中发挥调控基因表达水平的作用，主要是通过与靶基因mRNA3’非编码区的结合来实现。miRNA一方面能够与细胞质中的蛋白结合，形成RNA干扰沉默核糖核蛋白复合物，该复合物能够与靶基因mRNA发生互补而降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白转录；此外，miRNA也可以通过与mRNA的不完全互补抑制蛋白的转录。由于神经病理性疼痛本质上可以认为是神经系统对损伤做出的应激反应，所发生的病理改变与各种蛋白的表达密切相关，包括信号转导分子、神经递质、炎性因子和离子通道蛋白等。因此miRNA通过调控不同信号通路相关的蛋白表达，从而对神经病理性疼痛的病理进程发挥了不I 同的调控作用。MiRNA其在肿瘤的作用以及机制的研究较为广泛，并且已经有部分研究进入临床应用阶段，但是对于miRNA在神经系统中的作用及其机制研究相对匮乏，本研究采用生物化学、分子生物学、细胞生物学以及实验动物学等技术主要开展以下研究：（1）构建小鼠坐骨神经分支选择性损伤（sparednerveinjury，SNI）模型，采用微阵列芯片（microarray）技术检测背根神经节（DRG）中miRNA表达谱的变化，筛选鉴定其中具有显著差异的miRNA；（2）观察小鼠体内特定miRNA过表达后对神经病理性疼痛的影响及其机制；（3）通过体外细胞培养揭示特定miRNA调控DRG生物学行为的信号转导机制。研究方法1.采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）法构建小鼠神经病理性疼痛模型，背根神经节（Dorsalrootganglia，DRG）从小鼠体内进行分离培养；2.SNI小鼠模型的动物行为学测定包括了机械性刺激诱发疼痛的行为学测定、热刺激诱发疼痛的行为学测定、冷刺激诱发疼痛的测定；3.使用TaqMan低密度微阵列芯片筛选各样本中差异化表达的miRNA，实验步骤根据试剂说明书进行；4.实时荧光定量PCR对筛选得到miRNA开展进一步的鉴定；5.采用Targetscan、miRBase和miRGenTargets三个数据库，并结合已有文献，对miR-449a的下游靶基因进行预测分析，然后从中选择与神经病理性疼痛最为密切相关的靶基因作为研究目标；6.采用荧光素酶报告基因检测转录因子与靶基因的启动子DNA相互作用7.采用DRG显微注射术检测外源性miRNA-449a对神经病理性疼痛的作用；8.采用实时荧光定量PCR和western检测目标基因的mRNA和蛋白表达水平。本研究采用统计软件SSPS18.0统计和分析原始数据，各组的差异水平通过t检验（student’sttext）和卡方检验进行分析。研究结果1.机械刺激缩足反应阈值的测定结果表明，术前两组小鼠的MWT基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的MWT值显著下降至1.13±0.28g，与假手术组相比存在显著差异（P<0.01）；在术后的第5、7天II 模型组小鼠的MWT值稍有下降趋势，并在第7天MWT达到最低值。而在非手术的对侧，两组小鼠的MWT值均无显著差异，证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后时间的延长呈下降趋势。2.TaqMan低密度微阵列芯片miRNA筛选结果如表1.1所示，其中miRNA-449a和miRNA-185在SNI小鼠模型的DRG中的表达有显著性差异（P<0.05）。在术后第3天，miR-449a和miRNA-185在SNI小鼠的DRG中表达均有显著差异，其中miRNA-449a的表达差异化水平最高。并且随术后时间延长，miR-449a和miRNA-185的表达水平进一步下降，其中miRNA-449a的差异化水平更显著。3.通过在线数据库TargetScan、miRBase、miRGenTargets预测miR-449a的靶基因为KCNMA1，初步结合Blast数据库验证，假设KCNMA1的3’UTR区域存在与miR-449a的5’端发生互相作用的结构序列。经检测荧光素酶相对活性值为：miR-449a-NC-3'UTR-WT（0.91±0.07）；miR-449a-H+3'UTR-WT（0.52±0.06）；miR-449a-NC+3'UTR-MUT（0.96±0.09）；miR-449a-H+3'UTR-MUT（0.94±0.08）。4.经双荧光素酶报告基因检测的结果表明，KCNMA1野生型的3'UTR基因报告质粒与miR-449a共转染DRG细胞后，可见荧光素酶的活性显著下降（P<0.01，图4.1），而KCNMA1突变型3'UTR的荧光酶报告基因质粒与miR-449a共转染DRG细胞后对荧光素酶的活性无显著影响。表明KCNMA1基因的3'UTR区能够与miR-449a发生结合，其表达直接受到miR-449a的调控。5.荧光定量PCR结果显示，miRNA-449a过表达的DRG细胞中KCNMA1的mRNA水平显著下降为0.58±0.04（P<0.05，与阴性对照组相比）；而空白对照组与阴性对照组相比无显著差异。Westernblot检测了DRG细胞中KCNMA1蛋白的表达，结果与mRNA检测一致，证实miRNA-449a能够抑制DRG细胞中KCNMA1的表达。6.小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的MWT值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠MWT值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与NaiveIII 组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的MWT值与本组的基础值相比出现显著下降（p<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的MWT值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。各组小鼠的TWL和CWL的测定结果趋势与MWL基本一致。7.小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，分离手术侧的DRG进行实时荧光定量PCR检测KCNMA1mRNA和蛋白水平表达的水平改变，检测结果显示，Vehicle+SNI组、NC+SNI组和miR-449amimics+SNI组小鼠DRG中KCNMA1的mRNA和蛋白水平出现显著增加，与Naive组相比，有显著性差异（P<0.05）miR-449amimics+SNI组显著高于Vehicle+SNI组（P<0.05）。研究结论1.SNI神经病理痛小鼠模型中miR-449a表达显著降低；2.DRG细胞中miRNA-449a能够靶向抑制KCNMA1的表达；3.外源性miRNA-449a能够改善SNI神经病理痛小鼠模型的疼痛水平，其作用可能与抑制KCNMA1的表达密切相关。关键词：神经病理性疼痛，小鼠模型，miR-449a，分子机制，大电导钙离子依赖的钾通道M亚族α亚基IV AbstractTheregulatoryrolesandrelatedmechanismsofmicroRNA-449ainthemouseneuropathicpainmodelsObjectiveNeuropathicpain(neuropathicpain,NP),alsoknownasneuralgia,hasbecomeaseriousproblemthatseriouslyaffectshumanhealth.Researchshowsthatneuropathicpainisduetotheperipheralorcentralnervoussystemdamageordysfunctioncausedbychronicpaincausedbyitsclinicalfeaturesareusuallyforhyperalgesiaorallodynia,spontaneouspain,thepathogenesisofneuropathicpainisnotclear,thereisnoeffectivetreatment.Alargenumberofstudieshaveconfirmedthatthepathogenesisofneuropathicpainiscomplex,whichmaybecloselyrelatedtotheperipheralnervousreceptorsensitivity,centralnervoussystemabnormalneuronalreorganizationandtheectopicexcitationoftheafferentnerve.Duetothelackofeffectivetreatmentinclinicalpractice,itisdifficulttoeffectivelycureneuropathicpain,thescopeofthecurrentglobalnumberofpatientsmoreandmore,butduetotheintensepaincausedgreatphysicalandmentalpaintothepatient,cannotbeignoredtotreathealthproblemsmore.Intheclinicaltreatmentforneuropathicpainistakingantidepressants,anticonvulsantsandlocalanesthetics,buttheefficacyofthesedrugsisstillnotideal,andserioussideeffects,thepathogenesisofneuropathicpainandthereforeclearlyacceleratethedevelopmentofhighefficiencyandlowtoxicityofdrugs,hasbecomeahotspotinthefieldofclinicalresearch.Theimbalanceofgenomeexpressionisthekeyfactorofneuropathicpain.Itisclinicallyinstructivetoexplainthepathogenesisofdiseasefromgenelevel.MiRNAisthebodyofakindofexpressionofendogenousfactorfunctionofregulatorygenesinvolvedintheregulationofcellproliferationandapoptosis,andtissuedifferentiationandmaintenanceoffunctionoftheroleofmiRNAineukaryoticcellsplayaroleinV regulationofgeneexpressionlevel,ismainlyachievedbycombiningwiththetargetgenemRNA3'nonencodingregion.Ontheonehand,miRNAbindstoproteinsinthecytoplasm,theformationofRNAinterferencesilencingribonucleoproteincomplex,thiscomplexcanoccurwithcomplementarytargetgenemRNAandproteindegradationofmRNA,therebyinhibitingthetranscriptionoftargetgenes;inaddition,miRNAcanalsobeusedwithmRNAincompletecomplementarytranscriptioninhibitionprotein.Infact,neuropathicpaincanberegardedasthestressreactionofnervoussystemtoinjury.Thepathologicalchangesarecloselyrelatedtotheexpressionofvariousproteins,includingsignaltransductionmolecules,neurotransmitters,inflammatoryfactorsandionchannelproteins.Therefore,miRNAplaysadifferentregulatoryroleinthepathologicalprocessofneuropathicpainbyregulatingtheproteinexpressionrelatedtodifferentsignalpathways.MiRNAresearchonitsantitumoreffectsandmechanismofmoreextensive,andtherehasbeensomeresearchintoclinicalapplicationstage,buttheroleofmiRNAinthenervoussystemanditsmechanismsarerelativelyscarce,inrecentyears,studieshaverevealedtheoccurrenceanddevelopmentofthedifferentialexpressionofmiRNAinneuropathicpain,neuropathicpainbysyntheticinhibitorsrelatedmiRNAoragonistdrugsforneuropathicpain,isexpectedtoprovideaneweffectivetarget,butatthepresentstage,miRNAandneuropathicpaincomplexregulatingrelationshipstillneedsfurtherstudy.Method1.Thesciaticnervebranchselectiveinjury(SNI)methodwasusedtoconstructthemousemodelofneuropathicpain.TheDorsalrootganglia(DRG)wasisolatedfrommice.2.TheanimalbehaviorofSNImousemodelincludesbehavioralassessmentofpaininducedbymechanicalstimulation,behavioralanalysisofpaininducedbyheatstimulation,andpaindetectionbycoldstimulation.3AfterDRGcellswereisolatedandculturedfor48hours,theextractionandpreamplificationoftotalmiRNAwerecarriedout,andtheexperimentaloperationVI wascarriedoutaccordingtotheinstructionsofthekit.4.ThemiRNAofdifferentialexpressionineachsamplewasscreenedusingTaqManlowdensitymicroarraychip,andtheexperimentalprocedurewascarriedoutaccordingtothereagentinstructions.5.Thereal-timefluorescencequantitativePCRwasfurtheridentifiedforthescreeningofmiRNA.6.WeuseTargetscan,miRBaseandmiRGenTargetsthreedatabases,combinedwiththeexistingliterature,predictandanalyzethedownstreamtargetgenesofmiR-449a,andthenselectthetargetgeneswhicharemostcloselyrelatedtoneuropathicpainastheresearchobjectives.7.UsingluciferasereportergenetodetecttheinteractionoftranscriptionfactorandtargetgenepromoterDNA8.DRGmicroinjectionwasusedtodetecttheeffectofexogenousmiRNA-449aonneuropathicpain.9.ThelevelofmRNAandproteinexpressionofthetargetgenewasdetectedbyreal-timefluorescentquantitativePCRandwestern.Results1.ThemiceinthemodelgrouprecoveredwellafterSNIoperation,andthephysiologicalfunctionreturnedtonormal.ThemechanicalwithdrawalthresholddeterminationresultsshowedthatpreoperativeMWTbasedvaluesofthetwogroupsofmicehadnosignificantdifferenceinthethirddayafterSNI,observedinthemodelgrouptheMWTvaluedecreasedto1.13±0.28g,comparedwiththeshamoperationgroup(p<0.01);thereweresignificantdifferencesinpostoperativefifth,seventhdaysinthemodelgrouptheMWTvaluedecreasedslightly,andreachesthelowestvalueinseventhdaysMWT.However,therewasnosignificantdifferenceintheMWTvaluebetweenthetwogroupsonthenonoperativecontralateralside.Itwasconfirmedthatthepainthresholdofthemechanicalsideofthemodelgroupdecreasedsignificantly,anditdecreasedwiththeprolongationoftheoperationtime.ThethresholdofthermalstimulationandthermalstimulationofthelefthindlimbsVII ofthemodelgroupwasbasicallythesameasthatofthemechanicalstimulation.2.TheresultsofmiRNAscreeningofTaqManlowdensitymicroarraychip,asshowninTable1.1,showedsignificantdifferencebetweenmiRNA-449aandmiRNA-185expressioninDRGofSNImousemodel(P<0.05).RealtimequantitativePCRwasusedtodetecttheexpressionofmiR-449aandmiR-185inDRGmiceofSNImiceandcontrolmice,soastoexcludefalsepositiveresults.PCRquantitativedetectionshowedthatthereweresignificantdifferencesinmiR-449aandmiRNA-185expressioninDRGofSNImiceonthethirddayafteroperation,andmiRNA-449aexpressionlevelwasthehighest.TheexpressionlevelofmiR-449aandmiRNA-185decreasedwiththeprolongationofpostoperativetime,andthedifferentiallevelofmiRNA-449awasmoresignificant.3.WepredictthetargetbaseofmiR-449abyonlinedatabaseTargetScan,miRBaseandmiRGenTargets,becauseKCNMA1ispreliminarilycombinedwithBlastdatabasevalidation.WeinitiallyassumethatKCNMA1's3'UTRregionhasastructuralsequencethatinteractswiththe5'endofmiR-449a.TherelativeactivityofluciferasewasmiR-449a-NC-3'UTR-WT(0.91+0.07),miR-449a-H+3'UTR-WT(0.52+0.06),miR-449a-NC+3'UTR-MUT(0.96+0.09)andmiR-449a-H+3'UTR-MUT(0.94+0.08).4.bydualluciferasereportergeneassayshowedthatKCNMA1ofwildtype3'UTRgeneandmiR-449areporterplasmidsweretransfectedintoDRGcells,visibleluciferaseactivitywassignificantlydecreased(P<0.01,figure4.1),whiletheKCNMA1mutant3'UTRluciferasereportergeneplasmidandmiR-449aweretransfectedintoDRGcellsaftertheluciferaseactivityhadnoobviouseffect.Thisresultshowsthatthe3'UTRregionoftheKCNMA1genecanbeassociatedwithmiR-449a,anditsexpressionisdirectlyregulatedbymiR-449a.5.OfmiRNA-449amRNAandproteinexpressionofKCNMA1inDRGcellsweredetectedbyfluorescencequantitativePCRresultsshowedthatKCNMA1miRNA-449aoverexpressioninDRGcellsandthelevelofmRNAwassignificantlydecreasedto0.58+0.04(p<0.05,comparedwiththenegativecontrolgroup);andVIII nosignificantdifferencescomparedtoblankcontrolgroupandnegativecontrolgroup.WesternblotwasusedtodetecttheexpressionofKCNMA1proteininDRGcells,withtheresultsofmRNAdetection,intheoverexpressionofmiRNA-449a,KCNMA1proteinlevelinDRGcellswassignificantlydecreasedto0.59+0.04(p<0.05,comparedwithnegativecontrolgroup,figure2.3);andnosignificantdifferencescomparedtoblankcontrolgroupandnegativecontrolgroup.ItwasconfirmedthatmiRNA-449acouldinhibittheexpressionofKCNMA1inDRGcells.6.MicewereoperatedonSNIorShamafterthirddaysofDRGmicroinjection,andthebehavioralchangesofmiceatdifferenttimepointsweredetectedinthepreviousexperiments.TheresultsshowedthatthepreoperativemiceineachgroupwerenosignificantdifferencesinMWTvalues;andineachcontrolgroupafterinjectionofDRGmiceMWTvaluehadnosignificantdifference;andafterSNIwereobservedinmiR-449amimics+Shamgrouphadnosignificantchange(comparedwithgroupNaive,p>0.05),miR-449amimics+SNIgroupinpostoperative3,5The7day,theMWTvalueandthebasicvaluesforthisgroup(zerothdays)wassignificantlydecreased(P<0.05);Vehicle+SNIgroupandNC+SNIgroupMWTofmiceafterSNIinthedetectionofalltimepointsweresignificantlyreduced(P<0.05,comparedwiththebaselinevalue).TheresultsofTWLandCWLineachgroupwerethesameasthatofMWL.7.DRGmiceweremicroinjectedthirddaysafterSNIorShamsurgery,thesurgicalsidewereisolated.TheexpressionofDRGwasdetectedbyreal-timefluorescentquantitativePCRKCNMA1mRNAlevelandproteinlevelchanges,testresultsshowedthattheKCNMA1Vehicle+SNIgroup,NC+SNIgroupandmiR-449amimics+SNIgroupinDRGmRNAandproteinlevelsincreasedsignificantly,comparedwiththeinNaivegroup,therewassignificantdifference(p<0.05);nosignificantchangeofmiR-449agroupmimics+ShamKCNMA1andproteinlevelsofmRNA(p>0.05).IX Conclusion1.TheexpressionofmiR-449ainSNIneuropathicpainmicewassignificantlyreduced.2.InDRGcells,miRNA-449acouldtargettheexpressionofinhibitionofKCNMA1.3.ExogenousmiRNA-449acanimprovethepainlevelofSNIneuropathicpainmousemodel,anditseffectmaybecloselyrelatedtotheinhibitionoftheexpressionofKCNMA1.Keywords:neuropathicpain,mousemodel,miR-449a,molecularmechanism,largeconductancecalciumdependentpotassiumchannelMsubgroupX 目录第1章绪论........................................................................................11.1miRNA与神经病理性疼痛的关系...............................................21.2miRNA调控神经病理性疼痛的作用机制...................................31.3立题依据.........................................................................................6第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化.....72.1实验材料.........................................................................................82.1.1实验试剂..................................................................................82.1.2实验仪器..................................................................................92.2实验方法.......................................................................................102.2.1实验动物................................................................................102.2.2动物分组................................................................................102.2.3坐骨神经分支选择性损伤（SNI）小鼠模型的建立..........102.2.4动物行为学测定....................................................................112.2.5背根神经节分离培养............................................................122.2.6miRNA提取...........................................................................132.2.7miRNA预扩增.......................................................................142.2.8TaqMan低密度微阵列芯片PCR反应................................152.2.9实时荧光定量PCR................................................................152.2.10数据统计..............................................................................182.3实验结果.......................................................................................182.3.1模型组小鼠机械痛阈的变化................................................182.3.2模型组小鼠热痛阈的变化....................................................192.3.3模型组小鼠冷痛敏的变化....................................................192.3.4TaqMan低密度微阵列芯片miRNA筛选情况...................20XI 2.3.5实时荧光定量PCR技术验证芯片筛选的miRNA.............212.4讨论...............................................................................................21第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控.......................253.1实验材料.......................................................................................253.1.1实验试剂................................................................................253.1.2实验仪器................................................................................263.2实验方法.......................................................................................273.2.1miR-449a的靶基因预测.......................................................273.2.2坐骨神经分支选择性损伤（SNI）小鼠模型的建立..........273.2.3背根神经节分离培养............................................................283.2.4细胞瞬时转染........................................................................283.2.5荧光素酶报告基因实验........................................................293.2.6实时荧光定量PCR................................................................293.2.7Westernblot............................................................................322.2.8数据统计................................................................................353.3结果...............................................................................................353.3.1miRNA-449a的靶基因预测..................................................353.3.2双荧光素酶报告基因实验....................................................353.3.3miR-449a对DRG细胞中KCNMA1表达的影响..............363.3讨论...............................................................................................38第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制.......................................................................................414.1实验材料.......................................................................................414.1.1实验试剂................................................................................414.1.2实验仪器................................................................................424.2实验方法.......................................................................................434.2.1DRG显微注射术...................................................................434.2.2构建SNI模型........................................................................44XII 4.2.3动物行为学测定....................................................................454.2.3背根神经节分离培养............................................................464.2.4实时荧光定量PCR................................................................474.2.5Westernblot............................................................................494.2.6数据统计................................................................................524.3结果...............................................................................................524.3.1miR-449a对小鼠模型的机械痛行为学的影响...................524.3.2miR-449a对小鼠模型的热痛行为学的影响.......................534.3.3miR-449a对小鼠模型的冷痛行为学的影响.......................544.3.4miR-449a对SNI模型的KCNMA1表达的影响................554.4讨论...............................................................................................56全文小结...................................................................................................61参考文献...................................................................................................63综述.......................................................................................................69参考文献................................................................................................75攻读博士期间所取得的科研成果..........................................................79致谢.........................................................................80XIII 缩略词表英文简称英文全称中文名称miRNAMicroRNA微小RNAmiRNA-449aMicroRNA-449a微小RNA-141CRCColorectalcancer结直肠肠癌PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳mRNAMessengerRNA信使RNADRGDorsalrootganglion背根神经节KCNMA1potassiumlargeconductancecalcium-大电导钙离子依赖的钾activatedchannel,subfamilyM,alpha通道M亚族α亚基member-1dday天hhour小时mminute分钟ssecond秒rpmRevolutionsperminute转/分UTRUntranslatedregion非翻译区XV 第1章绪论第1章绪论神经病理性疼痛（neuropathicpain，NP）又称为神经痛，根据国际疼痛学会（InternationalAssociationfortheStudyofPain，IASP）将神经病理性疼痛定义为由于人体感觉神经系统受损或者疾病引起的疼痛，分为自发性疼痛（spontaneouspain）、痛觉过敏（hyperalgesia）以及异常疼痛（allodynia）等多种临床特征，该系列病理特征可能是由脊髓感觉系统易化引所导致[1]。目前全球范围内神经病理性疼痛的发病率据推测已经3.3%-8.2%，神经病理性疼痛发病机制不明，而且难以有效根治，剧烈的疼痛给患者带来巨大的身体和精神痛苦，已经成为不容忽视的难以治愈的健康问题[2]。在临床上对于神经病理性疼痛的治疗是以抗抑郁药、抗癫痫药以及局部麻醉剂为主，但是上述药物的疗效仍不理想，并且副作用严重[3]，因此明确神经病理性疼痛的发病机制并加快高效低毒药物的研发，已经成为临床研究的热点领域。MicroRNAs（miRNAs）是指由内源基因编码的、核苷酸长度约18-22nt的非编码单链RNA，研究发现miRNA的生物功能是通过对转录后基因表达水平的调控从而参与对人体多种生理功能进行调节[4]。miRNA的生物合成过程分为细胞核内转录和细胞质内加工，首先由基因组转录生成具有发卡结构的miRNA前体（Pre-miRNA），然后经过核酸内切酶Dicer酶的剪切之后得到双链miRNA。双链miRNA在转运进入细胞质中后发生双链解离，其中一条miRNA单链与沉默复合体蛋白（RISC）发生特异性结合，能够与靶基因mRNA的3’非编码区发生结合从而促进mRNA的部分或者完全降解，从而发挥抑制目标基因蛋白转录的[5，6]作用。研究发现，人类基因组中超过20%的基因表达水平受到不同miRNA的调控，因此miRNA已经成为了探索疾病诊断和治疗靶点的重要工具。在多种疼痛相关疾病中，miRNA的表达和调控起到了重要作用。例如，研究发现miRNA-27b能够通过靶向调控基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达而对人骨关节炎的病理进程发挥抑制作用[7]；另外，LiX等的研究证实，miRNA-146a也是表达异常的miRNA之一，并且被认为是骨关节炎中与疼痛密切相关的miRNA，其作用主要1 吉林大学博士学位论文是通过对炎性因子TNF-α和IL-6等的调控来实现[8]。也有研究对慢性膀胱痛患者血清中差异化表达的miRNA进行筛选，证实差异化表达的miR-449b和miR-500能通下调调控神经激肽-1受体的表达，进一步拓宽了慢性疼痛相关分子机制的知识[9]。1.1miRNA与神经病理性疼痛的关系不同疼痛情况下，不同器官组织中miRNA的表达谱也存在不同，尤其在神经病理性疼痛的不同模型中，建立方法和机制以及引起疼痛的效果等方面均存在一定的差异，因此也就导致miRNA的作用和机制也存在差别。1.慢性坐骨神经压迫损伤模型慢性坐骨神经压迫损伤模型（Chronicconstrictioninjuryofsciaticnerve，CCI）是研究神经病理性疼痛的经典模型之一，MasaeArai等人通过建立小鼠CCI模型，对小鼠海马组织中表达发生改变的miRNA进行了筛选，得到了54条表达异常的miRNA，其中miR-125b和-132的表达水平改变最为显著，分别降低为0.70±0.30和0.69±0.30。这一研究表明，慢性坐骨神经压迫损伤引起了海马区神经元基因表达水平的异常，而miRNA也是其中表达异常的重要参与因子[10]。2.神经接结扎模型由于CCI动物模型的建立存在疼痛反应变异问题，因此，研究者们发展了神经接结扎模型（SpinalNerveligaturemodel，SNL），该模型的有点在于动物模型出现疼痛行为的时间更早并且疼痛时间相对更长更稳定。在此模型的基础上，VonSchackD等人采用TaqMan低密度阵列技术检测了背根神经节（DRG）中miRNA表达谱的改变，确定了63个miRNA的表达水平在SNL术后出现了显著改变。其中，59个miRNA的表达出现了下调，并进一步采用不同的生物信息学方法鉴定轴突重塑显著调节生物途径，其中一些预测通过siRNA敲除Neuro2A细胞中与突起生长相关调节基因进行了鉴定，该研究最终提示miRNAs可能在神经病理性疼痛中发挥直接作用[11]。类似的研究较多，但是研究成果存在部分差异，例如，国内的研究团队对SNL小鼠血清中循环miRNA表达进行了鉴定，研究显示，小鼠血清hsa-miR-221，hsa-mir-34c，hsa-mir-21，hsa-mir-30a-5p和hsa-miR-206在SNL手术后下降，而hsa-mir-31-5p，hsa-mir-133b、hsa-miR-22和hsa-mirplus-a10872 第1章绪论均升高，提示miRNA的变化可能参与神经病理性疼痛的调节[12]。这项研究显示了神经性疼痛条件下血清中miRNA的变化，提示血清中的循环miRNAs是神经性疼痛的潜在预测因子。3.脊髓挫伤模型脊髓挫伤（Spinalcordinjury，SCI）的发生会导致较为严重的神经病理损害，并且病程往往会从最早的机械损伤发展为神经元和胶质细胞的损害，最终引发长时间的炎症反应，造成神经元凋亡等不可逆损伤。因此，有研究者在SCI动物模型中发现了miRNA-21的表达增加，能够调控星形胶质细胞的增殖，从而参与调控血脑屏障受损后的增生性反应，星形胶质细胞中miR-21的表达抑制也导致病变部位轴突密度的增加。这些结果表明，miR-21在脊髓损伤后星形胶质细胞增生和调节神经胶质瘢痕进展的作用[13]。4.坐骨神经分支选择性损伤坐骨神经分支选择性损伤（sparednerveinjury，SNI）模型是一种新型的外周神经损伤导致的慢性神经病理性疼痛动物模型，研究认为，SNI动物模型的疼痛行为特征与临床神经病理性疼痛患者有着较高的相似性。SNI手术后动物模型均出现了同侧机械性疼痛超敏、冷痛超敏、热痛超敏等与临床患者类似的病理表现，并且有研究者在SNI动物模型中检验了目前常用的镇痛药物的药理学特点，证实阿片类药物、离子型谷氨酸受体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂等药物的药理学特征与神经病理性疼痛患者存在相似性，是较为理想的神经病理性疼痛研究模型[14，15]。因此有研究者通过构建神经病理性疼痛的小鼠模型，揭示了鞘内注射miR-124治疗能预防和治疗SNI小鼠神经系统持续性炎症和神经性疼痛[16]。1.2miRNA调控神经病理性疼痛的作用机制miRNA的翻译调控是真核生物基因组表达和功能的关键因素。miRNA在真核细胞中发挥调控基因表达水平的作用，主要是通过与靶基因mRNA3’非编码区的结合来实现。miRNA一方面能够与细胞质中的蛋白结合，形成RNA干扰沉默核糖核蛋白复合物，该复合物能够与靶基因mRNA发生互补而降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白转录；此外，miRNA也可以通过与mRNA的不完全互补抑制蛋白的转录。由于神经病理性疼痛本质上可以认为是神经系统对损伤做出的3 吉林大学博士学位论文应激反应，所发生的病理改变与各种蛋白的表达密切相关，包括信号转导分子、[17，18]神经递质、炎性因子和离子通道蛋白等。因此miRNA通过调控不同信号通路相关的蛋白表达，从而对神经病理性疼痛的病理进程发挥了不同的调控作用。1.miRNA调控神经炎症反应miRNA调控炎症反应的作用和机制已在多种疾病中得到了报道，包括恶性肿瘤、呼吸系统以及神经系统疾病等[19]。研究显示，神经炎症的关键因子，包括IL-1β、TNF-α以及IL-6等，在神经病理性疼痛的痛感产生和持续中发挥了重要作用[20]。而具有抑制炎性因子转录的miRNA能够通过对炎性因子的抑制而发挥预防和治疗作用。研究报道，miRNA-155是调控血脑屏障（BBB）功能障碍的关键miRNA。在体外培养的人脑内皮细胞中miR-155能快速而且有效地上调炎症因子表达水平，从而改变细胞因子诱导的通透性增加。此外，miR-155调节大脑内皮屏障功能的靶点蛋白包括Annexin-2和claudin-1等。最终提示miR-155是一种负性调节血脑屏障中枢神经炎性疾病的分子，而这一作用可能是通过调控神经[21，22]元细胞膜Toll受体-4来实现。越来越多的证据支持miRNA参与人类神经系统炎症的调节。例如研究报道，外源性的miR-23b能够抑制神经系统损伤发生后炎症的发生，其作用包括抑制小胶质细胞浸润、减少炎症因子合成以及抑制活[23，24]性氧介导的神经元凋亡。研究人员IyerA等采用荧光定量PCR和原位杂交技术研究了癫痫相关的胶质神经元病变的特点，发现miR-146a能够促进星形胶质细胞中IL-6和TNF-α的表达，其作用靶点可能是IRAK-1，IRAK-2和TRAF-6蛋白家族，证实了miR-146a诱导的负反馈调节参与了星形胶质细胞介导的炎症反应[25]。因此可以肯定的是miRNA能通过对神经炎症的调控，对神经病理性疼痛的发生发展中起到了重要的作用。2.miRNA调控神经修复大量的研究针对miRNA在神经系统损伤后的修复作用进行了深入探索。研究发现，背根神经节（DRG）细胞在神经损伤后发生基因转录变化，从而通过表型改变促进细胞存活和轴突再生。通过慢病毒载体转染miR-21进入分离的小鼠背根神经节中增强miR-21的表达后，观察到过表达miR-21促进神经轴突生长，并且双荧光素酶实验显示miRNA-21调控的靶蛋白为Sprouty2蛋白，从而证实了miRNA-21是外周神经损伤后生长通路的重要因子[26]。另外，VerrierJD等4 第1章绪论人的研究证实，坐骨神经细胞中miR-29能够通过抑制外周神经元髓鞘蛋白22（PMP22）的表达水平，PMP22蛋白是一种主要表达在髓鞘雪旺细胞的疾病相关蛋白，因此miRNA-29在神经系统损伤后修复的过程中发挥抑制作用[27]。此外，研究者采用坐骨神经分支选择性损伤的小鼠模型，证实了小鼠SNI模型中DRG细胞中miRNA-200b和miRNA-429的表达显著下降，其通过调控表观遗传相关蛋白DMNT-3的表达从而对受损神经元的修复、树突重塑等进程进行调控，影响神经病理性疼痛的病理机制[28]。3.miRNA调控中枢以及外周敏化慢性神经病理性疼痛状态的特点是长时间的脊髓神经元敏化，将伤害性信息传递给大脑。而miRNA能够靶向调控伤害感受相关蛋白的表达，包括离子通道蛋白、神经肽以及营养因子等，从而调节人体神经系统对伤害的敏感性[29]。研究发现，在NPP幼年小鼠模型中通过鞘内注射miRNA-103能够有效缓解疼痛，抑制神经中枢敏化，其作用的信号机制主要与miRNA-103-LTC-Cav1.2通道有关[30]。此外，有研究重点检测发现了特定miRNA-96在成年小鼠的背根神经节（DRG）中出现了高度富集，通过脊神经结扎手术（SNL）构建慢性神经病理性疼痛的小鼠模型，证实miRNA-96的表达和分布出现显著改变。miRNA-96在非异常性疼痛的小鼠DRG胞体分布均匀，但在SNL小鼠模型体内miRNA-96主要分布于外周神经元中，提示其可能转录调控慢性神经病理性疼痛相关基因[31]。因此可见，miRNA能够对中枢以及外周神经系统的敏化进行调节。4.miRNA调控中枢去抑制神经病理性疼痛是由神经系统损伤引起的一种慢性疼痛。研究人员主要集中在识别神经源性疼痛的细胞或化学来源，或通过生物学研究神经性疼痛。最近的研究显示，miRNA-23b和NADPH氧化酶4（NOX4）抗体能够减轻动物模型的神经性疼痛，并能特别抑制活性氧（ROS）过度富集引起的神经性疼痛，发挥保护GABA能神经元的作用[32]。此外，在A片样耐受的小鼠模型中，let-7miRNA家族表达水平受到吗啡的增强，而let-7的靶基因为μ受体，其表达升高后抑制μ受体表达[33]。MiRNA本身是人体内的一类具有调控基因组表达功能的内源性因子，参与调控细胞的增殖凋亡，组织分化和功能维持等方面的作用，其在肿瘤的作用以及5 吉林大学博士学位论文机制的研究较为广泛，并且已经有部分研究进入临床应用阶段，但是对于miRNA在神经疼痛方面的研究相对匮乏，近年来，已有研究初步揭示了miRNA在神经病理性疼痛中发挥了关键的调控作用，是NPP加重或减轻的调节因子，因此通过合成神经疼痛相关miRNA的抑制剂或激动剂，有望为神经病理性疼痛的药物研发提供有效的新靶点，但是就目前阶段而言，miRNA与神经病理性疼痛的复杂调节关系仍需要进一步的研究证实。1.3立题依据神经损伤等因素引起的慢性神经病理性疼痛与受损神经元基因表达的变化有关。要了解神经性疼痛的分子机制，必须阐明神经损伤如何改变基因表达，以及这种变化如何促进慢性疼痛的发生和发展。本研究基于前期工作的基础之上，旨在进一步探索神经病理性疼痛中miRNA差异化表达，揭示miRNA在神经病理性疼痛发生发展中的作用及其机制。本研究采用生物化学、分子生物学、细胞生物学以及实验动物学等技术主要开展以下研究：（1）构建小鼠坐骨神经分支选择性损伤（sparednerveinjury，SNI）模型，采用微阵列芯片（microarray）技术检测背根神经节（DRG）中miRNA表达谱的变化，筛选鉴定其中具有显著差异的miRNA；（2）观察小鼠体内特定miRNA过表达后对神经病理性疼痛的影响及其机制；（3）通过体外细胞培养揭示特定miRNA调控DRG生物学行为的信号转导机制。本研究的开展有望为神经病理性疼痛的分子机制研究提供新靶点和新思路，同时也为当前慢性疼痛的临床诊疗提供理论参考。6 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化神经病理性疼痛（Neuroapthicpain，NP）是指由中枢或者神经系统损伤导致的疼痛，病理特征表现为自发痛、痛觉过敏以及痛觉超敏，其发病机制复杂并缺乏有效的治疗手段。普遍认为，机体神经系统受到损伤或出现功能障碍后，神经炎症水平在炎性因子等作用下出现显著升高，由此刺激产生的疼痛信号从神经末梢传感到达脊髓、大脑感觉中枢，从而导致了中枢以及外周神经系统敏化，最终发生持续性的疼痛症状，其临床通常表现出自发痛和痛觉过敏等，这可能与脊髓感觉系统的易化具有密切关系[34]。脊神经根或背根神经节（DRGs）在慢性疼痛中发挥了重要的作用，在受到损伤后会发生多种应激性病理变化，导致经病理性疼痛症状的发生。为了能够有效地模拟患者的临床表征，研究者们已经设计了多种神经病理性疼痛的动物模型，例如慢性坐骨神经压迫损伤模型、神经接结扎模型、脊髓挫伤模型以及坐骨神经分支选择性损伤等。SNI手术后动物模型均出现了同侧机械性疼痛超敏、冷痛超敏、热痛超敏等与临床患者类似的病理表现，与临床患者的表现具有较高的相似性[35]，因此在本研究中我们采用了SNI法构建小鼠神经病理性疼痛模型用于研究。为了能够揭示目标模型中miRNA的调控作用，高通量筛选技术已经广泛地应用于生命科学领域的研究之中。其中微阵列芯片（microarray）已经成为了普遍认可的检测miRNA差异化表达的技术手段。TaqMan低密度微阵列芯片是新近研发改造的高通量检测芯片，其技术优势在于将实时定量PCR技术和TaqMan分析技术相结合，将微流体芯片中预装基于TaqMan分析原理的TaqMan探针和PCR引物，通过PCR反应一张芯片单次检测能够多种miRNA的表达水平，分析数据后能够得到miRNA的表达数据。TaqMan低密度微阵列芯片具有高灵敏度和特异性、所需样本量少、数据重复性高等优点[36]。背根神经节（Dorsalrootganglion，DRG）是位于脊髓硬膜外间隙内双侧背根末端的神经节，其作用是负责中枢神经向外传递信息。在病理情况下，背根神经节处于受损状态后，神经元细胞膜的兴奋程度异常增高并异常放电，向脊髓传7 吉林大学博士学位论文导的异常放电将会引起中枢敏化的现象，从而引发躯体神经病理性疼痛[37]。研究发现，通过给予DRG直接的电刺激能够抑制神经元兴奋性，从而减轻神经病理性疼痛[38]，可见DRG是神经病理性疼痛的关键神经元之一。因此我们通过分离DRG来进行miRNA表达的筛选鉴定。因此，在第一部分的研究中，我们首先通过构建SNI小鼠模型，并在此基础上，检测背根神经节（DRGs）中miRNA表达水平的改变，筛选鉴定得到与神经病理性疼痛密切相关的、表达差异化程度高的miRNA。2.1实验材料2.1.1实验试剂试剂名称生产商DEPC水ThermoFisher公司，美国青霉素生工生物工程股份有限公司链霉素生工生物工程股份有限公司TaqManMicroRNAReverseAppliedBiosystems公司，美国MiRNA预扩增逆转录引物池AppliedBiosystems公司，美国MiRNA预扩增引物池AppliedBiosystems公司，美国TaqmanmiRNA低密度微阵列芯片AppliedBiosystems公司，美国RealtimePCR试剂AppliedBiosystems公司，美国mirVanamiRNAIsolationKitThermoFisher公司，美国DetectionprobesformiR-449a宝生物工程（大连）有限公司LiberaseBlendzyme3罗氏公司，美国无水乙醇吉林博大生化有限公司异丙醇吉林博大生化有限公司氯仿吉林博大生化有限公司多聚甲醛吉林博大生化有限公司8 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化2.1.2实验仪器实验仪器生产商生物安全柜ThermoFisher公司，美国超低温保存箱SANYO公司，日本1μl-1ml移液器Eppendorf公司，德国丝线编织非吸收性缝线强生医疗，美国显微手术剪Roboz公司，美国解剖刀柄Roboz公司，美国组织镊Roboz公司，美国组织牵开器Roboz公司，美国手术剪Roboz公司，美国微量进样器上海实验仪器总厂分光光度计ThermoFisher公司，美国超纯水系统Millipore公司，德国实时荧光定量PCR仪AppliedBiosystems公司，美国超净操作台ThermoFisher公司，美国恒温细胞培养箱ThermoFisher公司，美国梯度PCR仪Bio-Rad公司，美国荧光倒置显微镜Olympus公司，日本制冰机SANYO公司，日本PowerGen匀浆器ThermoFisher公司，美国低温高速离心机Millipore公司，美国化学发光成像仪ThermoFisher公司，美国电子天平SARTORIUS公司，德国电热恒温干燥箱上海实验仪器总厂摇床上海实验仪器总厂高温蒸汽灭菌锅上海实验仪器总厂9 吉林大学博士学位论文2.2实验方法2.2.1实验动物本研究的实验动物选用健康成年雄性无病原体（specificpathogen-fleeSPF）级昆明小鼠，4-5周龄，体重15-20g，实验动物由本医院动物中心统一提供。所提供的小鼠经4周的适应性培养后开展相应研究，小鼠饲养室条件设定为：室温20-25℃，相对湿度50%-70%，自由进食和饮水。本研究的实验设计已经本院伦理委员会批准。所有动物实验的设计和操作均符合国际实验动物准则。2.2.2动物分组本部分的研究，随机选取20只成年雄性昆明小鼠，并按随机数字表法进分为2组：模型组（SNI组，n=10）；假手术组（Sham组，n=10）。2.2.3坐骨神经分支选择性损伤（SNI）小鼠模型的建立本研究中采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）法构建小鼠神经病理性疼痛模型，构建方法参照文献[39,40]并稍微改动，具体步骤如下：（1）SNI组小鼠进行称重记录，使用水合氯醛（100mg/kg）腹腔注射进行麻醉，昆明小鼠麻醉后俯卧放置于操作台上；（2）剔除小鼠左侧后肢的毛，铺垫消毒湿巾，使用手术剪剪开小鼠皮肤和组织，钝性分离小鼠的股二头肌后可以观察到小鼠的坐骨神经；（3）小鼠坐骨神经三处分支为胫神经、腓神经和腓肠神经。使用手术镊将小鼠的胫神经和腓神经进行分离，使用4#丝线进行将神经进行结扎，在结扎的神经中间部分切断，并使用手术剪轻轻去除末端的2-4mm的神经干，然后进行止血，缝合伤口。注意使用链霉素和青霉素进行消炎。（4）sham组小鼠在暴露坐骨神经及其分支之后，不进行结扎等操作，直接进行缝合。手术结束后将各组昆明小鼠共同放置于适宜环境中分开单独饲养。（5）手术过程中操作注意应当避免过度伤害坐骨神经系统，应当注意全程无菌操作，并及时使用青霉素等进行抗菌消炎。此外，术后注意观察各小鼠的生理状态，如发生运动障碍、神经功能障碍或严重感染，则将被排除该实验。10 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化2.2.4动物行为学测定2.2.4.1机械性刺激诱发疼痛的行为学测定各组小鼠的机械性痛阈（Mechanicalwithdrwalthreshold，MWT）采用文献报道的方法进行检测，采用7对VonFrey纤毛递增强度依次为2g、4g、6g、8g、10g、15g、26g用于测定各组小鼠的后肢50%缩足反应阈值（50%PWT）。在正式开始检测的前48小时将待测小鼠放置于底部为金属网格的特制笼子中。每天的检测时间固定为上午9-10点。实验开始之前30分钟将小鼠放置于测试环境中，首先使用2.0g纤毛透过金属网格直接刺小鼠的后足底部，力度要求达到纤毛弯曲S形，刺激时间要求持续3-4s，每次间隔10-15s，如小鼠在VonFrey针移走的时候迅速进行缩足或舔足，则记录为阳性；若无反应，则记录成阴性。若小鼠对刺激的反应为阴性，则继续使用强度递增的VonFrey纤毛刺激。每组小鼠在手术前一天测定其MWT作为基础值，如基础值异常则排除实验。实验结束后进行数据统计，采用VonFrey校正软件对实验数据进行计算。全部检测均由同一工作人员完成，且保持对各组小鼠的分组不知情。2.2.4.2热刺激诱发疼痛的行为学测定每组小鼠在手术前一天测定其左后肢的热缩足反射潜伏期（Thermalwithdrawallatency，TWL）作为基础值，如基础值异常则排除实验。根据文献报道的实验方案，操作步骤如下：（1）打开热痛阈检测设备预热5分钟，根据小鼠的基础反应调整辐射热强度，要求热缩足反射潜伏期保持为10-12秒，仪器的热辐射持续时间最高20秒；（2）实验开始之前将各组小鼠放置于检测仪器的特制玻璃板上30分钟，保证小鼠对检测环境的熟悉，然后调整玻璃温度到25℃。（3）开始检测后，将外红光源对准小鼠的小鼠左后足底部的位置，仪器自动记录小鼠因疼痛感而移动后足的时间；此时间即为TWL值。如小鼠20秒的照射极限内没有反应，则仪器自动停止，防止对小鼠造成烫伤。（4）每只小鼠进行重复测量5次，每次检测的时间间隔5分钟，选取其中居中的三个数据作为可靠数据进行统计。11 吉林大学博士学位论文（5）注意事项：实验过程中应当及时清除小鼠的排泄物，防止其对TWL检测的干扰。2.2.4.3冷刺激诱发疼痛的测定冷缩足潜伏期（Coldwithdrawallatency，CWL）的测定与TWL的测定原理基本一致。首先将仪器的痛觉测试铝板调节至0℃，然后将各组小鼠依次放置于冷板之上，仪器自动记录小鼠在触碰到冷板之后到进行缩足、舔足等反应的时间。仪器的检测极限时间是60秒，防止过低温度对小鼠造成冻伤。每只小鼠进行重复测量5次，每次检测的时间间隔10分钟，选取其中居中的三个数据作为可靠数据进行统计。实验过程中应当及时清除小鼠的排泄物，防止其对CWL检测的干扰。2.2.5背根神经节分离培养本研究使用的背根神经节（Dorsalrootganglia，DRG）从小鼠体内进行分离培养。实验步骤如下：（1）实验前准备工作：使用摇床分离细胞，温度设置37℃；所有实验试剂均通过紫外杀菌和滤膜过滤，保证无菌；手术器械均经过高温杀菌；（2）各组小鼠在实验7d的检测结束之后，各组随机取3只小鼠进行后续研究。首先使用2.5%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉之后，俯卧放置于手术台上，沿着小鼠背部的正中剪开之后，使用手术镊将筋膜和肌肉进行分离，然后移除棘突，将小鼠的脊髓暴露之后使用咬骨钳将L4-6椎板去除，然后在显微镜下轻轻分离L4-6两侧的小鼠背根神经节；（3）取出的小鼠背根神经节迅速放置于预冷预充氧的CSS中，在显微镜下使用眼科镊将包被着背根神经节的结缔组织分离去除，然后将小鼠背根神经节剪碎转移到37℃预热的LiberaseBlendzyme3溶液中，使用移液器将细胞吹打混匀，放置到摇床上进行慢摇消化10分钟，随后放置于低温离心机中1000rpm离心5分钟，去除上清液，向细胞沉淀物中加入提前配置的预热的DMEM/F12完全培养基；（4）再次吹打混匀细胞，使用移液器吸取100μl细胞放置于培养皿上，在显微镜下观察细胞状态和细胞密度；然后将细胞悬液使用DMEM/F12完全培12 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化养基稀释至106个/ml，然后转移到包被多聚赖氨酸的细胞培养皿中进行培养。2.2.6miRNA提取DRG细胞分离培养48小时后，进行总miRNA的提取和预扩增，实验操作根据试剂盒的说明书进行，主要实验步骤操作如下：（1）从细胞培养箱中取出细胞培养板，去除细胞培养液，加入1ml提前配置的1mlQIAzoI（细胞裂解液），轻轻混匀后，放置于室温下5分钟充分反应；（2）向细胞培养板中加入1ml的氯仿，强烈震荡30秒后，室温静置5分钟，保证反应充分，核酸和蛋白质分离完全；（3）使用移液器将上述混合溶液转移到离心管中，放置于低温离心机中离心12000rpm离心10分钟，室温静置5分钟；（4）将离心后的上清液转移到新的离心管中加入100μl的无水乙醇，轻轻震荡混合均匀；（5）再次去除上述混合溶液1ml放置于RNeasyMinElut收集管的离心圆柱中，将收集管放置于离心机中以12000rpm，4℃离心10分钟，室温静置5分钟，弃去上清液，保留沉淀物；（6）向收集管中加入1ml的RWT缓冲液，轻轻震荡混合均匀，将收集管放置于离心机中以12000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清液，保留沉淀物；（7）向收集管中加入1ml的RPE缓冲液，轻轻震荡混合均匀，将收集管放置于离心机中以12000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清液，保留沉淀物；（8）向收集管中加入1ml的80%的乙醇，轻轻震荡混合均匀，将收集管放置于离心机中以12000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清液，保留沉淀物；（9）将上述的RNeasyMinElute离心圆柱取出，然后放置于2m1离心管中，打开盖子，以12000rpm，4℃离心10分钟；（10）将上述的RNeasyMinElute离心圆柱取出，然后放置于2m1离心管中，加100μl的RNase抑制剂到离心柱，以12000rpm，4℃离心1分钟，RNA从膜中转移至离心管底部。13 吉林大学博士学位论文2.2.7miRNA预扩增（1）RNA逆转录反应首先按照下表配置逆转录反应体系溶液：试剂反应体积CustomRTPrimerPool12μldNTPswithdTTP(100mM)0.6μlMultiScribe逆转录酶6μl逆转录缓冲液3μlRNA酶抑制剂0.4μl超纯水3μl总体积25μl（2）PCR仪参数设置如下：16℃30分钟42℃30分钟85℃5分钟4℃至反应结束（3）进行预扩增反应预扩增反应也配置如下表：试剂反应体积TaqManPreampMasterMix25μlCustomPreAmpPrimerPool10μl超纯水5μl总体积45μl（4）梯度PCR仪参数设置如下：95℃10分钟95℃15秒60℃30秒40次循环14 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化2.2.8TaqMan低密度微阵列芯片PCR反应使用TaqMan低密度微阵列芯片筛选各样本中差异化表达的miRNA，实验步骤根据试剂说明书进行，主要步骤如下：（1）PCR反应体系配置如下所示：试剂反应体积TaqManUniversalMasterMixII120μlAmpEraseUNG2μlDilutedPreAmpProduct110μl超纯水68μl总体积300μl（2）按照上述比例配置好的反应体积加入TaqmanmiRNA低密度微阵列芯片中，每个芯片加入8个样本进行检测；（3）加入反应试剂后，将芯片放置于低温离心机中以1000rpm，4℃离心1分钟，保证反应体系能够达到芯片的PCR反应孔；（4）封闭芯片，根据说明书去除芯片的其他部分；（5）将芯片放置于PCR仪中进行扩增；-△△Ct（6）数据的统计分析：采用2法计算各个样本中miRNA的表达差异，计算公式如下：待测样品（test，1）△Ct1=Ct1（目的片段）-Ct1（对照片段）对照样品（control，2）△Ct2=Ct2（目的片段）-Ct2（对照片段）△△Ct=△Ct1-△Ct2-△△CtmiRNA-141表达相对定量=22.2.9实时荧光定量PCR（1）miRNA-445a引物的设计与合成茎环法测定miR-445a的表达水平，茎环序列如下：miR-449a5’-TCAAGCTTTGTGAAGGGGAGGAGCTTCGCCTCCATTCTAGTAGACTTGAT-3’U65'-GCTGCTAGTAGATGGACTTAGGGCCTAGAGTGCCTGGAACGACAGACAGATTCAAC-3'15 吉林大学博士学位论文PCR引物如下：正向引物miR-449a5'-GAGACCGAGATCGCGATTGA-3'；U65'-AGGTTGCCCGATAACTCAAGTC-3'通用的反向引物：5'-GTACGGGCGTAGCGGT-3'（2）提取总RNA取出DRG培养板，去除原细胞培养液，然后加入2ml的TRIzol试剂，吹打混匀，使细胞充分裂解。裂解5min后，转移裂解液到0.1%DEPC水处理后的离心管中，然后加入500μl的氯仿，混匀后静置5min，在4℃低温离心机中以12000rpm的转速离心10min，离心管的液体将会分三层，其中最上层含有总RNA。使用移液器转移上层液体，加入1ml的异丙醇，轻轻混匀静置于室温下约10min，再次放入4℃低温离心机以12000rpm的转速离心10min，去除上层液体后，得到白色沉淀物。向离心管中加入1ml的75%乙醇轻轻洗涤。再次4℃低温离心，7500rpm离心5min，去除上层液体后，得到白色沉淀物。静置于室温下干燥10min，加入40μl的DEPC水，放入55℃水浴中加热8min，得到细胞或组织中的总RNA。（3）RNA测定提取总RNA后，使用紫外分光光度法检测RNA的浓度，将1μl的总RNA溶解于49μl的RNase-free去离子水中，然后加入到已清洗的比色杯中，放入紫外分光光度仪中，分别读取波长260nm及280nm时的吸光度（A，OD值），计算A（260nm）/A（280nm）的值如在1.8-2.1之间表明RNA纯度较好，可以用于后续研究。（4）琼脂糖凝胶电泳首先制备琼脂糖凝胶，配制方法为2g琼脂糖+140ml纯水+20mlMOPS电泳液+36ml30%甲醛溶液。使用上述液体加入到凝胶板中，取出梳子向各个凹槽中分别加入1提取的总RNA，然后分别加入3μl的甲醛染液，加热至65摄氏度5min使样品变性，然后上样，设置电泳仪的参数为6V/cm。（5）RT-PCR扩增a.逆转录反应逆转录反应配制反应液如下：2-20ng总RNA10μl16 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化MicroRNAAssay6μl逆转录酶50U/μl2μl100mMdNTPs（withdTTP）0.3μl10倍逆转录缓冲液3μlRNA酶抑制剂20U/μl0.4μlNuclease-free水8μl总体积30μlb.放入PCR扩增仪上进行逆转录反应16摄氏度30分钟42摄氏度30分钟85摄氏度5分钟逆转录反应完成后，去除离心管放在冰浴中。每个miRNA样品均使用上述的反应体系进行逆转录反应，本实验使用U6作为内参，所用体积3μl。（6）Real-timePCR反应a.PCR反应试剂SmallRNAAssay2μlProductfromRTreaction2.6μlTaqManUniversalPCRMasterMixⅡ20μlNuclease-free水15μl总体积40μlb.PCR仪的参数设置为：95摄氏度10分钟95摄氏度15秒60摄氏度30秒40次循环（7）结果统计各组各样品分别进行RealtimePCR反应，检测miRNA-449a和U6的表达量，计算公式如下：待测样品（test，1）△Ct1=Ct1（目的片段）-Ct1（对照片段）对照样品（control，2）△Ct2=Ct2（目的片段）-Ct2（对照片段）17 吉林大学博士学位论文△△Ct=△Ct1-△Ct2-△△CtmiRNA-449a表达相对定量=22.2.10数据统计本研究采用统计软件SSPS18.0统计和分析原始数据，机械性痛阈值与热痛阈值数据的统计分析采用两因素的重复测量方差分析，其他组间比较均采用单因素方差分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。2.3实验结果2.3.1模型组小鼠机械痛阈的变化模型组小鼠在进行SNI术后恢复良好，生理功能恢复正常。机械刺激缩足反应阈值的测定结果表明，术前两组小鼠的MWT基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的MWT值显著下降至1.13±0.28g，与假手术组相比存在显著差异（P<0.01）；在术后的第5、7天模型组小鼠的MWT值稍有下降趋势，并在第7天MWT达到最低值。而在非手术的对侧，两组小鼠的MWT值均无显著差异，证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后时间的延长呈下降趋势。ABIpsllateral)Contralaterag(3)dlShamg(3odlShamhSNIoshSNIesreh2rTh2lTalw**aa****wrad1rd1htihtiWWwwa0a0P0357dayPday0357图2.1两组小鼠的机械痛阈的变化（n=10）。**P<0.01与sham组小鼠相比。Figure2.1Changesinmechanicalpainthresholdoftwogroupsofmice(n=10).**P<0.01wascomparedwiththemiceinshamgroup.18 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化2.3.2模型组小鼠热痛阈的变化模型组小鼠左后肢热刺激缩足反应阈值与机械刺激的测定结果趋势基本一致。术前两组小鼠的TWL基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的TWL值显著下降至8.65±1.21s，与假手术组相比存在显著差异（P<0.05）；在术后的第5、7天模型组小鼠的TWL值继续下降趋势，并在第7天TWL达到最低值。而在非手术的对侧，两组小鼠的TWL值均无显著差异，证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后时间的延长呈下降趋势。ABIpsllateralContralatera)15s(Sham)s15y(ShamcSNIycnSNIenteal10tall10laaw*warad**rh5**d5ti**htiwwwwaaP0P00357day0357day图2.2两组小鼠的热痛阈的变化（n=10）。*P<0.05与sham组小鼠相比，**P<0.01与sham组小鼠相比。Figure2.2Changesinthethermalpainthresholdofthetwogroupsofmice(n=10).*P<0.05and**P<0.01wascomparedwiththemiceinshamgroup.2.3.3模型组小鼠冷痛敏的变化模型组小鼠左后肢热刺激缩足反应阈值的改变和TWL大体一致。术前两组小鼠的CWT基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的CWT值显著下降至41.70±6.09S，与假手术组相比存在显著差异（P<0.05）；在术后的第5、7天模型组小鼠的CWT值稍有下降趋势，并在第7天CWT达到最低值。证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后时间的延长呈下降趋势。19 吉林大学博士学位论文Ipsllateral)60s(ShamycSNInetal40la*w**ard**h20ti**wwaP0day0357图2.3两组小鼠的冷痛敏的变化（n=10）。*P<0.05与sham组小鼠相比，**P<0.01与sham组小鼠相比。Figure2.3Changesincoldpainsensitivityinthetwogroupsofmice(n=10).*P<0.05and**P<0.01wascomparedwiththemiceinshamgroup.2.3.4TaqMan低密度微阵列芯片miRNA筛选情况TaqMan低密度微阵列芯片miRNA筛选结果如表1.1所示，其中miRNA-449a和miRNA-185在SNI小鼠模型的DRG中的表达有显著性差异（P<0.05）。表2.1SNI小鼠DRG表达失调的miRNATable2.1miRNAofDRGexpressioninSNImiceAverageCtvaluesAverageCtvaluesmiRslogFCP-valueofmiRlevelsofmiRlevels（SNI）（Sham）miR-6853.3540.2459578.2684999716.167500019miR-337-3p1.72650.3802659.6989998828.222500086miR-139-3p1.45350.2202824.2662500153.332000137miR-6871.3570.3703715.7849999674.99000001miR-365-1.40850.2253185.1132500176.48149991miR-101a-1.420.0996386.2185000187.390500069miR-339-5p-1.50950.1976065.3557499656.210500002miR-130b-2.0020.1446557.5302498349.433000089miR-449a-2.32250.0398367.3602499969.310999873miR-185-2.4070.0486126.3087500338.40450015120 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化2.3.5实时荧光定量PCR技术验证芯片筛选的miRNA采用实时荧光定量PCR技术检测SNI小鼠模型及对照组正常小鼠DRG中miR-449a和miR-185的表达情况，以便排除假阳性结果。PCR定量检测结果显示，在术后第3天，miR-449a和miRNA-185在SNI小鼠的DRG中表达均有显著差异，其中miRNA-449a的表达差异化水平最高。并且随术后时间延长，miR-449a和miRNA-185的表达水平进一步下降，其中miRNA-449a的差异化水平更显著。A1.5BnShamoi1.5sSNInShamsoeirsSNIp1.0sxerE1.0pax9**E**4548-0.5**1A-0.5ANNRiRiMM0.00.0037037图2.5两组小鼠DRG细胞中miRNA-449a和miRNA-185的表达水平。*P<0.05与sham组小鼠相比，**P<0.01与sham组小鼠相比。Figure2.5TheexpressionofmiRNA-449aandmiRNA-185inDRGcellsoftwogroupsofmice.*P<0.05and**P<0.01wascomparedwiththemiceinshamgroup.2.4讨论在第一章的研究中，为了揭示miRNA表达在神经病理性疼痛中的调控作用，我们通过构建SNI小鼠模型并分离DRG检测miRAN表达谱的改变，筛选得到其中差异化表达水平的miRNA-449a用于开展后续研究。模型组小鼠在进行SNI术后恢复良好，生理功能恢复正常。机械刺激缩足反应阈值的测定结果表明，术前两组小鼠的MWT基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的MWT值显著下降至1.13±0.28g，与假手术组相比存在显著差异（P<0.01）；在术后的第5、7天模型组小鼠的MWT值稍有下降趋势，并在第7天MWT达到最低值。而在非手术的对侧，两组小鼠的MWT值均无显著差异，证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后21 吉林大学博士学位论文时间的延长呈下降趋势。模型组小鼠左后肢热刺激缩足反应阈值与机械刺激的测定结果趋势基本一致。术前两组小鼠的TWL基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的TWL值显著下降至8.65±1.21s，与假手术组相比存在显著差异（P<0.05）；在术后的第5、7天模型组小鼠的TWL值继续下降趋势，并在第7天TWL达到最低值。而在非手术的对侧，两组小鼠的TWL值均无显著差异，证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后时间的延长呈下降趋势。模型组小鼠左后肢热刺激缩足反应阈值的改变和TWL大体一致。术前两组小鼠的CWT基础值无显著差异，在SNI术后第3天，观察到模型组小鼠的CWT值显著下降至41.70±6.09S，与假手术组相比存在显著差异（P<0.05）；在术后的第5、7天模型组小鼠的CWT值稍有下降趋势，并在第7天CWT达到最低值。证实模型组小鼠的手术侧对机械刺激的痛阈显著降低，并随术后时间的延长呈下降趋势。上述检测结果证实，小鼠神经病理性疼痛模型构建成功。SNI法是目前较为新型的建模方法。研究认为，SNI动物模型的疼痛行为特征与临床神经病理性疼痛患者有着较高的相似性。SNI手术后动物模型均出现了同侧机械性疼痛超敏、冷痛超敏、热痛超敏等与临床患者类似的病理表现，并且有研究者在SNI动物模型中检验了目前常用的镇痛药物的药理学特点，证实阿片类药物、离子型谷氨酸受体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂等药物的药理学特征与神经病理性疼痛患者存在相似性，是较为理想的神经病理性疼痛研究模型[40,41]。因此有研究者通过构建神经病理性疼痛的小鼠模型，揭示了鞘内注射miR-124治疗能预防和治疗SNI小鼠神经系统持续性炎症和神经性疼痛[42]。为了筛选和鉴定特定miRNA调控神经病理性疼痛的作用，我们采用TaqMan低密度微阵列芯片miRNA筛选两组小鼠DRG中miRNA的表达情况，我们在SNI小鼠模型中采用TaqMan低密度微阵列芯片筛选miRNA的表达，miRNA-449a和miRNA-185在SNI小鼠模型的DRG细胞中表达有显著性差异（P<0.05）。利用实时定量PCR技术DRG细胞中进一步验证miR-449a和miR-185的表达情况，以便排除假阳性结果。最终结果显示，miR-449a和miRNA-185在SNI小鼠的DRG细胞中表达均有显著差异，其中miRNA-449a的表达差异化水平最高。22 第2章慢性神经病理性疼痛模型的建立及miRNA表达谱变化因此我们在后续的研究中，针对miRNA-449a开展起作用及其机制研究。背根神经元异常放电是神经病理性疼痛的关键因素之一，其机制可能是与触痛觉信号传导相关。病理条件下，DRG受损，轴突功能出现异常，导致了电信号传递功能异常。其分子机制可能与神经元部分基因表达异常有关，例如多种神经肽类物质、离子通道蛋白、γ-氨基丁酸受体、突触囊泡蛋白等[43]，研究发现，坐骨神经发生离断后，c-Jun和Jun-D蛋白表达显著增加，能够将外周神经的伤害转化为电信号转导到中枢神经，影响神经病理性疼痛形成[44]。此外，DRG也是神经炎症引起疼痛的关键细胞，ChenS等的研究揭示LPS诱导DRG产生神经炎症反应，炎性因子的级联释放，会导致外周神经和中枢神经的敏化，其作用机制是通过调控TLR-MyD88–TAK1信号通路来实现[45]。miRNA的翻译调控是真核生物基因组表达和功能的关键因素。miRNA在真核细胞中发挥调控基因表达水平的作用，主要是通过与靶基因mRNA3’非编码区的结合来实现。miRNA一方面能够与细胞质中的蛋白结合，形成RNA干扰沉默核糖核蛋白复合物，该复合物能够与靶基因mRNA发生互补而降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白转录；此外，miRNA也可以通过与mRNA的不完全互补抑制蛋白的转录。由于神经病理性疼痛本质上可以认为是神经系统对损伤做出的应激反应，所发生的病理改变与各种蛋白的表达密切相关，包括信号转导分子、神经递质、炎性因子和离子通道蛋白等[46,47]。因此miRNA通过调控不同信号通路相关的蛋白表达，从而对神经病理性疼痛的病理进程发挥了不同的调控作用。23 吉林大学博士学位论文24 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控最早在1993年，研究者Ambro等人在线虫体内证实了miRNA的存在，其将研究成果发表在《Cell》等权威期刊，随后引起了学术界的极大兴趣，大量针对miRNA的功能和作用的研究得以开展，其成果也在逐渐向临床转化[37]。研究已经证实，人类基因组中超过50%的miRNA定位于染色体的脆性位点序列，这就表明人体内miRNA的表达更容易发生异常表达，从而在多种疾病中产生调控作用[47]。神经病理性疼痛的发生发展的进程受到多种基因的调控作用，在发病的各个阶段其参与调控的miRNA种类和强度也有所差异，形成了一个长期而复杂的调控过程。近年来，大量的研究已经揭示，神经病理性疼痛患者体内存在着多种特异性表达的miRNA，在神经病理性疼痛的诊断、预后判断和靶向治疗等方面均具有巨大价值[48]。在我们第一部分的研究中已经揭示了miRNA-449a在神经病理性疼痛小鼠模型中存在显著降低，但是对于其具体作用仍需进一步探索。因此在本部分的研究中，我们在体外研究中对miRNA-449a的调控机制进行了探索。3.1实验材料3.1.1实验试剂试剂名称生产商DEPC水ThermoFisher公司，美国青霉素生工生物工程股份有限公司链霉素生工生物工程股份有限公司RealtimePCR试剂AppliedBiosystems公司，美国mirVanamiRNAIsolationKitThermoFisher公司，美国DetectionprobesformiR-449a宝生物工程（大连）有限公司无水乙醇吉林博大生化有限公司异丙醇吉林博大生化有限公司25 吉林大学博士学位论文氯仿吉林博大生化有限公司多聚甲醛吉林博大生化有限公司RNaseASigma公司，美国DNA酶Sac内切I/XbalPomega公司，美国DNAmarkerPomega公司，美国DNA连接酶Pomega公司，美国DNA凝胶回收试剂盒Pomega公司，美国ECL化学发光检测试剂盒Pomega公司，美国Dual-luciferase试剂盒Pomega公司，美国GAPDH抗体CST公司，美国KCNMA1抗体CST公司，美国多聚甲醛Invitrogen公司辣根过氧化酶（HRP）标记的抗地高辛抗体Invitrogen公司BSA牛血清白蛋白ThermoFisher公司，美国3.1.2实验仪器实验仪器生产商生物安全柜ThermoFisher公司，美国超低温保存箱SANYO公司，日本1μl-1ml移液器Eppendorf公司，德国丝线编织非吸收性缝线强生医疗，美国显微手术剪Roboz公司，美国解剖刀柄Roboz公司，美国组织镊Roboz公司，美国组织牵开器Roboz公司，美国手术剪Roboz公司，美国微量进样器上海实验仪器总厂分光光度计ThermoFisher公司，美国超纯水系统Millipore公司，德国实时荧光定量PCR仪AppliedBiosystems公司，美国超净操作台ThermoFisher公司，美国26 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控恒温细胞培养箱ThermoFisher公司，美国梯度PCR仪Bio-Rad公司，美国荧光倒置显微镜Olympus公司，日本制冰机SANYO公司，日本PowerGen匀浆器ThermoFisher公司，美国低温高速离心机Millipore公司，美国化学发光成像仪ThermoFisher公司，美国电子天平SARTORIUS公司，德国电热恒温干燥箱上海实验仪器总厂摇床上海实验仪器总厂高温蒸汽灭菌锅上海实验仪器总厂3.2实验方法3.2.1miR-449a的靶基因预测使用Targetscan、miRBase和miRGenTargets三个数据库，并结合已有文献，对miR-449a的下游靶基因进行预测分析，然后从中选择与神经病理性疼痛最为密切相关的靶基因作为研究目标。3.2.2坐骨神经分支选择性损伤（SNI）小鼠模型的建立本研究中采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）法构建小鼠神经病理性疼痛模型，构建方法参照文献[39]并稍微改动，具体步骤如下：（1）SNI组小鼠进行称重记录，使用水合氯醛（100mg/kg）腹腔注射进行麻醉，昆明小鼠麻醉后俯卧放置于操作台上；（2）剔除小鼠左侧后肢的毛，铺垫消毒湿巾，使用手术剪剪开小鼠皮肤和组织，钝性分离小鼠的股二头肌后可以观察到小鼠的坐骨神经；（3）小鼠坐骨神经三处分支为胫神经、腓神经和腓肠神经。使用手术镊将小鼠的胫神经和腓神经进行分离，使用4#丝线进行将神经进行结扎，在结扎的神经中间部分切断，并使用手术剪轻轻去除末端的2-4mm的神经干，然后进行止血，缝合伤口。注意使用链霉素和青霉素进行消炎。（4）sham组小鼠在暴露坐骨神经及其分支之后，不进行结扎等操作，直接进27 吉林大学博士学位论文行缝合。手术结束后将各组昆明小鼠共同放置于适宜环境中分开单独饲养。（5）手术过程中操作注意应当避免过度伤害坐骨神经系统，应当注意全程无菌操作，并及时使用青霉素等进行抗菌消炎。此外，术后注意观察各小鼠的生理状态，如发生运动障碍、神经功能障碍或严重感染，则将被排除该实验。3.2.3背根神经节分离培养本研究使用的背根神经节（Dorsalrootganglia，DRG）从小鼠体内进行分离培养。实验步骤如下：（1）实验前准备工作：使用摇床分离细胞，温度设置37℃；所有实验试剂均通过紫外杀菌和滤膜过滤，保证无菌；手术器械均经过高温杀菌；（2）各组小鼠在实验7d的检测结束之后，各组随机取3只小鼠进行后续研究。首先使用2.5%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉之后，俯卧放置于手术台上，沿着小鼠背部的正中剪开之后，使用手术镊将筋膜和肌肉进行分离，然后移除棘突，将小鼠的脊髓暴露之后使用咬骨钳将L4-6椎板去除，然后在显微镜下轻轻分离L4-6两侧的小鼠背根神经节；（3）取出的小鼠背根神经节迅速放置于预冷预充氧的CSS中，在显微镜下使用眼科镊将包被着背根神经节的结缔组织分离去除，然后将小鼠背根神经节剪碎转移到37℃预热的LiberaseBlendzyme3溶液中，使用移液器将细胞吹打混匀，放置到摇床上进行慢摇消化10分钟，随后放置于低温离心机中1000rpm离心5分钟，去除上清液，向细胞沉淀物中加入提前配置的预热的DMEM/F12完全培养基；（4）再次吹打混匀细胞，使用移液器吸取100μl细胞放置于培养皿上，在显微镜下观察细胞状态和细胞密度；然后将细胞悬液使用DMEM/F12完全培养基稀释至106个/ml，然后转移到包被多聚赖氨酸的细胞培养皿中进行培养。3.2.4细胞瞬时转染分离培养的DRG培养于DMEM/F12完全培养基中，放置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中。培养48h后取出培养板中，去除原培养液，加入500μl的无血28 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控清OptiMEM，加入1μl的lipofectamine2000、200ng的质粒和miRNA-449amimics，轻轻震荡混匀之后放置回恒温培养箱中静置6小时，取出细胞培养板去除转染试剂，加入DMEM/F12完全培养基培养48小时。再次加入胰蛋白酶消化，收集细胞进行检测。3.2.5荧光素酶报告基因实验荧光素酶报告基因是通过荧光素作为底物从而能够对萤火虫荧光素酶活性进行测定的报告系统，其发出的荧光强度可以使用化学发光仪等设备进行测定。由于荧光素和荧光素酶的荧光反应灵敏，能够准确地检测目标基因的表达，是目前检测转录因子与靶基因的启动子DNA相互作用的检测技术。a.构建荧光素酶报告基因载体使用PCR技术扩增KCNMA1基因的3'UTR序列的扩增引物序列如下：上游引物：5'-CGCGACTATAGTGGCGATGTGCA-3'下游引物：5'-GCAATCTTATCACGTGCGCTT-3'b.双荧光素酶报告基因检测（1）稳定转染后的DRG细胞密度超过80%进行传代和种板的操作，按照104/孔的浓度种到24孔板中，进行转染，混匀，室温静置5-10分钟。（2）预测靶基因的3'-UTR的报告质粒的miR-449a模拟物，混匀，室温静置5-10分钟，实验前校正仪器。（3）转染48h后，弃去培养基，通过使用1×PBS进行洗涤3次，混匀，室温静置5-10分钟，后续操作按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明书进行。首先加入每孔50μL的阳性裂解缓冲液，混匀，室温静置5-10分钟，然后吸取上清液，加入报告酶，第一次读数由F.表示，混匀，室温静置5-10分钟。然后再次读取测量值R。相对荧光素酶活性（相对荧光素酶活性，RLA）表示，每个实验设置3个复孔。（4）使用机器软件进行数据统计和结果分析。3.2.6实时荧光定量PCR（1）miRNA-449a引物的设计与合成茎环法测定miR-449a的表达水平，茎环序列如下：29 吉林大学博士学位论文miR-449a5’-TCAAGCTTTGTGAAGGGGAGGAGCTTCGCCTCCATTCTAGTAGACTTGAT-3’U65'-GCTGCTAGTAGATGGACTTAGGGCCTAGAGTGCCTGGAACGACAGACAGATTCAAC-3'PCR引物如下：正向引物miR-449a5'-GAGACCGAGATCGCGATTGA-3'；U65'-AGGTTGCCCGATAACTCAAGTC-3'通用的反向引物：5'-GTACGGGCGTAGCGGT-3'（2）提取总RNA取出DRG培养板，去除原细胞培养液，然后加入2ml的TRIzol试剂，吹打混匀，使细胞充分裂解。裂解5min后，转移裂解液到0.1%DEPC水处理后的离心管中，然后加入500μl的氯仿，混匀后静置5min，在4℃低温离心机中以12000rpm的转速离心10min，离心管的液体将会分三层，其中最上层含有总RNA。使用移液器转移上层液体，加入1ml的异丙醇，轻轻混匀静置于室温下约10min，再次放入4℃低温离心机以12000rpm的转速离心10min，去除上层液体后，得到白色沉淀物。向离心管中加入1ml的75%乙醇轻轻洗涤。再次4℃低温离心，7500rpm离心5min，去除上层液体后，得到白色沉淀物。静置于室温下干燥10min，加入40μl的DEPC水，放入55℃水浴中加热8min，得到细胞或组织中的总RNA。（3）RNA测定提取总RNA后，使用紫外分光光度法检测RNA的浓度，将1μl的总RNA溶解于49μl的RNase-free去离子水中，然后加入到已清洗的比色杯中，放入紫外分光光度仪中，分别读取波长260nm及280nm时的吸光度（A，OD值），计算A（260nm）/A（280nm）的值如在1.8-2.1之间表明RNA纯度较好，可以用于后续研究。（4）琼脂糖凝胶电泳首先制备琼脂糖凝胶，配制方法为2g琼脂糖+140ml纯水+20mlMOPS电泳液+36ml30%甲醛溶液。使用上述液体加入到凝胶板中，取出梳子向各个凹槽中分别加入1提取的总RNA，然后分别加入3μl的甲醛染液，加热至65摄氏度5min使样品变性，然后上样，设置电泳仪的参数为6V/cm。30 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控（5）RT-PCR扩增a.逆转录反应逆转录反应配制反应液如下：2-20ng总RNA10μlMicroRNAAssay6μl逆转录酶50U/μl2μl100mMdNTPs（withdTTP）0.3μl10倍逆转录缓冲液3μlRNA酶抑制剂20U/μl0.4μlNuclease-free水8μl总体积30μlb.放入PCR扩增仪上进行逆转录反应16摄氏度30分钟42摄氏度30分钟85摄氏度5分钟逆转录反应完成后，去除离心管放在冰浴中。每个miRNA样品均使用上述的反应体系进行逆转录反应，本实验使用U6作为内参，所用体积3μl。（6）Real-timePCR反应a.PCR反应试剂SmallRNAAssay2μlProductfromRTreaction2.6μlTaqManUniversalPCRMasterMixⅡ20μlNuclease-free水15μl总体积40μlb.PCR仪的参数设置为：95摄氏度10分钟95摄氏度15秒60摄氏度30秒40次循环（7）结果统计31 吉林大学博士学位论文各组各样品分别进行RealtimePCR反应，检测miRNA-449a和U6的表达量，计算公式如下：待测样品（test，1）△Ct1=Ct1（目的片段）-Ct1（对照片段）对照样品（control，2）△Ct2=Ct2（目的片段）-Ct2（对照片段）△△Ct=△Ct1-△Ct2-△△CtmiRNA-449a表达相对定量=23.2.7Westernblot1）制备Western的试剂a）10×电泳缓冲液，体积1L25.0gTris碱11g昆明S133g甘氨酸加超纯至体积1L，室温保存待用b）10×TBS试剂78gNaCl25.6gTris碱加入900ml超纯水进行溶解，使用盐酸调节pH至7.5，补充溶液体积至1L，4°C保存待用c）10%浓度AP，体积10ml10gAP100ml超纯水-20°C保存待用d）转膜缓冲液，体积1L10×转膜液：32.2gTris试剂150.14g甘氨酸配成1L，室温保存待用稀释为1×转膜液：加入80ml的10×转膜液+720ml超纯水＋200ml甲醇e）TBST（0.1%Tween-20），体积1L32 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控Tween201mlTBS1000ml4°C保存待用f）5%牛奶TBST，体积100ml5g光明脱脂奶粉100mlTBST4°C保存待用g）1%牛奶TBST，体积100ml5g光明脱脂奶粉100mlTBST4°C保存待用2）提取细胞总蛋白在细胞传代的时候将DRG细胞按照106/孔的密度接种于6孔板中，37°C培养至细胞融合度达到80%以上后，将细胞培养板取出放置于冰板上进行操作。去除原有的细胞培养液，然后加入预冷PBS的溶液轻轻洗三次，向六孔板中分别加入100μl的RIPA细胞裂解液（RIPA中含有1μl的PMSF和ProteaseInhibitorCocktail），然后使用1ml的枪头进行吹打，放在冰板上静置40分钟，然后使用细胞刮刀处理细胞，使用移液枪裂解液移入新的离心管中放入离心机进行离心，4°C、12000rpm进行离心15分钟，洗去上清液。然后使用BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度后，-80°C保存待用。3）SDS-PAGE蛋白质电泳a）10%分离胶超纯水2.5ml丙烯酰胺8ml1.5MTris-HCl/昆明S（pH7.4）5ml10%AP200µLTEMED8µL加入超纯水至总体积为20ml，将分离胶液体混合均匀后加入电泳槽中，并加入2ml的异丙醇排除气泡，将分离胶放在室温下约1h左右可观察到胶体凝固，然后倒掉异丙醇，分离胶用于后续的电泳。33 吉林大学博士学位论文b）5%浓缩胶超纯水8.2ml丙烯酰胺2ml0.5MTris-HCl/昆明S（pH7.4）1.5ml10%AP120µLTEMED12µL加入超纯水至体积为12ml，配置好之后将液体混匀，然后缓慢加入电泳槽的凹槽中，将分离胶放在室温下约1h左右可观察到胶体凝固，然后倒掉异丙醇，分离胶用于后续的电泳。4）蛋白样品制备及点样将细胞裂解液的提取的细胞蛋白按照20μg/每个样品进行电泳，每个样品中加入5μl的上样缓冲液，轻轻混匀，放在沸水浴中加热5分钟，然后常温、12000rpm离心5分钟，吸取上清液进行电泳。5）昆明S-PAGE电泳将待测样品加入电泳仪中，设置参数为60V、40分钟，观察到蓝色上样缓冲液进行分离胶体中之后，更改电压改为120V，电泳至条带到胶体中下方结束。6）转膜及杂交电泳结束后，取出含有蛋白的分离胶放置于缓冲液室温静置15分钟左右，然后将分离胶放置于PVDF膜中，然后加入一定体积的甲醇进行湿润，然后转移到电转仪中进行转膜，参数设置为200mA，3小时。电转结束后取出PVDF膜，将PVDF膜放置于容器中，然后加入提前已经制备好的封闭液（5%milk-TBST）中静置大约1小时，封闭结束后去除封闭液，然后加入提前制备的1%milk-TBST/TBST进行洗涤三次，每次5分钟，洗涤结束后加入已经稀释过的目标蛋白的一抗，PVDF膜完全浸入一抗溶液中，然后放置于4°C冰箱内振荡过夜。次日去除一抗溶液，使用PBS溶液轻轻洗涤三次，然后加入1ml的稀释过的荧光素二抗，避光条件下静置1h。去除二抗的孵育液，然后使用预冷的PBS溶液进行振荡洗涤。7）显色将已经制备好的PVDF膜放置于双色红外成像系统中，软件设置相应的激发波长，进行化学发光显色并拍照。WB的照片使用ImageJ软件进行灰度值分析，34 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控以A（目的蛋白）/A（β-actin）的灰度值的比值作为蛋白水平的定量计算。2.2.8数据统计本研究采用统计软件SSPS18.0统计和分析原始数据，数据均以MEAN±SD的形式表示，机械性痛阈值与热痛阈值数据的统计分析采用两因素的重复测量方差分析，其他组间比较均采用单因素方差分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。3.3结果3.3.1miRNA-449a的靶基因预测我们首先采用生物信息学技术对miRNA-449a调控的靶基因进行了预测，通过在线数据库TargetScan、miRBase、miRGenTargets预测miR-449a的靶基因为KCNMA1，初步结合Blast数据库验证，初步假设KCNMA1的3’UTR区域存在与miR-449a的5’端发生互相作用的结构序列，因此我们继续验证miRNA-449a是否能够调控KCNMA1。表3.1miRNA-449a的靶基因预测。Table3.1miRNA-449atargetgeneprediction.3.3.2双荧光素酶报告基因实验为了进一步验证KCNMA1是miR-449a调控的靶基因，我们分别构建了包括了KCNMA1的野生型和突变型3'UTR的荧光酶报告基因质粒，经检测荧光素酶相对活性值为：miR-449a-NC-3'UTR-WT（0.91±0.07）；miR-449a-H+3'UTR-WT（0.52±0.06）；miR-449a-NC+3'UTR-MUT（0.96±0.09）；miR-449a-H+3'UTR-MUT（0.94±0.08）。经双荧光素酶报告基因检测的结果表明，KCNMA1野生型的3'UTR基因报告质粒与miR-449a共转染DRG细胞后，可见荧光素酶的活性显著下降（P<0.01，35 吉林大学博士学位论文图4.1），而KCNMA1突变型3'UTR的荧光酶报告基因质粒与miR-449a共转染DRG细胞后对荧光素酶的活性无显著影响。这一结果表明，KCNMA1基因的3'UTR区能够与miR-449a发生结合，其表达直接受到miR-449a的调控。y1.5tivitcae1.0sareficul**0.5evitaleR0.0ABCD图3.1双荧光素酶报告基因实验。A：miR-449a-NC-3'UTR-WT；B：miR-449a-H+3'UTR-WT；C：miR-449a-NC+3'UTR-MUT；D：miR-449a-H+3'UTR-MUT。**表示P<0.01与A组相比。Figure3.1Doubleluciferasereportergeneexperiment.A:miR-449a-NC-3'UTR-WT;B:miR-449a-H+3'UTR-WT;C:miR-449a-NC+3'UTR-MUT;D:miR-449a-H+3'UTR-MUT.***indicatesthatP<0.01iscomparedwiththeAgroup.3.3.3miR-449a对DRG细胞中KCNMA1表达的影响miRNA调控基因表达的作用主要是通过对靶基因mRNA的降解或翻译抑制来实现，为了进一步确认miR-449a对KCNMA1基因表达的作用，我们对miRNA-449a过表达的DRG细胞中KCNMA1的mRNA和蛋白进行检测，荧光定量PCR结果显示，miRNA-449a过表达的DRG细胞中KCNMA1的mRNA水平显著下降为0.58±0.04（P<0.05，与阴性对照组相比）；而空白对照组与阴性对照组相比无显著差异。36 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控1.5level1AA1.0NMRNmC**eKvfito0.5aleR0.0BlankmiR-449a-NCmiR-449a-H图3.2miR-449a对DRG细胞中KCNMA1mRNA的影响。**表示P<0.01与阴性对照组相比。Figure3.2TheeffectofmiR-449aonKCNMA1mRNAinDRGcells.**indicatedthatP<0.01wascomparedwiththenegativecontrolgroup.Westernblot检测了DRG细胞中KCNMA1蛋白的表达，结果与mRNA检测一致，在miRNA-449a过表达后，DRG细胞中KCNMA1的蛋白水平显著下降为0.59±0.04（P<0.05，与阴性对照组相比，图2.3）；而空白对照组与阴性对照组相比无显著差异。证实miRNA-449a能够抑制DRG细胞中KCNMA1的表达。1.5level1niA1.0etMoN*rpCKefvio0.5taleR0.0BlankmiRNA-449a-NCmiRNA-449a-H图3.3miR-449a对DRG细胞中KCNMA1蛋白的影响。*表示P<0.05与阴性对照组相比。Figure3.3TheeffectofmiR-449aonKCNMA1proteininDRGcells.*indicatedP<0.05wascomparedwiththatofthenegativecontrolgroup.37 吉林大学博士学位论文3.4讨论生物信息学是随着现代计算机技术的发展而出现的一种更有效的新的miRNA识别技术，是基于计算机信息程序或预测软件的基础上结合基因组序列识别的方法来工作的。该技术的核心是计算机信息程序的开发与设计。目前，许多研究机构已经有了自己成功的应用软件程序，并在此基础上可以有效地预测和验证大量的miRNA。这些计算机程序各有优缺点。然而，其核心原则仍然是miRNA的核苷酸序列与其靶基因的互补性、目标基因序列的保存、两个聚合物本身的热稳定性以及相邻序列的二级结构等。研究者设计的TargetScan主要是基于复杂的种子序列原理，使预测结果的精确度得到了显著提高。预测软件iRanda则是通过将miRNA与靶基因特异性结合后的结构保守性及结构的自身热稳定性作为软件参数；RNAhybrid的研究重点则在于RNA二级结构及附近结构的稳定性[49-51]。计算误差是计算机软件计算中不可避免的问题。同时，不同计算方法产生的计算结果也会带来不同的结果。我们首先采用生物信息学技术对miRNA-449a调控的靶基因进行了预测，通过在线数据库TargetScan、miRBase、miRGenTargets预测miR-449a的靶基因为KCNMA1，初步结合Blast数据库验证，初步假设KCNMA1的3’UTR区域存在与miR-449a的5’端发生互相作用的结构序列，因此我们继续验证miRNA-449a是否能够调控KCNMA1。为了进一步验证KCNMA1是miR-449a调控的靶基因，我们分别构建了包括了KCNMA1的野生型和突变型3'UTR的荧光酶报告基因质粒，经检测荧光素酶相对活性值为：miR-449a-NC-3'UTR-WT（0.93±0.06）；miR-449a-H+3'UTR-WT（0.57±0.05）；miR-449a-NC+3'UTR-MUT（0.97±0.08）；miR-449a-H+3'UTR-MUT（0.96±0.06）。经双荧光素酶报告基因检测的结果表明，KCNMA1野生型的3'UTR基因报告质粒与miR-449a共转染DRG细胞后，可见荧光素酶的活性显著下降（P<0.01，图4.1），而KCNMA1突变型3'UTR的荧光酶报告基因质粒与miR-449a共转染DRG细胞后对荧光素酶的活性无显著影响。这一结果表明，KCNMA1基因的3'UTR区能够与miR-449a发生结合，其表达直接受到miR-449a的调控。MicroRNAs（miRNAs）是指由内源基因编码的、核苷酸长度约18-22nt的38 第3章体外实验研究miR-449a对相关基因的调控非编码单链RNA，研究发现miRNA的生物功能是通过对转录后基因表达水平的调控从而参与对人体多种生理功能进行调节[52,53]。miRNA的生物合成过程分为细胞核内转录和细胞质内加工，首先由基因组转录生成具有发卡结构的miRNA前体（Pre-miRNA），然后经过核酸内切酶Dicer酶的剪切之后得到双链miRNA。双链miRNA在转运进入细胞质中后发生双链解离，其中一条miRNA单链与沉默复合体蛋白（RISC）发生特异性结合，能够与靶基因mRNA的3’非编码区发生结合从而促进mRNA的部分或者完全降解，从而发挥抑制目标基因蛋白转录的作用[54,55]。miRNA已经成为了探索疾病诊断和治疗靶点的重要工具。在多种疼痛相关疾病中，miRNA的表达和调控起到了重要作用。例如，研究发现miRNA-27b能够通过靶向调控基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达而对人骨关节炎的病理进程发挥抑制作用[56]；另外，LiX等的研究证实，miRNA-146a也是表达异常的miRNA之一，并且被认为是骨关节炎中与疼痛密切相关的miRNA，其作用主要是通过对炎性因子TNF-α和IL-6等的调控来实现[57]。也有研究对慢性膀胱痛患者血清中差异化表达的miRNA进行筛选，证实差异化表达的miR-449b和miR-500能通下调调控神经激肽-1受体的表达，进一步拓宽了慢性疼痛相关分子机制的知识[58]。miRNA调控基因表达的作用主要是通过对靶基因mRNA的降解或翻译抑制来实现，为了进一步确认miR-449a对KCNMA1基因表达的作用，我们对miRNA-449a过表达的DRG细胞中KCNMA1的mRNA和蛋白进行检测，荧光定量PCR结果显示，miRNA-449a过表达的DRG细胞中KCNMA1的mRNA水平显著下降为0.58±0.04（P<0.05，与阴性对照组相比）；而空白对照组与阴性对照组相比无显著差异。Westernblot检测了DRG细胞中KCNMA1蛋白的表达，结果与mRNA检测一致，在miRNA-449a过表达后，DRG细胞中KCNMA1的蛋白水平显著下降为0.59±0.04（P<0.05，与阴性对照组相比，图2.3）；而空白对照组与阴性对照组相比无显著差异。证实miRNA-449a能够抑制DRG细胞中KCNMA1的表达。miRNA的翻译调控是真核生物基因组表达和功能的关键因素。miRNA在真核细胞中发挥调控基因表达水平的作用，主要是通过与靶基因mRNA3’非编码区的结合来实现。miRNA一方面能够与细胞质中的蛋白结合，39 吉林大学博士学位论文形成RNA干扰沉默核糖核蛋白复合物，该复合物能够与靶基因mRNA发生互补而降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白转录；此外，miRNA也可以通过与mRNA的不完全互补抑制蛋白的转录。由于神经病理性疼痛本质上可以认为是神经系统对损伤做出的应激反应，所发生的病理改变与各种蛋白的表达密切相关，包括信号转导分子、神经递质、炎性因子和离子通道蛋白等[59,60]。因此miRNA通过调控不同信号通路相关的蛋白表达，从而对神经病理性疼痛的病理进程发挥了不同的调控作用。40 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制DRG神经元是负责痛觉传导的第一级神经元，能够传递外周的痛觉感受到达中枢神经系统，是神经病理性疼痛中关键因素之一。DRG神经元中包括了内假单极神经元胞体，通常分为大中小神经元，其由一层扁平的卫星细胞包被。DRG神经元不但能够分泌传递疼痛的神经递质，其上还有多种离子通道和突触前调制受体[61]。研究认为，直接干预DRG的基因表达情况能够对疼痛感觉进行调控，DRG有望成为研究目的基因在神经病理性疼痛的作用和机制的靶点细胞。研究认为，脊神经的直接显微注射具有效率高、作用明确的优点，是研究靶点基因功能的有效技术[62]。因此本研究通过DRG的显微注射对miRNA-449a的功能和可能机制进行了探索。研究发现，人类基因组中超过20%的基因表达水平受到不同miRNA的调控，因此miRNA已经成为了探索疾病诊断和治疗靶点的重要工具。在多种疼痛相关疾病中，miRNA的表达和调控起到了重要作用。也有研究对慢性膀胱痛患者血清中差异化表达的miRNA进行筛选，证实差异化表达的miR-449b和miR-500能通下调调控神经激肽-1受体的表达[63]。为了进一步拓宽了慢性疼痛相关分子机制的知识，在本部分的研究中，我们进一步对外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制开展研究。4.1实验材料4.1.1实验试剂试剂名称生产商DEPC水ThermoFisher公司，美国TurboFect转染试剂ThermoFisher公司，美国青霉素生工生物工程股份有限公司链霉素生工生物工程股份有限公司41 吉林大学博士学位论文RealtimePCR试剂AppliedBiosystems公司，美国mirVanamiRNAIsolationKitThermoFisher公司，美国DetectionprobesformiR-449a宝生物工程（大连）有限公司无水乙醇吉林博大生化有限公司异丙醇吉林博大生化有限公司氯仿吉林博大生化有限公司多聚甲醛吉林博大生化有限公司RNaseASigma公司，美国DNA酶Sac内切I/XbalPomega公司，美国DNAmarkerPomega公司，美国DNA连接酶Pomega公司，美国DNA凝胶回收试剂盒Pomega公司，美国ECL化学发光检测试剂盒Pomega公司，美国Dual-luciferase试剂盒Pomega公司，美国GAPDH抗体CST公司，美国KCNMA1抗体CST公司，美国多聚甲醛Invitrogen公司辣根过氧化酶（HRP）标记的抗地高辛抗体Invitrogen公司BSA牛血清白蛋白ThermoFisher公司，美国4.1.2实验仪器实验仪器生产商生物安全柜ThermoFisher公司，美国超低温保存箱SANYO公司，日本1μl-1ml移液器Eppendorf公司，德国丝线编织非吸收性缝线强生医疗，美国显微手术剪Roboz公司，美国解剖刀柄Roboz公司，美国组织镊Roboz公司，美国42 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制组织牵开器Roboz公司，美国手术剪Roboz公司，美国微量进样器上海实验仪器总厂分光光度计ThermoFisher公司，美国超纯水系统Millipore公司，德国实时荧光定量PCR仪AppliedBiosystems公司，美国超净操作台ThermoFisher公司，美国恒温细胞培养箱ThermoFisher公司，美国梯度PCR仪Bio-Rad公司，美国荧光倒置显微镜Olympus公司，日本制冰机SANYO公司，日本PowerGen匀浆器ThermoFisher公司，美国低温高速离心机Millipore公司，美国化学发光成像仪ThermoFisher公司，美国电子天平SARTORIUS公司，德国电热恒温干燥箱上海实验仪器总厂摇床上海实验仪器总厂高温蒸汽灭菌锅上海实验仪器总厂4.2实验方法4.2.1DRG显微注射术（1）仪器设置拉制电极使用一步拉制法，拉制参数设置为64.0。实验采用玻璃电极长度10厘米、内径2毫米。充灌电极使用尾部灌注法，使用微量进样器将电极内液灌入其尾部，保证气体完全排空。显微注射系统中的PC延长管一部分连接到微电极，另一部分与微量注射器连接，微量注射器固定在微量注射泵。仪器内充满矿物油，保证没有空气。（2）药物抽取miR-449amimics（10μl）首先使用转染试剂TurboFect进行混匀包被，加入20μl的蓝色染料用于标记药物注射进度。药物混合均匀后放置于离心管中，操作43 吉林大学博士学位论文显微操作器将药物缓慢抽取。（3）显微注射在系统显微镜下观察小鼠的脊背神经，通过控制显微操作器系统，将电极的尖端直接对准小鼠DRG的中间位置，随后手动控制微调系统，将注射器的尖端直接刺入DRG组织2mm左右，此时能够感受到轻轻的刺破感，显微镜下能够观察到DRG组织有轻度的向下凹陷。通过设置微量注射泵的流速是10μl/h，然后开启微量注射泵向小鼠DRG注射，由于药物中加入了蓝色染料，能够观察到miR-449amimics在DRG组织中的扩散，注射15分钟后暂停5分钟，保证药物的均匀扩散和彻底进入。注射结束后缓慢退出电极尖端，避免药物的回流。4.2.2构建SNI模型本部分的研究中，在小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，构建小鼠神经病理性疼痛模型，动物分组为：Naive组、Veh+SNI组（生理盐水组）、miR-449a+Sham组、NC+SNI组（空白质粒组）和miR-449A+SNI组，构建方法参照文献[39]并稍微改动，具体步骤如下：（1）SNI组小鼠进行称重记录，使用水合氯醛（100mg/kg）腹腔注射进行麻醉，昆明小鼠麻醉后俯卧放置于操作台上；（2）剔除小鼠左侧后肢的毛，铺垫消毒湿巾，使用手术剪剪开小鼠皮肤和组织，钝性分离小鼠的股二头肌后可以观察到小鼠的坐骨神经；（3）小鼠坐骨神经三处分支为胫神经、腓神经和腓肠神经。使用手术镊将小鼠的胫神经和腓神经进行分离，使用4#丝线进行将神经进行结扎，在结扎的神经中间部分切断，并使用手术剪轻轻去除末端的2-4mm的神经干，然后进行止血，缝合伤口。注意使用链霉素和青霉素进行消炎。（4）Naive组小鼠不做任何处理，sham组小鼠在暴露坐骨神经及其分支之后，不进行结扎等操作，直接进行缝合。手术结束后将各组昆明小鼠共同放置于适宜环境中分开单独饲养。（5）手术过程中操作注意应当避免过度伤害坐骨神经系统，应当注意全程无菌操作，并及时使用青霉素等进行抗菌消炎。此外，术后注意观察各小鼠的生理状态，如发生运动障碍、神经功能障碍或严重感染，则将被排除该实验。44 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制4.2.3动物行为学测定4.2.3.1机械性刺激诱发疼痛的行为学测定各组小鼠的机械性痛阈（Mechanicalwithdrwalthreshold，MWT）采用文献报道的方法进行检测，采用7对VonFrey纤毛递增强度依次为2g、4g、6g、8g、10g、15g、26g用于测定各组小鼠的后肢50%缩足反应阈值（50%PWT）。在正式开始检测的前48小时将待测小鼠放置于底部为金属网格的特制笼子中。每天的检测时间固定为上午9-10点。实验开始之前30分钟将小鼠放置于测试环境中，首先使用2.0g纤毛透过金属网格直接刺小鼠的后足底部，力度要求达到纤毛弯曲S形，刺激时间要求持续3-4s，每次间隔10-15s，如小鼠在VonFrey针移走的时候迅速进行缩足或舔足，则记录为阳性；若无反应，则记录成阴性。若小鼠对刺激的反应为阴性，则继续使用强度递增的VonFrey纤毛刺激。每组小鼠在手术前一天测定其MWT作为基础值，如基础值异常则排除实验。实验结束后进行数据统计，采用VonFrey校正软件对实验数据进行计算。全部检测均由同一工作人员完成，且保持对各组小鼠的分组不知情。4.2.3.2热刺激诱发疼痛的行为学测定每组小鼠在手术前一天测定其左后肢的热缩足反射潜伏期（Thermalwithdrawallatency，TWL）作为基础值，如基础值异常则排除实验。根据文献报道的实验方案，操作步骤如下：（1）打开热痛阈检测设备预热5分钟，根据小鼠的基础反应调整辐射热强度，要求热缩足反射潜伏期保持为10-12秒，仪器的热辐射持续时间最高20秒；（2）实验开始之前将各组小鼠放置于检测仪器的特制玻璃板上30分钟，保证小鼠对检测环境的熟悉，然后调整玻璃温度到25℃。（3）开始检测后，将外红光源对准小鼠的小鼠左后足底部的位置，仪器自动记录小鼠因疼痛感而移动后足的时间；此时间即为TWL值。如小鼠20秒的照射极限内没有反应，则仪器自动停止，防止对小鼠造成烫伤。（4）每只小鼠进行重复测量5次，每次检测的时间间隔5分钟，选取其中居中的三个数据作为可靠数据进行统计。45 吉林大学博士学位论文（5）注意事项：实验过程中应当及时清除小鼠的排泄物，防止其对TWL检测的干扰。4.2.3.3冷刺激诱发疼痛的测定冷缩足潜伏期（Coldwithdrawallatency，CWL）的测定与TWL的测定原理基本一致。首先将仪器的痛觉测试铝板调节至0℃，然后将各组小鼠依次放置于冷板之上，仪器自动记录小鼠在触碰到冷板之后到进行缩足、舔足等反应的时间。仪器的检测极限时间是60秒，防止过低温度对小鼠造成冻伤。每只小鼠进行重复测量5次，每次检测的时间间隔10分钟，选取其中居中的三个数据作为可靠数据进行统计。实验过程中应当及时清除小鼠的排泄物，防止其对CWL检测的干扰。4.2.3背根神经节分离培养本研究使用的背根神经节（Dorsalrootganglia，DRG）从小鼠体内进行分离培养。实验步骤如下：（1）实验前准备工作：使用摇床分离细胞，温度设置37℃；所有实验试剂均通过紫外杀菌和滤膜过滤，保证无菌；手术器械均经过高温杀菌；（2）各组小鼠在实验7d的检测结束之后，各组随机取3只小鼠进行后续研究。首先使用2.5%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉之后，俯卧放置于手术台上，沿着小鼠背部的正中剪开之后，使用手术镊将筋膜和肌肉进行分离，然后移除棘突，将小鼠的脊髓暴露之后使用咬骨钳将L4-6椎板去除，然后在显微镜下轻轻分离L4-6两侧的小鼠背根神经节；（3）取出的小鼠背根神经节迅速放置于预冷预充氧的CSS中，在显微镜下使用眼科镊将包被着背根神经节的结缔组织分离去除，然后将小鼠背根神经节剪碎转移到37℃预热的LiberaseBlendzyme3溶液中，使用移液器将细胞吹打混匀，放置到摇床上进行慢摇消化10分钟，随后放置于低温离心机中1000rpm离心5分钟，去除上清液，向细胞沉淀物中加入提前配置的预热的DMEM/F12完全培养基；（4）再次吹打混匀细胞，使用移液器吸取100μl细胞放置于培养皿上，在显微镜下观察细胞状态和细胞密度；然后将细胞悬液使用DMEM/F12完全培46 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制养基稀释至106个/ml，然后转移到包被多聚赖氨酸的细胞培养皿中进行培养。4.2.4实时荧光定量PCR4.2.4.1KCNMA1引物的设计与合成KCNMA1的引物由生工生物科技股份有限公司设计合成上游引物：5'-CGCGACTATAGTGGCGATGTGCA-3'下游引物：5'-GCAATCTTATCACGTGCGCTT-3'4.2.4.2提取总RNA6孔板中的细胞培养密度>80%，去除培养液，加入2ml的TRIzol试剂，吹打混匀，使细胞充分裂解。如果是临床病理样本，每例取100mg的组织加入液氮进行充分研磨，然后加入1ml的TRIzol试剂，吹打混匀，保证充分的裂解。组织或细胞裂解5min后，转移裂解液到0.1%DEPC水处理后的离心管中，然后加入500μl的氯仿，混匀后静置5min，在4℃低温离心机中以12000rpm的转速离心10min，离心管的液体将会分三层，其中最上层含有总RNA。使用移液器转移上层液体，加入1ml的异丙醇，轻轻混匀静置于室温下约10min，再次放入4℃低温离心机以12000rpm的转速离心10min，去除上层液体后，得到白色沉淀物。向离心管中加入1ml的75%乙醇轻轻洗涤。再次4℃低温离心，7500rpm离心5min，去除上层液体后，得到白色沉淀物。静置于室温下干燥10min，加入40μl的DEPC水，放入55℃水浴中加热8min，得到细胞或组织中的总RNA。4.2.4.3RNA测定提取总RNA后，使用紫外分光光度法检测RNA的浓度，将1μl的总RNA溶解于49μl的RNase-free去离子水中，然后加入到已清洗的比色杯中，放入紫外分光光度仪中，分别读取波长260nm及280nm时的吸光度（A，OD值），计算A（260nm）/A（280nm）的值如在1.8-2.1之间表明RNA纯度较好，可以用于后续研究。4.2.4.4琼脂糖凝胶电泳首先制备琼脂糖凝胶，配制方法为2g琼脂糖+140ml纯水+20mlMOPS电泳液+36ml30%甲醛溶液。使用上述液体加入到凝胶板中，取出梳子向各个凹槽中47 吉林大学博士学位论文分别加入1提取的总RNA，然后分别加入3μl的甲醛染液，加热至65摄氏度5min使样品变性，然后上样，设置电泳仪的参数为6V/cm。RT-PCR扩增a.逆转录反应逆转录反应配制反应液如下：2-20ng总RNA10μlMicroRNAAssay6μl逆转录酶50U/μl2μl100mMdNTPs（withdTTP）0.3μl10倍逆转录缓冲液3μlRNA酶抑制剂20U/μl0.4μlNuclease-free水8μl总体积30μlb.放入PCR扩增仪上进行逆转录反应16摄氏度30分钟42摄氏度30分钟85摄氏度5分钟逆转录反应完成后，去除离心管放在冰浴中。每个miRNA样品均使用上述的反应体系进行逆转录反应，本实验使用U6作为内参，所用体积3μl。4.2.4.5Real-timePCR反应a.PCR反应试剂SmallRNAAssay2μlProductfromRTreaction2.6μlTaqManUniversalPCRMasterMixⅡ20μlNuclease-free水15μl总体积40μlb.PCR仪的参数设置为：95摄氏度10分钟95摄氏度15秒48 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制60摄氏度30秒40次循环4.2.4.6结果统计各组各样品分别进行RealtimePCR反应，检测miRNA-449a和U6的表达量，计算公式如下：待测样品（test，1）△Ct1=Ct1（目的片段）-Ct1（对照片段）对照样品（control，2）△Ct2=Ct2（目的片段）-Ct2（对照片段）△△Ct=△Ct1-△Ct2-△△CtmiRNA-449a表达相对定量=24.2.5Westernblot1）制备Western的试剂a）10×电泳缓冲液，体积1L25.0gTris碱11g昆明S133g甘氨酸加超纯至体积1L，室温保存待用b）10×TBS试剂78gNaCl25.6gTris碱加入900ml超纯水进行溶解，使用盐酸调节pH至7.5，补充溶液体积至1L，4°C保存待用c）10%浓度AP，体积10ml10gAP100ml超纯水-20°C保存待用d）转膜缓冲液，体积1L10×转膜液：32.2gTris试剂49 吉林大学博士学位论文150.14g甘氨酸配成1L，室温保存待用稀释为1×转膜液：加入80ml的10×转膜液+720ml超纯水＋200ml甲醇e）TBST（0.1%Tween-20），体积1LTween201mlTBS1000ml4°C保存待用f）5%牛奶TBST，体积100ml5g光明脱脂奶粉100mlTBST4°C保存待用g）1%牛奶TBST，体积100ml5g光明脱脂奶粉100mlTBST4°C保存待用2）提取细胞总蛋白在细胞传代的时候将DRG细胞按照106/孔的密度接种于6孔板中，37°C培养至细胞融合度达到80%以上后，将细胞培养板取出放置于冰板上进行操作。去除原有的细胞培养液，然后加入预冷PBS的溶液轻轻洗三次，向六孔板中分别加入100μl的RIPA细胞裂解液（RIPA中含有1μl的PMSF和ProteaseInhibitorCocktail），然后使用1ml的枪头进行吹打，放在冰板上静置40分钟，然后使用细胞刮刀处理细胞，使用移液枪裂解液移入新的离心管中放入离心机进行离心，4°C、12000rpm进行离心15分钟，洗去上清液。然后使用BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度后，-80°C保存待用。3）SDS-PAGE蛋白质电泳a）10%分离胶超纯水2.5ml丙烯酰胺8ml50 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制1.5MTris-HCl/昆明S（pH7.4）5ml10%AP200µLTEMED8µL加入超纯水至总体积为20ml，将分离胶液体混合均匀后加入电泳槽中，并加入2ml的异丙醇排除气泡，将分离胶放在室温下约1h左右可观察到胶体凝固，然后倒掉异丙醇，分离胶用于后续的电泳。b）5%浓缩胶超纯水8.2ml丙烯酰胺2ml0.5MTris-HCl/昆明S（pH7.4）1.5ml10%AP120µLTEMED12µL加入超纯水至体积为12ml，配置好之后将液体混匀，然后缓慢加入电泳槽的凹槽中，将分离胶放在室温下约1h左右可观察到胶体凝固，然后倒掉异丙醇，分离胶用于后续的电泳。4）蛋白样品制备及点样将细胞裂解液的提取的细胞蛋白按照20μg/每个样品进行电泳，每个样品中加入5μl的上样缓冲液，轻轻混匀，放在沸水浴中加热5分钟，然后常温、12000rpm离心5分钟，吸取上清液进行电泳。5）SDS-PAGE电泳将待测样品加入电泳仪中，设置参数为60V、40分钟，观察到蓝色上样缓冲液进行分离胶体中之后，更改电压改为120V，电泳至条带到胶体中下方结束。6）转膜及杂交电泳结束后，取出含有蛋白的分离胶放置于缓冲液室温静置15分钟左右，然后将分离胶放置于PVDF膜中，然后加入一定体积的甲醇进行湿润，然后转移到电转仪中进行转膜，参数设置为200mA，3小时。电转结束后取出PVDF膜，将PVDF膜放置于容器中，然后加入提前已经制备好的封闭液（5%milk-TBST）中静置大约1小时，封闭结束后去除封闭液，然后加入提前制备的1%milk-TBST/TBST进行洗涤三次，每次5分钟，洗涤结束后加入已经稀释过的目标蛋白的一抗，PVDF膜完全浸入一抗溶液中，然后放置于4°C冰箱内振荡过夜。次日去除51 吉林大学博士学位论文一抗溶液，使用PBS溶液轻轻洗涤三次，然后加入1ml的稀释过的荧光素二抗，避光条件下静置1h。去除二抗的孵育液，然后使用预冷的PBS溶液进行振荡洗涤。7）显色将已经制备好的PVDF膜放置于双色红外成像系统中，软件设置相应的激发波长，进行化学发光显色并拍照。WB的照片使用ImageJ软件进行灰度值分析，以A（目的蛋白）/A（β-actin）的灰度值的比值作为蛋白水平的定量计算。4.2.6数据统计本研究采用统计软件SSPS18.0统计和分析原始数据，数据均以MEAN±SD的形式表示，机械性痛阈值与热痛阈值数据的统计分析采用两因素的重复测量方差分析，其他组间比较均采用单因素方差分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。4.3结果4.3.1miR-449a对小鼠模型的机械痛行为学的影响小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的MWT值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠MWT值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与Naive组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的MWT值与本组的基础值（第0天）相比出现显著下降（P<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的MWT值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。miR-449amimics+SNI组小鼠在SNI术后的第3，5，7天的MWT值均显著高于Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验期间，各组小鼠右足（非DRG注射侧，非SNI术侧）的MWT值保持相对稳定，各组的组间比较和组内比较均无显著性差异（P>0.05）。52 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制ABIpsllateral)g(3ContralateradlNaive)go(3hVeh+SNIdlNaivesoermiR-449a+ShamhVeh+SNIsh2emiR-449a+ShamT*NC+SNIr2lha**miR-449A+SNITNC+SNIlw**amiR-449A+SNIarwd1arhd1tihtiWWwa0wa0P0357dayPday0357图4.1miR-449a对SNI模型的机械痛行为学的影响。*P<0.05与Naive组相比，**P<0.01与Naive组相比。Figure4.1TheeffectsofmiR-449aonthemechanicalpainbehavioroftheSNImodel.*p<0.05iscomparedwiththeNaivegroup.4.3.2miR-449a对小鼠模型的热痛行为学的影响小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的TWL值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠TWL值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与Naive组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的TWL值与本组的基础值（第0天）相比出现显著下降（P<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的TWL值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。miR-449amimics+SNI组小鼠在SNI术后的第3，5，7天的TWL值均显著高于Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验期间，各组小鼠右足（非DRG注射侧，非SNI术侧）的TWL值保持相对稳定，各组的组间比较和组内比较均无显著性差异（P>0.05）。53 吉林大学博士学位论文BAContralateraIpsllateral)15)15s(Naives(NaiveyycVeh+SNIcVeh+SNInneetmiR-449a+ShamtmiR-449a+Shamal10al10lNC+SNIlNC+SNIaa*wmiR-449A+SNIwmiR-449A+SNIaar**r**dd5h5httiiwwwwaaP0P00357day0357day图4.2miR-449a对SNI模型的热痛行为学的影响。*P<0.05与Naive组相比，**P<0.01与Naive组相比。Figure4.2TheeffectsofmiR-449aontheTWLoftheSNImodel.*P<0.05and**P<0.01iscomparedwiththeNaivegroup.4.3.3miR-449a对小鼠模型的冷痛行为学的影响小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的CWT值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠MWT值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与Naive组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的CWT值与本组的基础值（第0天）相比出现显著下降（P<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的CWT值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。miR-449amimics+SNI组小鼠在SNI术后的第3，5，7天的CWT值均显著高于Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。Ipsllateral)s(60yNaivecn*Veh+SNIet*amiR-449a+Shaml40*laNC+SNIwamiR-449A+SNIrd**h20tiwwaP0day0357图4.3miR-449a对SNI模型的冷痛行为学的影响。*P<0.05与Naive组相比，**P<0.01与Naive组相比。54 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制Figure4.3TheeffectsofmiR-449aontheCWLoftheSNImodel.*P<0.05and**P<0.01iscomparedwiththeNaivegroup.4.3.4miR-449a对SNI模型的KCNMA1表达的影响小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，分离手术侧的DRG进行实时荧光定量PCR检测KCNMA1mRNA表达的水平改变，检测结果显示，Vehicle+SNI组、NC+SNI组和miR-449amimics+SNI组小鼠DRG中KCNMA1的mRNA水平出现显著增加，与Naive组相比，有显著性差异（P<0.05）；miR-449amimics+SNI组显著高于Vehicle+SNI组（P<0.05）；miR-449amimics+Sham组KCNMA1的mRNA无显著改变（P>0.05）。4****A3NRm*12AMNC1K0eIIIvNmNNiSaSSa+h++NhSCAe+9VaN4944--4iRiRmm图4.4外源性miR-449a对各组小鼠的KCNMA1mRNA的影响。*P<0.05与Naive组相比，**P<0.01与Naive组相比。#P<0.05与Vehicle+SNI组相比。Figure4.4TheeffectofexogenousmiR-449aontheKCNMA1mRNAofmiceineachgroup.*P<0.05and**P<0.01iscomparedwiththeNaivegroup.#P<0.05iscomparedwiththeVehicle+SNIgroup.小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，分离手术侧的DRG进行实时荧光定量PCR检测KCNMA1mRNA表达的水平改变，检测结果显示，Vehicle+SNI组、NC+SNI组和miR-449amimics+SNI组小鼠DRG中55 吉林大学博士学位论文KCNMA1的蛋白水平出现显著增加，与Naive组相比，有显著性差异（P<0.05）；miR-449amimics+SNI组显著高于Vehicle+SNI组（P<0.05）；miR-449amimics+Sham组KCNMA1的蛋白表达无显著改变（P>0.05）。3**ni**eto2rp*1AMN1CK0eIIIvNmNNaiSaSS+h++NhSCAe+9VaN4944--4iRiRmm图4.5miR-449a对各组小鼠的KCNMA1蛋白表达的影响。*P<0.05与Naive组相比，**P<0.01与Naive组相比。#P<0.05与Vehicle+SNI组相比。Figure4.5TheeffectofmiR-449aontheexpressionofKCNMA1proteinineachgroupofmice.*P<0.05and**P<0.01iscomparedwiththeNaivegroup.#P<0.05iscomparedwiththeVehicle+SNIgroup.4.4讨论在本部分的研究中，我们采用DRG显微注射技术检测了外源性miRNA-449a对神经病理性疼痛的作用，检测结果显示，小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的MWT值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠MWT值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与Naive组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的MWT值与本组的基础值（第0天）相比出现显著下降（P<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的MWT值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。miR-449amimics+SNI组小鼠在SNI术后的第3，5，7天的MWT值均显著高于Vehicle+SNI组、NC+SNI56 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验期间，各组小鼠右足（非DRG注射侧，非SNI术侧）的MWT值保持相对稳定，各组的组间比较和组内比较均无显著性差异（P>0.05）。小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的TWL值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠TWL值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与Naive组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的TWL值与本组的基础值（第0天）相比出现显著下降（P<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的TWL值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。miR-449amimics+SNI组小鼠在SNI术后的第3，5，7天的TWL值均显著高于Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验期间，各组小鼠右足（非DRG注射侧，非SNI术侧）的TWL值保持相对稳定，各组的组间比较和组内比较均无显著性差异（P>0.05）。小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，按照前述实验分别检测不同时间点小鼠的行为学改变。测定结果显示，手术前各组小鼠的CWT值无显著差异；而且在进行DRG注射后各个对照组小鼠MWT值亦无显著差异；而在SNI术后观察到miR-449amimics+Sham组无显著改变（与Naive组相比，P>0.05），miR-449amimics+SNI组小鼠在术后3，5，7天的CWT值与本组的基础值（第0天）相比出现显著下降（P<0.05）；Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠的CWT值在SNI术后各个检测时间点均出现显著减少（P<0.05，与本组基础值相比）。miR-449amimics+SNI组小鼠在SNI术后的第3，5，7天的CWT值均显著高于Vehicle+SNI组、NC+SNI组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。miRNA的翻译调控是真核生物基因组表达和功能的关键因素。miRNA在真核细胞中发挥调控基因表达水平的作用，主要是通过与靶基因mRNA3’非编码区的结合来实现。miRNA一方面能够与细胞质中的蛋白结合，形成RNA干扰沉默核糖核蛋白复合物，该复合物能够与靶基因mRNA发生互补而降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白转录；此外，miRNA也可以通过与mRNA的不完全互补抑制蛋白的转录。由于神经病理性疼痛本质上可以认为是神经系统对损伤做出的应激反应，所发生的病理改变与各种蛋白的表达密切相关，包括信号转导分子、57 吉林大学博士学位论文神经递质、炎性因子和离子通道蛋白等[61-63]。因此miRNA通过调控不同信号通路相关的蛋白表达，从而对神经病理性疼痛的病理进程发挥了不同的调控作用。miRNA调控炎症反应的作用和机制已在多种疾病中得到了报道，包括恶性肿瘤、呼吸系统以及神经系统疾病等[64]。研究显示，神经炎症的关键因子，包括IL-1β、TNF-α以及IL-6等，在神经病理性疼痛的痛感产生和持续中发挥了重要作用[65-67]。而具有抑制炎性因子转录的miRNA能够通过对炎性因子的抑制而发挥预防和治疗作用。研究报道，miRNA-155是调控血脑屏障（BBB）功能障碍的关键miRNA。在体外培养的人脑内皮细胞中miR-155能快速而且有效地上调炎症因子表达水平，从而改变细胞因子诱导的通透性增加[68]。此外，miR-155调节大脑内皮屏障功能的靶点蛋白包括Annexin-2和claudin-1等。最终提示miR-155是一种负性调节血脑屏障中枢神经炎性疾病的分子，而这一作用可能是通过调控神经元细胞膜Toll受体-4来实现[69,70]。越来越多的证据支持miRNA参与人类神经系统炎症的调节。例如研究报道，外源性的miR-23b能够抑制神经系统损伤发生后炎症的发生，其作用包括抑制小胶质细胞浸润、减少炎症因子合成以及抑制活性氧介导的神经元凋亡[71,72]。研究人员IyerA等采用荧光定量PCR和原位杂交技术研究了癫痫相关的胶质神经元病变的特点，发现miR-146a能够促进星形胶质细胞中IL-6和TNF-α的表达，其作用靶点可能是IRAK-1，IRAK-2和TRAF-6蛋白家族，证实了miR-146a诱导的负反馈调节参与了星形胶质细胞介导的炎症反应[73]。因此可以肯定的是miRNA能通过对神经炎症的调控，对神经病理性疼痛的发生发展中起到了重要的作用。大量的研究针对miRNA在神经系统损伤后的修复作用进行了深入探索。研究发现，背根神经节（DRG）细胞在神经损伤后发生基因转录变化，从而通过表型改变促进细胞存活和轴突再生。通过慢病毒载体转染miR-21进入分离的小鼠背根神经节中增强miR-21的表达后，观察到过表达miR-21促进神经轴突生长，并且双荧光素酶实验显示miRNA-21调控的靶蛋白为Sprouty2蛋白，从而证实了miRNA-21是外周神经损伤后生长通路的重要因子[74]。另外，VerrierJD等人的研究证实，坐骨神经细胞中miR-29能够通过抑制外周神经元髓鞘蛋白22（PMP22）的表达水平，PMP22蛋白是一种主要表达在髓鞘雪旺细胞的疾病相关蛋白，因此miRNA-29在神经系统损伤后修复的过程中发挥抑制作用[75]。此外，58 第4章外源性miR-449a对慢性神经病理性疼痛的镇痛作用及相关机制研究者采用坐骨神经分支选择性损伤的小鼠模型，证实了小鼠SNI模型中DRG细胞中miRNA-200b和miRNA-429的表达显著下降，其通过调控表观遗传相关蛋白DMNT-3的表达从而对受损神经元的修复、树突重塑等进程进行调控，影响神经病理性疼痛的病理机制[76]。慢性神经病理性疼痛状态的特点是长时间的脊髓神经元敏化，将伤害性信息传递给大脑。而miRNA能够靶向调控伤害感受相关蛋白的表达，包括离子通道蛋白、神经肽以及营养因子等，从而调节人体神经系统对伤害的敏感性[77]。研究发现，在NPP幼年小鼠模型中通过鞘内注射miRNA-103能够有效缓解疼痛，抑制神经中枢敏化，其作用的信号机制主要与miRNA-103-LTC-Cav1.2通道有关[78]。此外，有研究重点检测发现了特定miRNA-96在成年小鼠的背根神经节（DRG）中出现了高度富集，通过脊神经结扎手术（SNL）构建慢性神经病理性疼痛的小鼠模型，证实miRNA-96的表达和分布出现显著改变。miRNA-96在非异常性疼痛的小鼠DRG胞体分布均匀，但在SNL小鼠模型体内miRNA-96主要分布于外周神经元中，提示其可能转录调控慢性神经病理性疼痛相关基因[79]。因此可见，miRNA能够对中枢以及外周神经系统的敏化进行调节。为了进一步验证第二部分的预测和体外验证结果，我们检测了miR-449a对SNI模型的KCNMA1表达的影响，小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，分离手术侧的DRG进行实时荧光定量PCR检测KCNMA1mRNA表达的水平改变，检测结果显示，Vehicle+SNI组、NC+SNI组和miR-449amimics+SNI组小鼠DRG中KCNMA1的mRNA水平出现显著增加，与Naive组相比，有显著性差异（P<0.05）；miR-449amimics+Sham组KCNMA1的mRNA无显著改变（P>0.05）。小鼠进行DRG显微注射后第3天进行SNI或Sham手术，分离手术侧的DRG进行实时荧光定量PCR检测KCNMA1mRNA表达的水平改变，检测结果显示，Vehicle+SNI组、NC+SNI组和miR-449amimics+SNI组小鼠DRG中KCNMA1的蛋白水平出现显著增加，与Naive组相比，有显著性差异（P<0.05）；miR-449amimics+Sham组KCNMA1的蛋白表达无显著改变（P>0.05）。大电导钙离子依赖的钾通道M亚族α亚基（potassiumlargeconductancecalcium-activatedchannel,subfamilyM,alphamember-1，KCNMA1）其主要的生59 吉林大学博士学位论文理功能是调节人体细胞的电活动、神经递质的释放以及多种器官平滑肌组织的收缩。当外源性钙离子进入细胞后将会导致多种级联反应，包括激活钙库、激活第二信使系统等。细胞内的钙离子水平升高后，导致细胞膜的去极化，导致胞内的钾离子发生外流，细胞膜电位复极化，最终能够抑制细胞的兴奋性以及动作电位的增强，从而发挥负反馈调节的调控作用。例如，LuR等人的研究显示，干扰KCNMA1的表达水平能够抑制神经炎症引起的疼痛反应[80]。因此，我们在本部分的研究中在体内实验中验证了miRNA-449a在神经病理性疼痛中的治疗作用，其作用可能是通过干预KCNMA1的表达来实现的。60 全文小结全文小结国内外众多研究表明神经病理性疼痛的产生和维持与疼痛相关分子的转录水平和表达水平改变密切相关。众多疼痛相关基因是如何程序性的被启动，进行转录和翻译，表达增加，或被特异性地抑制表达下降，从而调控疼痛。当神经损伤或炎症损伤，细胞环境的变化，不同的miRNA介导的信号通路或激活或失活，造成疼痛或痛觉过敏，己经成为疼痛机制研究的新方向。目前为止，依据经典的神经病理性疼痛SNI小鼠模型，利用RT-PCR、Western-blot、miRNA过表达、DRG显微注射、原代神经元细胞的培养、双荧光素酶报告基因等实验方法，我们证实：1.SNI神经病理痛小鼠模型中miR-449a表达显著降低；2.DRG细胞中miRNA-449a能够靶向抑制KCNMA1的表达；3.外源性miRNA-449a能够改善SNI神经病理痛小鼠模型的疼痛水平，其作用可能与抑制KCNMA1的表达密切相关。61 吉林大学博士学位论文62 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吉林大学博士学位论文68 综述综述MiRNA在神经病理性疼痛中的研究进展神经病理性疼痛（neuropathicpain,NP）又称为神经痛，根据国际疼痛学会（InternationalAssociationfortheStudyofPain,IASP）将神经病理性疼痛定义为由于人体感觉神经系统受损或者疾病引起的疼痛，分为自发性疼痛（spontaneouspain）、痛觉过敏（hyperalgesia）以及异常疼痛（allodynia）等多种临床特征，该系列病理特征可能是由脊髓感觉系统易化引所导致[1]。目前全球范围内神经病理性疼痛的发病率据推测已经3.3%-8.2%，神经病理性疼痛发病机制不明，而且难以有效根治，剧烈的疼痛给患者带来巨大的身体和精神痛苦，已经成为不容忽视的难以治愈的健康问题[2]。在临床上对于神经病理性疼痛的治疗是以抗抑郁药、抗癫痫药以及局部麻醉剂为主，但是上述药物的疗效仍不理想，并且副作用严重[3]，因此明确神经病理性疼痛的发病机制并加快高效低毒药物的研发，已经成为临床研究的热点领域。MicroRNAs（miRNAs）是指由内源基因编码的、核苷酸长度约18-22nt的非编码单链RNA，研究发现miRNA的生物功能是通过对转录后基因表达水平的调控从而参与对人体多种生理功能进行调节[4]。miRNA的生物合成过程分为细胞核内转录和细胞质内加工，首先由基因组转录生成具有发卡结构的miRNA前体（Pre-miRNA），然后经过核酸内切酶Dicer酶的剪切之后得到双链miRNA。双链miRNA在转运进入细胞质中后发生双链解离，其中一条miRNA单链与沉默复合体蛋白（RISC）发生特异性结合，能够与靶基因mRNA的3’非编码区发生结合从而促进mRNA的部分或者完全降解，从而发挥抑制目标基因蛋白转录的作用[5,6]。研究发现，人类基因组中超过20%的基因表达水平受到不同miRNA的调控，因此miRNA已经成为了探索疾病诊断和治疗靶点的重要工具。在多种疼痛相关疾病中，miRNA的表达和调控起到了重要作用。例如，研究发现miRNA-27b能够通过靶向调控基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达而对人骨关节炎的病理进69 吉林大学博士学位论文程发挥抑制作用[7]；另外，LiX等的研究证实，miRNA-146a也是表达异常的miRNA之一，并且被认为是骨关节炎中与疼痛密切相关的miRNA，其作用主要是通过对炎性因子TNF-α和IL-6等的调控来实现[8]。也有研究对慢性膀胱痛患者血清中差异化表达的miRNA进行筛选，证实差异化表达的miR-449b和miR-500能通下调调控神经激肽-1受体的表达，进一步拓宽了慢性疼痛相关分子机制的知识[9]。1.1miRNA与神经病理性疼痛的关系不同疼痛情况下，不同器官组织中miRNA的表达谱也存在不同，尤其在神经病理性疼痛的不同模型中，建立方法和机制以及引起疼痛的效果等方面均存在一定的差异，因此也就导致miRNA的作用和机制也存在差别。1.慢性坐骨神经压迫损伤模型慢性坐骨神经压迫损伤模型（Chronicconstrictioninjuryofsciaticnerve，CCI）是研究神经病理性疼痛的经典模型之一，MasaeArai等人通过建立小鼠CCI模型，对小鼠海马组织中表达发生改变的miRNA进行了筛选，得到了54条表达异常的miRNA，其中miR-125b和-132的表达水平改变最为显著，分别降低为0.70±0.30和0.69±0.30。这一研究表明，慢性坐骨神经压迫损伤引起了海马区神经元基因表达水平的异常，而miRNA也是其中表达异常的重要参与因子[10]。2.神经接结扎模型由于CCI动物模型的建立存在疼痛反应变异问题，因此，研究者们发展了神经接结扎模型（SpinalNerveligaturemodel，SNL），该模型的有点在于动物模型出现疼痛行为的时间更早并且疼痛时间相对更长更稳定。在此模型的基础上，VonSchackD等人采用TaqMan低密度阵列技术检测了背根神经节（DRG）中miRNA表达谱的改变，确定了63个miRNA的表达水平在SNL术后出现了显著改变。其中，59个miRNA的表达出现了下调，并进一步采用不同的生物信息学方法鉴定轴突重塑显著调节生物途径，其中一些预测通过siRNA敲除Neuro2A细胞中与突起生长相关调节基因进行了鉴定，该研究最终提示miRNAs可能在神经病理性疼痛中发挥直接作用[11]。类似的研究较多，但是研究成果存在部分差异，例如，国内的研究团队对SNL小鼠血清中循环miRNA表达进行了鉴定，研究显示，小鼠血清hsa-miR-221，hsa-mir-34c，hsa-mir-21，hsa-mir-30a-5p和hsa-miR-206在70 综述SNL手术后下降，而hsa-mir-31-5p，hsa-mir-133b、hsa-miR-22和hsa-mirplus-a1087均升高，提示miRNA的变化可能参与神经病理性疼痛的调节[12]。这项研究显示了神经性疼痛条件下血清中miRNA的变化，提示血清中的循环miRNAs是神经性疼痛的潜在预测因子。3.脊髓挫伤模型脊髓挫伤（Spinalcordinjury，SCI）的发生会导致较为严重的神经病理损害，并且病程往往会从最早的机械损伤发展为神经元和胶质细胞的损害，最终引发长时间的炎症反应，造成神经元凋亡等不可逆损伤。因此，有研究者在SCI动物模型中发现了miRNA-21的表达增加，能够调控星形胶质细胞的增殖，从而参与调控血脑屏障受损后的增生性反应，星形胶质细胞中miR-21的表达抑制也导致病变部位轴突密度的增加。这些结果表明，miR-21在脊髓损伤后星形胶质细胞增生和调节神经胶质瘢痕进展的作用[13]。4.坐骨神经分支选择性损伤坐骨神经分支选择性损伤（sparednerveinjury,SNI）模型是一种新型的外周神经损伤导致的慢性神经病理性疼痛动物模型，研究认为，SNI动物模型的疼痛行为特征与临床神经病理性疼痛患者有着较高的相似性。SNI手术后动物模型均出现了同侧机械性疼痛超敏、冷痛超敏、热痛超敏等与临床患者类似的病理表现，并且有研究者在SNI动物模型中检验了目前常用的镇痛药物的药理学特点，证实阿片类药物、离子型谷氨酸受体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂等药物的药理学特征与神经病理性疼痛患者存在相似性，是较为理想的神经病理性疼痛研究模型[14,15]。因此有研究者通过构建神经病理性疼痛的小鼠模型，揭示了鞘内注射miR-124治疗能预防和治疗SNI小鼠神经系统持续性炎症和神经性疼痛[16]。miRNA调控神经病理性疼痛的作用机制miRNA的翻译调控是真核生物基因组表达和功能的关键因素。miRNA在真核细胞中发挥调控基因表达水平的作用，主要是通过与靶基因mRNA3’非编码区的结合来实现。miRNA一方面能够与细胞质中的蛋白结合，形成RNA干扰沉默核糖核蛋白复合物，该复合物能够与靶基因mRNA发生互补而降解mRNA，从而抑制靶基因的蛋白转录；此外，miRNA也可以通过与mRNA的不完全互补抑制蛋白的转录。由于神经病理性疼痛本质上可以认为是神经系统对损伤做出的71 吉林大学博士学位论文应激反应，所发生的病理改变与各种蛋白的表达密切相关，包括信号转导分子、神经递质、炎性因子和离子通道蛋白等[17,18]。因此miRNA通过调控不同信号通路相关的蛋白表达，从而对神经病理性疼痛的病理进程发挥了不同的调控作用。5.miRNA调控神经炎症反应miRNA调控炎症反应的作用和机制已在多种疾病中得到了报道，包括恶性肿瘤、呼吸系统以及神经系统疾病等[19]。研究显示，神经炎症的关键因子，包括IL-1β、TNF-α以及IL-6等，在神经病理性疼痛的痛感产生和持续中发挥了重要作用[20]。而具有抑制炎性因子转录的miRNA能够通过对炎性因子的抑制而发挥预防和治疗作用。研究报道，miRNA-155是调控血脑屏障（BBB）功能障碍的关键miRNA。在体外培养的人脑内皮细胞中miR-155能快速而且有效地上调炎症因子表达水平，从而改变细胞因子诱导的通透性增加。此外，miR-155调节大脑内皮屏障功能的靶点蛋白包括Annexin-2和claudin-1等。最终提示miR-155是一种负性调节血脑屏障中枢神经炎性疾病的分子，而这一作用可能是通过调控神经元细胞膜Toll受体-4来实现[21,22]。越来越多的证据支持miRNA参与人类神经系统炎症的调节。例如研究报道，外源性的miR-23b能够抑制神经系统损伤发生后炎症的发生，其作用包括抑制小胶质细胞浸润、减少炎症因子合成以及抑制活性氧介导的神经元凋亡[23,24]。研究人员IyerA等采用荧光定量PCR和原位杂交技术研究了癫痫相关的胶质神经元病变的特点，发现miR-146a能够促进星形胶质细胞中IL-6和TNF-α的表达，其作用靶点可能是IRAK-1，IRAK-2和TRAF-6蛋白家族，证实了miR-146a诱导的负反馈调节参与了星形胶质细胞介导的炎症反应[25]。因此可以肯定的是miRNA能通过对神经炎症的调控，对神经病理性疼痛的发生发展中起到了重要的作用。6.miRNA调控神经修复大量的研究针对miRNA在神经系统损伤后的修复作用进行了深入探索。研究发现，背根神经节（DRG）细胞在神经损伤后发生基因转录变化，从而通过表型改变促进细胞存活和轴突再生。通过慢病毒载体转染miR-21进入分离的小鼠背根神经节中增强miR-21的表达后，观察到过表达miR-21促进神经轴突生长，并且双荧光素酶实验显示miRNA-21调控的靶蛋白为Sprouty2蛋白，从而证实了miRNA-21是外周神经损伤后生长通路的重要因子[26]。另外，VerrierJD等72 综述人的研究证实，坐骨神经细胞中miR-29能够通过抑制外周神经元髓鞘蛋白22（PMP22）的表达水平，PMP22蛋白是一种主要表达在髓鞘雪旺细胞的疾病相关蛋白，因此miRNA-29在神经系统损伤后修复的过程中发挥抑制作用[27]。此外，研究者采用坐骨神经分支选择性损伤的小鼠模型，证实了小鼠SNI模型中DRG细胞中miRNA-200b和miRNA-429的表达显著下降，其通过调控表观遗传相关蛋白DMNT-3的表达从而对受损神经元的修复、树突重塑等进程进行调控，影响神经病理性疼痛的病理机制[28]。7.miRNA调控中枢以及外周敏化慢性神经病理性疼痛状态的特点是长时间的脊髓神经元敏化，将伤害性信息传递给大脑。而miRNA能够靶向调控伤害感受相关蛋白的表达，包括离子通道蛋白、神经肽以及营养因子等，从而调节人体神经系统对伤害的敏感性[29]。研究发现，在NPP幼年小鼠模型中通过鞘内注射miRNA-103能够有效缓解疼痛，抑制神经中枢敏化，其作用的信号机制主要与miRNA-103-LTC-Cav1.2通道有关[30]。此外，有研究重点检测发现了特定miRNA-96在成年小鼠的背根神经节（DRG）中出现了高度富集，通过脊神经结扎手术（SNL）构建慢性神经病理性疼痛的小鼠模型，证实miRNA-96的表达和分布出现显著改变。miRNA-96在非异常性疼痛的小鼠DRG胞体分布均匀，但在SNL小鼠模型体内miRNA-96主要分布于外周神经元中，提示其可能转录调控慢性神经病理性疼痛相关基因[31]。因此可见，miRNA能够对中枢以及外周神经系统的敏化进行调节。8.miRNA调控中枢去抑制神经病理性疼痛是由神经系统损伤引起的一种慢性疼痛。研究人员主要集中在识别神经源性疼痛的细胞或化学来源，或通过生物学研究神经性疼痛。最近的研究显示，miRNA-23b和NADPH氧化酶4（NOX4）抗体能够减轻动物模型的神经性疼痛，并能特别抑制活性氧（ROS）过度富集引起的神经性疼痛，发挥保护GABA能神经元的作用[32]。此外，在A片样耐受的小鼠模型中，let-7miRNA家族表达水平受到吗啡的增强，而let-7的靶基因为μ受体，其表达升高后抑制μ受体表达[33]。MiRNA本身是人体内的一类具有调控基因组表达功能的内源性因子，参与调控细胞的增殖凋亡，组织分化和功能维持等方面的作用，其在肿瘤的作用以及73 吉林大学博士学位论文机制的研究较为广泛，并且已经有部分研究进入临床应用阶段，但是对于miRNA在神经疼痛方面的研究相对匮乏，近年来，已有研究初步揭示了miRNA在神经病理性疼痛中发挥了关键的调控作用，是NPP加重或减轻的调节因子，因此通过合成神经疼痛相关miRNA的抑制剂或激动剂，有望为神经病理性疼痛的药物研发提供有效的新靶点，但是就目前阶段而言，miRNA与神经病理性疼痛的复杂调节关系仍需要进一步的研究证实。74 吉林大学博士学位论文参考文献[1]WoolfCJ,MannionRJ.Neuropathicpain:aetiology,symptoms,mechanisms,andmanagement[J].Thelancet,1999,353(9168):1959-1964.[2]VanHeckeO,AustinSK,KhanRA,etal.Neuropathicpaininthegeneralpopulation:asystematicreviewofepidemiologicalstudies[J].PAIN®,2014,155(4):654-662.[3]HaicodeGastMD,TorrensmaB,FitzgeraldE,etal.Thetreatmentofchronicneuropathicpain:Bio(regenerative)paintreatmentthroughlipofilling.ashortcommunicationcaseseries[J].Painphysician,2016,19:E495-E498.[4]Trang,Phong,JoanneB.Weidhaas,andFrankJ.Slack."MicroRNAsandcancer."TheMolecularBasisofHumanCancer.HumanaPress,NewYork,NY,2017.277-286.[5]Ji,Weidan,BinSun,andChangqingSu."TargetingmicroRNAsincancergenetherapy."Genes8.1(2017):21.[6]Ivkovic,TinaCatela,etal."microRNAsascancertherapeutics:astepclosertoclinicalapplication."Cancerletters407(2017):113-122.[7]Takahashi,Ryou-U.,etal."TheroleofextracellularvesiclemicroRNAsincancerbiology."ClinicalChemistryandLaboratoryMedicine(CCLM)55.5(2017):648-656.[8]LiX,GibsonG,KimJS,etal.MicroRNA-146aislinkedtopain-relatedpathophysiologyofosteoarthritis[J].Gene,2011,480(1):34-41.[9]Kwok,GraceT.,etal."TranslationalapplicationsofmicroRNAsincancer,andtherapeuticimplications."Non-codingRNAResearch(2017).[10]AraiM,GendaY,IshikawaM,etal.ThemiRNAandmRNAchangesinrathippocampiafterchronicconstrictioninjury[J].PainMedicine,2013,14(5):720-729.[11]VonSchackD,AgostinoMJ,MurrayBS,etal.DynamicchangesinthemicroRNAexpressionprofilerevealmultipleregulatorymechanismsinthespinalnerveligationmodelofneuropathicpain[J].PloSone,2011,6(3):e17670.[12]XuY,ZhangX,PuS,etal.CirculatingmicroRNAexpressionprofile:anovelpotentialpredictorforchronicnervouslesions[J].ActaBiochimBiophysSin,2014,46(11):942-949.75 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