伪狂犬病病毒gD、gE、Tk基因的克隆与通用转移载体的构建

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1、河南农业大学硕士学位论文伪狂犬病病毒gD、gE、Tk基因的克隆与通用转移载体的构建姓名：胡涛申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：崔保安20030601致谢本研究是在导师崔保安教授悉心指导下完成的。三年来，崔老师在学习、工作和生活上无微不至的关怀，使我终生难忘；导师渊博的知识、严谨的治学态度、高瞻远嘱的科学视野以及勇于开拓的敬业精神使我终生受益。在次特向崔老师致以最崇高的敬意和衷心的感谢!衷心感谢导师组的卢中华教授、王泽霖教授、王川庆教授对我的关怀和指导!尤其是卢中华教授丰富的临床经验；王泽霖教授渊博的专业知识、不息的创业精神；t)ll庆教授所开设的课程、严谨的治学态

2、度、负责的精神，学生受益终生!感谢本实验室的杨明凡、王学斌、张素梅等老师和师弟祁小乐、师妹王利娟给予的关怀和帮助!最后，特别感谢我的家人给予我的理解与支持，他们的支持与鼓励是我成长的动力源泉!河南农业大学2003届硕士论文摘要参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD、啦、TK基因的序列设计了三对引物，对PRVMin-A株进行了PCR扩增，扩增产物克隆于pGEM—TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实了克隆片段的可靠性。阳性质粒分别命名为pGEM-gD、pGEM—gE、pGEM—TK。基因测序的结果表明gD基因包含一个1203bp的开放性阅读框(OR

3、F)，编码400个氨基酸组成的多肽。将曲基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3．卜的hCMV启动子下游，构建了真核表达质粒pcDNA—gD'为下一步基因免疫奠定了基础。gE基因包含一个1740bp的开放性阅读框(ORF)，编码579个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明PRVMin-A株与PRVEa株、sH株gE的核苷酸同源性分别为99．2％、98．7％；推导氨基酸的同源性分别为98．6％、97．2％。TK基因包含一个957bp的开放性阅读框(0RF)，编码318个氨基酸组成的多肽。在TKORF上游一22、一166、一199位存在3个GC框样序列，在终止密码子下游第ii0个核苷酸

4、处的1306位存在有多聚腺苷加尾信号。PRVMin-A株与PRVEa株、NIA一3株TK的核苷酸同源性分别为98．4％、97．996；推导氨基酸的同源性分别为97．8％、97．2％。通过对Q疱疹病毒TK氨基酸进行多序列比较，我们获得了在PRvTK氨基酸序列上的六个保守区间。推测这些保守氨基酸对于胸苷激酶(TK)结构的稳定性和催化活性的发挥是必需的。将妒、醇基因连接于质粒pUCl8获得pUgDgg，缺失质粒pUgDgE的BamHI和BstEII位点间391bp的片段。在此缺失位置插入来自质粒pcDNA3．卜的一第l页共52页伪狂犬病病毒gD、gE、n基因的克隆与通用转移载体的

5、构建段含hCMV启动子、多克隆位点和Neo报告基因的片段，构建了通用转移载体pgD—M-gE。该转移载体缺失了伪狂犬病病毒gI基因和gE基因ORF5’端363bp的碱基，有11个酶切位点可供外源基因的插入，上下游侧翼分别为1．25kb和1．42kb。这为开发以伪狂犬病病毒为载体的多价基因工程疫苗提供了有力工具。关键词：伪狂犬病病毒；gD基因；gE基因；TK基因；通用转移载体第2页共52页文献综述1．伪狂犬病感染与流行特点伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又叫奥叶兹基氏病(Aujeszkysdisease，，，AD)是由伪狂犬病病毒(PrY)引起的多种家畜、野生动物、

6、伴侣动物和实验动物的一种急性传染病Ⅲ。家畜伪狂犬病是被人们认识较早的动物传染病之一，本病最早(1800年)见于美国，1902年匈牙利学者Aujeszky氏首先认定为一种独特的病，1910Schniedhoffer证实为病毒，1935年Shope发现猪对本病的传播具有重要作用。在60年代以前，从猪和牛已分离到了病毒，但那时对养猪业造成的损失不大。60年代以后，由于强毒株的出现，猪伪狂犬病在世界范围内频繁暴发，甚至一些伪狂犬病消失多年的地方，如奥地利等又重新出现。伪狂犬病现已遍及欧洲、东南亚、美国、南美洲及非洲等40多个国家和地区，仅芬兰、挪威等少数国家仍无伪狂犬病的报道。我国

7、周边一些国家，如泰国、韩国、日本、菲律宾、老挝、马来西亚、新加坡和越南等都有伪狂犬病流行。自刘永纯(1948)首先在我国发现猫PR以来，相继有许多省(市)报道有PR的暴发和流行。猪、牛、绵羊、犬、猫、山羊和貂均有发病，尤以猪为主。该病多呈地方性流行，也有散发，几乎遍及全国。由于感染动物范围广和特殊的传播机制，已成为家畜重要传染病之一，特别在猪群中流行尤为严重，许多国家把该病列为活畜和畜产品进出口的检疫对象。1．1感染特点1．1．1感染谱广第3页共52页伪狂犬病病毒gD、gE、Tic基因的克隆与通用转移载体的构建伪狂