葡萄SAMS基因的克隆、原核表达及分析

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分类号：密级：学校代码：10165学号：2QlQl幽遣掌师耗犬学硕士学位论文⑨葡萄鲥胳基因的克作者姓名：学科、专业：研究方向：导师姓名：隆、原核表达及分析2013年04月 学位论文独创性声明本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：幽：学位论文版权的使用授权书本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本授权书。学位论文储虢丝蛔指导刻雠：送坐鳢签名日期：2。l玉年r月割日 辽宁师范大学硕士学位论文摘要植物在生长发育过程中，会遭受不同的生物和非生物胁迫，例如病虫害、干旱、伤害、低温，以及高盐等。作物在遭受逆境胁迫时，其正常生长发育会受到影响，作物质量和产率都会有所下降，直接或间接导致经济利润的下降。现在，人口不断增长以及环境恶化，自然灾害不断发生，作为具有重要经济价值的水果一葡萄，其品种培育和科学栽培管理等问题越来越受到了人们的关注。因此，葡萄抗逆新品种的培育成为了葡萄栽培种抵御不良环境胁迫的最行之有效的方法之一。本研究以欧洲葡萄(所如vinifera)为研究材料，以欧洲葡萄中的S一腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase，SAMS)为研究对象展开了研究，研究内容和结果如下：1．对葡萄基因组数据库(http：／／compbio．dfci．harvard．edu／tgi／cgi-bin／tgi／Blast／index．egi)进行检索分析，获得了5个包含有完整ORF区和保守结构域的VvSAMS基因，并对其进行了初步的生物信息学分析。分析结果显示，这5个VvSAMS蛋白都包含有SAMS典型的N端结构域、中间结构域和C端结构域；且都不具有信号肽和跨膜结构域，都不是分泌蛋白，也不是膜蛋白；其二级结构主要由仅螺旋和随机卷曲组成。相似性分析结果显示，得到的这5个葡萄SAMS基因与拟南芥SAMS基因分别存在不同程度的相似性，这对于我们深入研究VvSAMS基因的结构以及功能等都具有重要理论参考价值。2．以欧洲葡萄叶片为材料，克隆得到两个含有完整开放阅读框(ORF)的VvSAMSl基因和阳‘蜘^么S．；基因。3．用SA、MeJA和创伤处理葡萄叶片，通过实时荧光定量PCR的方法，分析了VvSAMSl基因的表达量的变化。分析结果显示，不同胁迫处理条件下，其相对表达量均发生了变化，并且呈现出一定的规律性。这表明VvSAMSl基因与植物抗逆性存在一定关系。4．成功构建了葡萄VvSAMSl基因的原核表达载体，并将重组子转入到大肠杆菌BL21中，利用IPTG对重组子进行诱导表达，实现异源表达，这对于我们深入研究VvSAMS基因表达的蛋白的功能打下了良好的基础。对欧洲葡萄中SAMS基因的克隆、功能分析以及生物分析等的研究，为了更深入研究VvSAMS基因的抗逆性机制以及功能等都提供了重要的理论依据和实验研究基础。关键词：葡萄；SAMS；生物信息学分析；原核表达；实时荧光定量PCR 葡萄．翻^艿基因的克隆、原核表达及分析Cloning，BioinformaticsAnalysisandProkaryoticExpressionofSAMSGenesin所廊viniferaAbstractIntheprocessofgrowthanddevelopment，plantoftenencountersbioticandabioticstressessuchaspests，disease，drought，injury，lowtemperatureandSOforth．Thoseadversitystresseswillaffectthegrowthanddevelopmentofplant，．1eadingtodecreaseofproductionandquality．Incurrently，withtheincreasofpopulationanddegradationofenvironment，asanimportantfruitintheworld，grapeisfacingthestressproblemsinthecultivation．Therefore，cultivatingnewvarietyofgrapewhichwillresistortoleranttothestresseshasbecomeoneofthebestwaystosolvetheproblem．Inthisstudy，S-adenosylmethioninesynthetase(S舢垤S)geneswereclonedfrom矿vinifera．ThesquencesofclonedgeneswereanalyzedandthenwereexpressedinprokaryoticEcoli．Theresultsareasfollows：1．Retrievaingandanalyzinggenomedatabaseofgrape，wefoundfiveSAMSgenes谢tIlentireopenreadingframe(OR_F)．Thenresultsofpreliminarybioinformaticsanalysisshowedthata11ofthefiveSAMSgenescontainthespecificN-terminaldomain，middledomainandC-terminaldomainofthegene．TheproteinsarenotSecretedproteinsandMembraneproteins．Thesecondarystructuresweredominatedbythea-helixandrandomcoil．WefoundthattheSAMSgeneofgrapehadaveryhighhomologywiththegeneofArabidopsis’．ThoseresultshaveimportanttheoreticalsignificancesforthefurtherstudyonthestructureandfunctionofVvSAMSgene．2．TwomembersofSAMSfamilywithentireopenreadingframe(ORF)，VvSAMSlandVvSAMS3，wereclonedfromleafofⅥtlSvinifera．3．Afterthegrapeweretreatedunderdifferentstresses(S八MeJAandmechanicalinjury)，weanalyzedthechangesofrelativeexpressionlevelsofVvSAMSs，byReal—timePCRmethod．Theresultsshowedthat，underthestresses，theexpressionlevelsofVvSAMSsshowedsomeobviouschanges．Theresultsimpliedthattheexpression,oftheVvSAMSswasrespondedtothestresses4．TheVvSAMSgeneswereconstructedintoEcoliBL21．TheresultsofSDS．PAGEanexpressionvectorandthentransformedinshowedthatrecombinantproteinexpressedheterologouslyintheE．co#afterinduction．Cloning，analysisandprokaryoticexpressionofVvSAMSGenesbuiltafoundationforthefurtherresearchontheinvolvementofstressresistancemechanismsandfunctionofthegenesⅡ 辽宁师范大学硕士学位论文Keywords：V／asvinifera；SAMS；Bioinformatiesanalyze；Prokaryoticexpression；Real-timefluorescencequantitativePCRIⅡ 葡萄．5Ⅲk召基因的克隆、原核表达及分析目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．Ⅱ引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1S．腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的结构和催化机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2SAMS家族基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．3S．腺苷甲硫氨酸(SAM)与乙烯和多胺合成途径之间的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．4SAM的生物学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．4．1转甲基作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．4．2转氨丙基作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．4．3转硫基作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．5SAM的临床应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．5．1对于关节炎方面的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一61．5．2对于抑郁症方面的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一61．5．3对于肝病方面的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61．6本实验研究内容及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．62葡萄觥基因的克隆和生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．1实验材料和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．1．1实验材料、试剂与耗材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72．1．2溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72．1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一82．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．2．1序列的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82．2．2葡萄．蝴基因的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一82．2．3生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．3．1序列的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．3．2葡萄渊基因的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．3．3葡萄渊基因的生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．193葡萄SAMS基因在不同胁迫下的实时定量表达研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2lIV 辽宁师范大学硕士学位论文3．1材料处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯213．2RNA的提取、纯化及cDNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一213．3引物设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2134实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一213．5结果⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．5．1葡萄RNA电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．5．2实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．6讨{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯234葡萄SAMS基因的原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一254．1实验材料、试剂及溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯254．1．1实验材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯254．1．2溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯254．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．254．2．1目的基因的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯254．2．2重组表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯264．2．3诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯284．2．4SDS-PAGE电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．284．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯294．3．1重组质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯294．3．2SDS—PAGE电泳检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．294．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯305结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33附录A论文中所用Marker⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36附录BpET28a表达载体图谱一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一37附录CVvSAMS家族成员ORF及保守结构域的预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38附录DVvSAMS家族成员蛋白的信号肽和跨膜结构域预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42攻读硕士学位期间发表学术论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．47V 辽宁师范大学硕士研究生学位论文己-I言dIizzl葡萄(玢如vinifera)，是被子植物门，双子叶植物纲，葡萄目、葡萄亚目、葡萄科、葡萄属，为落叶藤本植物。葡萄不仅甘甜可口，并且具有非常高的营养价值，它含有人体必不可少的矿物元素(Ca、K、Fe等)和多种维生素(维生素B、维生素C等)。葡萄在全世界大概有一千多种，主要分为食用葡萄和酒酿葡萄，是世界上最具经济价值的水果之一。尽管葡萄品种多，但是其遗传可变性是很有限的，目前，种植的葡萄品种大都容易感染病毒真菌等。在19世纪，病原体，例如白粉菌和霜霉菌，被从北美引进到了欧洲，由于葡萄对霉菌真菌的抵抗力非常低，所以这成为葡萄栽培的主要风险因素之一，而且葡萄抵抗逆境胁迫(例如干旱、低温、高盐等)的能力也较弱。这些逆境胁迫都会造成葡萄产量大幅降低，所以为了克服这些问题，最好的解决办法就是开发高抗逆性新品种。三磷酸腺苷(A1P)和L一甲硫氨酸，在S一腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的催化下生成S一腺苷甲硫氨酸(SAM)【11。SAM是生物体生化反应中的主要甲基供体，它还参与乙烯和多胺的生物合成途径【21。大量研究已经证实，环境因素、生长发育以及激素等都会影响删基因的表达量。近些年，对于＆雠因，研究学者展开了大量研究。例如在拟南芥13J(Arabidopsis)、茶树【41(Camelliasinensis)、水稻【51(OryzaSativa)、野生大豆【6】(Glycinesoja)、美洲黑杨[71(Populusdeltoids)、亚麻【81(Linumusitatissimum)、掌状海带【9l(Laminariadigitata)、团藻【10】(Volvoxnagariensis)等多种植物中已经成功克隆得到．刚^程基因，并且对．翻^么法因进行了关于抗逆性机制以及生物信息学分析等方面的研究。但是，对于葡萄中该基因的克隆及功能分析等研究尚未见报道。 葡萄SAMS基因的克隆、原核表达及分析1文献综述L．甲硫氨酸和ATP，在SAMS的作用下，最后反应合成S．腺苷甲硫氨酸(SAM)，这是目前研究者研究发现的生物合成SAM的唯一的一条途径。1952年，意大利科学家Cantoni最早发现了SAM，SAM在动物、植物【11】及微生物中广泛存在，它参与生物体内多种生化反应，是重要的生物中间代谢产物，还是具有高能量的活性物质。它是生物体中最主要的甲基供体【121，主要参与生物体内转甲基、转硫基、转氨丙基作用，SAM还参与植物中乙烯合成和多胺合成途径，同时也参与甜菜碱代谢生化反应，还有核酸以及蛋白质等多种化合物的合成。临床医学研究表明，SAM还能用于肝病【131、抑郁精神病型14】、关节炎【l习、偏头痛等病症的治疗，并且对这些病症具有一定疗效。1．1S一腺苷甲硫氨酸合成酶(SAlI|lS)的结构和催化机制现在，对于SAMS结构(图1．1)的研究，主要是针对于大肠杆菌中SAMS结构的研究。其蛋白质的结构是六方体结构的，研究发现它由四个相同的亚基组成，它的形成过程是这样的：两个亚基聚合成类似于球形的二聚体；然后两个球形的二聚体紧紧聚合，又形成一个四聚体【16】；每个二聚体有两个活性位点，这两个活性位点位于两亚基之间。每个亚基都是由9个0【螺旋、11个B折叠以及5个310螺旋构成的，最后又构成三个结构域(即是：N端结构域、中间结构域和C端结构域)。N端结构域和中间结构域都有4个折叠和2个螺旋；而C端结构域没有，不同的是其中的一个折叠换成了螺旋，中间螺旋又被分成两个小的；这三个结构域组成了一个伪3倍对称折叠的结构。图1．1SAMS的结构模型Fig．1．1ThestructuremodelofSAMSSAM是在SAMS催化下合成的，这个合成过程是一个独特的二步反应。即ATP分解出一个完整的三磷酸根和SAM，在SAM释放之前，三磷酸根盐水解生成PPi和Pi。研究人员用立体化学和动力学同位素研究等方法对这个独特的催化反应进行了大量研 辽宁师范大学硕士研究生学位论文究。Cantoni最早报道了二价金属离子对于酶生物活性是必不可少的；EPR光谱研究也证明了活性位点中存在两个二价金属离子；酶促机制研究发现，使用大量ATP和甲硫氨酸类似物对酶反应具有抑制作用。1．2SAMS家族基因几乎每一个已经鉴定的SAMS基因在生物体内都有表达，只有某些寄生虫是例外的，它们获得的SAM可能是来自于宿主。在同工酶中，催化亚基a是很普遍的，而单拷贝基因的调节亚基p只被发现在哺乳动物中。在细菌和真核生物中，其0【亚基之间具有高度保守性。研究表明，s一甲硫氨酸合成酶基因上的ATP结合模体GAGDQG在所有的组织中，包括从细菌到哺乳动物都具有高度保守性。除了古细菌和哺乳动物的S州SIⅡ是二聚体外，大多数SAMS同工酶是作为同型四聚体存在的。哺乳动物同工酶被3个基因编码，即MATlA、MAT2A和MAT2B。在氨基酸水平上，MATlA和MAT2A的催化亚基的相似度有85％，其ORF分别编码396个氨基酸和395个氨基酸。MAT2B基因的ORF编码335个氨基酸。MATa2和D亚基形成异寡聚物MATII，而MATotl亚基形成二聚体(MATIII)和四聚体(MATI)。这些酶的不同就在于其Km值的不同，MATII为30I_tM，MATI为looⅢM，MATIII为lmM。1．3S一腺苷甲硫氨酸(SAM)与乙烯和多胺合成途径之间的关系SAM既参与乙烯的生物合成，又参与多胺合成途径117l(如图1．2所示)。M．Lieberman和L’M．Mapsontl8】(1964年)最早发现了甲硫氨酸(Methionine，Met)能合成乙烯。许多研究都证明了甲硫氨酸是乙烯的前体【191。1979年，D．Adams和杨祥剔201证实了SAM和卜氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)都是合成乙烯的中间产物。Met在SAMS的催化下合成SAM；SAM在ACC合成酶(ACS)催化下合成ACC；在有氧存在时，ACC又在ACC氧化酶(ACO)作用下形成乙烯。SAM是乙烯生物合成的中间物质，另一方面又参与多胺合成途径。多胺是一种生物活性物质，其广泛存在于植物、动物和微生物中，其中分布最广泛的是腐胺(Put)、精胺(Spm)以及亚精胺(Spd)。存在于植物体内的多胺，通常以游离态形式存在，它也常与香豆酸、咖啡酸、肉桂酸等酚类化合物结合，以结合态形式行使重要的生理功能。在植物体中，对于多胺合成途径的了解已经比较详尽了。简要地来说，多胺合成途径即是：精氨酸途径和鸟氨酸途径，且在多胺的合成的过程中，Put是最重要的中间代谢物。一方面，精氨酸在精氨脱羧酶(Argininedecarboxylase，ADC)作用下生成鲱精胺(agmatine)，它又在鲱精胺亚氨水解酶作用下生成Put；另一方面，精氨酸在精氨酸酶(arginase)作用下生成鸟氨酸(ornithine)，鸟氨酸又在鸟氨酸脱羧酶(omithine 葡萄SAMS基因的克隆、原核表达及分析decarboxylase，ODC)作用下生成中间产物Put，最终Put又转变为Spd和Spm。在多胺合成过程中，脱去羧基的SAM是作为氨基供体参与这一合成过程的。此外，在亚精胺、精胺等多胺的合成以及乙烯的合成过程中，SAM都是必不可少的，则多胺和乙烯的合成就存在着竞争关系[21-231，多胺的不断合成会抑制乙烯的生成，所以，推测在植物抗衰老的研究中多胺可能具有一定的作用。还有研究表明，在植物遭受到逆境胁迫作用时(例如NaCI、甘露醇等渗透胁迫)，植物体内ADC活性增加的非常明显，Put水平会显著的增加，同时保护了原生质体完整性。因此，推测多胺能够使细胞适应逆境条件。综上所述，对于多胺的不断探索，一方面可以通过PA调节植物中乙烯的合成，从而调节植物的正常生长发育和植物果实成熟等；另一方面，研究多胺参与生物和非生物胁迫的响应机制，能够较好的提高植物对逆境条件的适应性【2牝51。因此，我们也可以推测鲥^舔基因在植物抗逆性响应中可能具有重要作用。Ak¨『mn。㈣■≮ODC幽eAD芦CA、．．．。：．一：一|ls。aden。Slmethi。nine．—-|．◆dSAM—。。’’’、、>毒Spdsynlhasel⋯上一Spermidine上ACCs．vnthase甑湘c刊S．pms．ynthaseINAVG下毒fVlACC。xida辩图1．2乙烯、多胺合成途径Fig．1．2Thebiosyntheticpathwayofethyleneandpolyamines1．4SAM的生物学意义SAM是在SAMS的催化下合成的，是生物体中重要的中间代谢产物。SAM在甲基化反应中作为甲基供体为反应提供甲基【261，在多胺合成和转硫基作用中SAM也是必不可少的(如图1．3所示)。4 辽宁师范大学硕士研究生学位论文熙竺洲一心觚冁⋯⋯亚穗胺fsAM}、撒卅障茎黼门氨眠圃IJ二甲基N，N，N-三I⋯～．．I二：：：：2l糟被／I甘氟酸甲基甘氨酸I墨甄舅巴，B6—————二上+—鼍要商半盏氮馥——二=====▲吁礁，fBl：＼脱虢麓p-含成酶l工孽錾薹嚣墨l篓呼酸氢叶致I基t亚甲基四l冀愀躺谷氯霈亚甲基四氢叶酸首嚣囊●iY谷髋首肽图1．3SAM的代谢途径Fig．I．3MetabolicpathwaysofSAM1．4．1转甲基作用SAM在生物生化反应中作为甲基供体具有举足轻重的作用。SAM为生物体中的甲基化反应提供甲基[27-29】，其经脱甲基作用形成S一腺苷高半胱氨酸(SAH)；SAH在SAHH的作用下，反应生成腺苷和高／同半胱氨酸。在每个甲基化反应中，酶都是专一的，但甲基化作用产物都是SAH[30】。此外，SAM还参与RNA、DNA和蛋白质等的甲基化作用以及修饰等，其中蛋白质的修饰还包括了翻译后的修饰1311。在这些甲基化作用和修饰中，目前DNA甲基化修饰的研究最受到研究人员的关注【321。1．4．2转氨丙基作用SAM的另一个重要作用是作为氨丙基供体，参与多胺的合成1331。SAM经脱羧作用形成5．_腺苷甲基硫丙基胺，其与腐胺和亚精胺结合，最终分别合成亚精胺和精胺。所以，在多胺合成中，SAM也具有重要作用。1．4．3转硫基作用SAM脱去甲基后生成SAH；SAH又在水解酶作用下，能够生成腺苷和高半胱氨酸；高半胱氨酸最后参与到再甲基化作用或转硫作用中。转硫基作用过程中，在维生素B6和丝氨酸都存在的条件下，高半胱氨酸经脱硫醚B一合成酶催化生成胱硫醚，这是一个不可逆的催化反应；中间产物胱硫醚(cystathionine)被丫一胱硫醚酶(cystathionase)水解[黼]_、捌胺陂甲翩=：耋； 葡萄satyrs基因的克隆、原核表达及分析为半胱氨酸(Cys)；之后Cys进一步发生催化反应，最后生成了谷胱甘肽(GSH)，GSH在哺乳动物细胞内是非常重要的抗氧化分子【34】。1．5SAM的临床应用1．5．1对于关节炎方面的研究目前对于关节炎的治疗，多数是治标不治本，并且不能完全治愈。所以人们越来越关注对于这一类疾病的治疗方法或药物。临床研究表明，食用补充SAM对关节炎疾病的病症具有相对明显的效果，其对于人体是非常安全的，并且副作用也小【351。1．5．2对于抑郁症方面的研究临床应用证明，SAM可以改善抑郁症患者的抑郁症症状[36-381。SAM是一种天然分子，它与常用的抑郁症治疗药物(例如三环类抗抑郁药等治疗抑郁病症的药物)相比，可能是相对最好的治疗抑郁症的药物之一。SAM的优势是见效快且无副作用，SAM几乎没有其他药物所具有的不利影响。1．5．3对于肝病方面的研究对于慢性肝脏疾病(酒精和非酒精性肝硬化、雌激素诱导引起的胆汁淤积等)的治疗，临床医学研究证明，外源SAM能够恢复肝脏的正常功能。SAM还能够防止或扭转其他药物对肝脏的毒性1391。除此之外，SAM对肝炎和肝衰竭也有很好疗效。此外，SAM还具有治疗纤维性肌痛、降血脂、抗衰老等作用。虽然并没有直接证据证明SAM的减少会导致上述疾病，但是在临床应用上，SAM已经表现出对上述疾病具有疗效作用，而且其见效快、副作用少，所以被研究者认为是一种具有很大发展的药物。1．6本实验研究内容及意义本实验以欧洲葡萄(Vitisvinifera)为研究材料，SAMS基因为研究对象，克隆得到SAMS基因家族中的两个成员VvSAMSl基因和VvSAMS3基因。用SA、MeJA和创伤处理葡萄叶片，通过实时荧光定量PCR的方法，分析VvSAMSl基因的表达量变化情况。并将VvSAMSl基因转入大肠杆菌BL21原核表达菌中，并最终实现异源表达。同时对得到的5个VvSAMS基因进行初步的生物信息学分析。本实验为深入的研究和了解葡萄VvSAMS基因的功能提供了必要依据，并且对揭示植物抗逆原理和培育抗逆新品种也有很深入的意义。6 辽宁师范大学硕士研究生学位论文2葡萄剐胳基因的克隆和生物信息学分析2．1实验材料和仪器2．1．1实验材料、试剂与耗材(1)葡萄材料：本实验室种植；’E．coliDH5a：本实验室保存原菌；实验中所用引物：由上海Invitrogen公司合成；反转录试剂盒：购自上海Invitrogen公司：胶回收试剂盒：购自北京TIANDZ公司；DEPC：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。(2)所需耗材：将1．5mL和2001aLEppendorftube浸泡在I％oDEPC水中进行过夜处理，高温高压灭菌40min，烘干后备用。除EP管以外，所有研磨器具都需要在180℃烘烤3．5h。2．1．2溶液的配制(1)DEPC水：1LddH20中加入lmLDEPC原液，配制1‰DEPC水，搅拌混匀，在37℃过夜后高压灭菌，4℃保存备用。(2)50xTAE：Tris2429，冰乙酸57．1mL，O．5mol／LEDTA(pH8．0)100mL，加纯水定容至lL。(3)LB培养基(100mL体系)：在三角瓶中，分别加入胰蛋白胨(Tryptone)、lg；酵母提取物(YeastExtract)、0．59；NaCI、lg；加ddH20定容至100mL，高压灭菌，4"C保存(固体培养基则还需加1．59琼脂)。(4)2×YT培养基(100mL体系)：在三角瓶中，分别加入胰蛋白胨(Tryptone)、1．69；酵母提取物(YeastExtract)、lg；NaCl、0．59；加纯水定容至100mL，高压灭菌，40C保存备用。(5)X-gal：将20mgX-gal加入到含lmLDMF溶液的1．5mLEppendorftube中，混匀，得到终浓度是20mg／mL，一20。C避光保存。(6)IPTG(200mg／mL)：在1．5mLEP管中加入800VL超纯水，并将200mg异丙基一p—D-硫代吡喃半乳糖苷(口TG)加入EP管中充分溶解，然后用0．22山VI的滤膜对其进行过滤灭菌，-20℃保存备用。 葡萄JSm签基因的克隆、原核表达及分析2．1．3主要仪器(1)．80℃低温冰箱(2)PCR仪(T擞缸h)(3)凝胶成像系统DNA数据检测仪(4)KYC．IOOB型恒温摇床(5)DYYIIl2稳压稳流电泳仪(6)ZF一型紫外检测分析仪：上海嘉鹏科技有限公司(7)BCN．1360B型超净工作台：北京东联哈市仪器制造有限公司(8)GNP．9080BS．III型恒温培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司(9)Eppendorf541Centrifuge5417R(Germany)2．2实验方法2．2．1序列的获得在葡萄基因组数据库(http：／／compbio．dfci．harvard．edu／tgi／cgi—bin／tgi／Blast／index．c西)中，以S．adenosylmethioninesynthetase为关键字进行查询，查找出同源的VvSAMS基因的全部EST序列，利用DNAman等软件将具有重叠部分的EST序列进行拼接、延长等操作，组合成足够长的复合EST序列。对得到的序列利用NCBI的ORFFinder(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html)程序进行ORF预测，筛选掉ORF不完整的EST序列，去除重复的SAMS基因，最后得到5个具有完整ORF区的序列。对其中阴^跚^舔，基因和¨^铂^牺；基因进行克隆。2．2．2葡萄SANS基因的克隆2．2．2．1葡萄总ENA的提取(1)称取新鲜葡萄叶片0：lg，加入液氮研磨成粉末，转移到RNase．free的1．5mLEppendorftube中备用。(2)加入lmL预热的SDS提取液(100mmol／LLiCl，100mmol／LTris(pH8．O)，50mmol／LEDTA(pH8．o)，2％SDS，16％PVP)和lo“Lp一巯基乙醇，用漩涡振荡仪剧烈振荡混匀，冰上静置5min。(3)4℃，12000rpm离心10min。吸取上清转移到一个新的1．5mLEppendorftube中，加入3309L5MKAc(pH5．5)，混匀后在冰上静置5min。(4)4℃，12000rpm离心10min。吸取上清转移到一个新的1．5mLEppendorftube中，加入1／5体积(大约200I．tL)氯仿，上下剧烈振荡使溶液充分混匀，冰上5min。 辽宁师范大学硕士研究生学位论文(5)4"C，12000rpm离心15min。将上层水相慢慢转移到一个新的1．5mLEppendorftube中，加入3，5体积(大约600I．tL)预冷的异丙醇，小心的上下混匀，-20。C沉淀30min。(6)4"C，12000rpm离心lOmin。(7)弃上清，加入lmL75％乙醇对沉淀进行漂洗。(8)4"C，12000rpm离心1rain，以除掉EP管中残余液体。(9)室温晾干5min，加入20止RNase．freeI-I：O溶解沉淀。2．2．2．2RNA的纯化(1)在RNase．free的1．5mL离心管中，分别加入以下成分：试剂体积RNA20I止10xDNaseIBuffer5止RNaseInhibitor0．5皿DNaseI2止RNase—freeH2022．5此终体积50pL(2)37℃反应30min。(3)加等体积的氯仿到EP管中，剧烈振荡5min，冰上5min。(4)4℃，12000rpm离心15min。(5)小心的将上层水相转移到一个新的RNase．free的1．5mLEppendorftube中，将等体积的预冷的异丙醇加入到EP管中，小心的上下颠倒混匀，一20"C沉淀2h。(6)4"C，12000rpm离心10min。(7)弃上清，加入75％乙醇漂洗沉淀。(8)4"C，12000rpm离心lmin，以除掉EP管中残余液体。(9)室温晾干5min，加入20I此RNase．free1-120溶解沉淀。2．2．2．3反转录(1)在一个200pLEP管中加入以下组分：·试剂体积RNA5止dNTP(10mM)4山二Oligo(dT)0．1pLddH202．9pL(2)将上述溶液混匀充分，65。C热水浴中反应5min，迅速置于冰上冷却。(3)稍离心后，向上述溶液中继续加入以下组分： 葡萄|Sm舔基因的克隆、原核表达及分析试剂体积上述反应液129L5×第一链合成缓冲液4止0．IMDTT2止RNaseInhibitor(40U／gL)1止(4)将步骤3中溶液混匀充分，在37。C恒温热水浴中孵育2min。(5)在室温下加入l止M．MLV逆转录酶(200U／gL)，吹打混匀。(6)在37。C孵育50rain。(7)将EP管中放在70℃中继续加热15rain，终止反应。(8)加入0．19LRNA酶，除去多余的RNA，．20。C保存。2。2．2．4葡萄。鲥a豁基因的PCR扩增(1)引物设计：以得到的VvSAMSl和阳^朔^瓠罗的cDNA序列为基础，利用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列为：VvSAMSl．F：5。．CAGTTATAGGCGGCGGTC．3’VvS』U讧S1—R：5'-ACAAGCTAACAGCGTCCCAGT．3’VvSAMS3．F：5’．CTCTCCATCCGTCAACA(}3’VvSAMS3-R：5‘．TCATG渔GCGATTCCTTATTC．3‘(2)以2．2．2．3得到的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(20I止)：．试剂体积eDNA模板1止10XPCRBuffer29LlOmmol／LdNTP1．6p．L引物-F0．49L引物．R0．4此TaqDNA聚合酶0．29L灭菌水upto20此PCR扩增反应条件：10 辽宁师范大学硕士研究生学位论文94℃50℃72℃]}35Cycles．1222．5PCR产物的电泳及纯化将PCR产物置于1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，使用天恩泽胶回收试剂盒对目的片段进行回收纯化，具体操作方法按北京天恩泽胶回收试剂盒说明书操作：(1)将切下的胶放入1．5mLEP管中，加4001．6．,通用溶胶液，506C热水浴5min，溶胶。(2)将溶胶液全部转移到吸附柱中，室温静置3rain。(3)20℃，12000rpm离心lmin，把收集管中废液都倒掉。(4)将700]aL通用洗柱液加入到离心柱中，在室温条件下放置2min。(5)20。C，12000rpm离心lmin，把收集管中废液都倒掉。(6)将离心柱置于一个新的Eppendorftube中，加入65。C预热的通用洗脱液20止，静置3rain。(8)20℃，12000rpm离心lmin，EP管底部的即为DNA。2．2．2．6回收片段的连接将回收的目的片段与pMD．19TVector进行连接，连接反应体系如下：试剂体积pMD一19TVector0．5皿SolutionI4．59LPCR回收产物59L灭菌水upto10此反应条件：16℃连接过夜。2．2．2．7连接产物的转化(1)大肠杆菌感受态细胞的制备①从．80℃低温冰箱中取出保存的大肠杆菌DH50t原菌，在冰上缓慢解冻(约30min)。②在超净工作台里，将接种环深入到大肠杆菌DH5a原菌菌液中，然后在LB固体培养基(不含氨苄)上划线。③将划线的LB平板倒置于37。C培养箱中，培养12—14h。④从LB平板上挑取单菌落，接种到2xYT培养基(5mL)中，在37。C、／50rpm振荡培养12．14h。O3n．US．U玎Ⅱ0O盯O531J1 葡萄SAMS'基因的克隆、原核表达及分析⑤取出菌液lmL，接种到2×YT培养基(100mL)中，在37"C、200rpm振荡培养至OD600=0．4．0．6(大约2-3h)，将菌液平均分装到2个50mL的大EP管中。⑥将菌液置于冰上lh。⑦4℃，4000rpm离心5min，弃上清，用25mL预冷的溶液A(O．4MNaAC，10mL；1MCaCl2，10mL；0．7MMnCl2，10mL；ddH20，70mL)将重悬沉淀菌体，置于冰上1h。⑧4℃，4000rpm离心5min，弃上清，用2．5mL冰浴冷的溶液B(1MCaCl2，lmL；0．4MNaAC，lmL；0．7MMnCl2，lmL；ddH20，7mL；50％甘油，10mL)重悬沉淀菌体，最后分装至1．5mLEP管(每管含1009L)中，迅速置于．80。C冰箱中保存备用。(2)连接产物的转化①取一管DH5a感受态细胞，冰上解冻。②在超净工作台上，向感受态细胞中加入全部连接产物(10止)，用枪反复吹打混匀，置于冰上1h，每隔10min轻弹一次EP管使溶液混匀充分。③42℃热水浴热激90s，迅速取出，冰浴5min。④在超静台上，加入lmL无氨苄的LB液体培养基，混匀后置于摇床中，37"C，200rpm振荡培养1h。⑤室温，5000rpm离心5min，弃约900pJ_,上清，用剩余上清将菌体重悬，加入40止X-gal和4止IPTG，轻轻混匀，用涂布器将全部菌液均匀涂布于LB固体培养基(含氨苄)上。⑥将平板于隔水式恒温培养箱(温度设置为37。C)中，倒置培养12—14h。⑦次日观察是否有明显单菌落生成，并将平板置于4"C冰箱中，使蓝白斑更加分明。⑧挑取单菌落白斑接种到lmLLB液体培养基(含氨苄)中，轻轻混匀，置于摇床中，37℃、150rpm振荡培养过夜。2．2．2．8菌液PCR检测以过夜培养的菌液为模板，pMD．19T通用引物为引物，进行菌液PCR检测。pMD．19T通用引物为：RV-M：5'-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC．3·M13-47：5’．C(；CCAG(X订TTTCCCAGTCACGAC．3’PCR反应体系(20止)： 辽宁师范大学硕士研究生学位论文试剂菌液10×PCRBuffer10mmol／L彻PKV．MM13—47TaqDNA聚合酶灭菌水upto体积1皿2uL1．6uL0．5此0．5儿0．2止20止PCR反应条件：94℃5min麓黧’35CyclesJ72℃lmin30s72℃10min2．2．2．9测序检测将菌液PCR检测为阳性的菌液送上海英骏生物技术有限公司进行测序检测。2．2．3生物信息学分析表2．2生物信息学方法Tab．2．2Bioinformaticsmethods预测功能网址或软件一级结构分析二级结构分析跨膜结构分析信号肽分析结构域分析相似性分析http：／／www．expasy．ch／tools／protparam．htmlhttp：／／bioinf．cs．ucl,ac．uk／psipred／http：／／www．ebs．dtu．dk／serviees／TMHMM-2．0／http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Mega4，DNAman目前，对于动植物中SAMS基因虽然进行了大量研究，但大多是实验性研究，尤其对于葡萄中SAMS基因的研究更是少之又少。因此，为了更准确的了解预测的VvSAMS基因的正确性，以及明确其性质和功能等，本论文对预测的5个葡萄踟。跚^Z9基因进行了初步的生物信息学分析(方法如表2．2所示)。 葡萄．Sm签基因的克隆、原核表达及分析2．3结果2．3．1序列的获得在葡萄基因组数据库(http：／／compbio．dfci．harvard．edu／tgi／cgi-bin／tgi／Blast／index．cgi)中，以S．adenosylmethioninesynthetase为关键字进行搜索，查找出同源的VvSAMS基因的全部EST序列，对这些EST序列进行比对分析，获得高相似性序列，通过Sequencher和DNAman等软件对具有重叠的EST序列进行拼接、延长等操作，将其组合成足够长的EST序列。利用NCBI的ORFFinder(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html)程序对得到的复合EST序列进行ORF预测，筛选掉ORF不完整的序列。最后比对分析以去除重复的SAMS基因，最后得到5个具有完整ORF区和保守结构域的序列。对其中VvSAMSl和VvSAMS3基因进行克隆，并对这5个得到的VvSAMS基因进行初步的生物信息学分析。对得到的5个基因进行编号、命名及定位。原则是通过其在染色体上的位置依次编号。结果显示，VvSAMSl．玩姐^锻箩依次位于第5、6、7、8、14号染色体上(表2．1)。表2．15个VvSAMS基因的定位信息Tab．2．1LocationofthefiveVvSAMSgenes2．3．2葡萄副胳基因的克隆(1)在2．2．1中得到的5个VvSAMS基因，选择其中的VvSAMSl基因和VvSAMS3基因设计引物进行克隆。(2)葡萄总RNA电泳检测图2．1为提取的葡萄总RNA电泳检测图，从电泳图结果看出，电泳条带清楚完整，没有降解，可以用此RNA进行接下来的实验。 辽宁师范大学硕士研究生学位论文28s18s5s图2．1葡萄总RNA电泳检测Fig．2．1EleetrophoresisoftotalRNAfrom所出vfnife厂口leaf(3)PCR扩增将得到的阳‘锐^么S，基因和阳‘鲥^瓠罗基因的序列，提交到NCBI上，查找到完整的ORF，并根据预测的ORF两端序列设计引物。以葡萄叶片的eDNA为模板进行PCR扩增(结果如图2．2)，得到单一条带，且与预测大小相符。将扩增得到的条带切胶回收，纯化后与pMD．19T连接，再转化到E．coliDH50t感受态细胞中，分别进行菌液PCR检测和测序检测，检测结果证实已成功克隆得到VvSAMSI和n^奶^稻罗，并含有完整的ORF序列，ORF序列大小分别为l182bp、1176bp。12M图2．2葡萄SAMS基因的PCR电泳图Fig．2．2ElectrophoresisofPCRproductsofVvSAMSgenesM：DL2000：l：VvSAMSl；2：VvSAMS32．3．3葡萄SA,ffS基因的生物信息学分析2．3．3．1珀侧^舔基因开放阅读框和保守结构域的预测利用NCBI中的ORFfinder和CDD程序进行分析，得到5个VvSAMS基因的ORF序列和结构域预测。分析显示，这5个VvSAMS都具有完整的ORF序列区域，以及SAMS 葡萄．Ⅸ^艿基因的克隆、原核表达及分析典型的保守结构域，即：N端结构域、中间结构域和C端结构域(图2．3所示为VvSAMSl基因ORF序列和保守结构域，其余参见附录3所示)m嘲’s叫．sIIlDeefmlJAesKulti=蛐s二：豪巷蒜餐矗00々=00；矗=；o器00；000嚣矗嚣0丧尊摹鬈毒矗=毒景嚣嚣口矗0毒0芏：亨：F：善￡善VN耋5孽二《：；：鲁誊eo嚣毒謦警：审=0a：管}：：t譬景：：：=：《^々《；毒拳：巷。鼍}餐a巴譬：甚F0嚣；：0：5誊蠢Y二：二20《：每=：：毒：e矗芒t·；譬Ec：o：暑￡c6；o暑5军每=：窜o：：审。每墨霉a：：：早：：0：0F0SX■盖0兰：0毒i：●宰。摹奉《番嚣嚣暮霉0譬；o管=e：；：譬《摹霉毒霉毒；o毒；罩●o毒●●彳：Z：冀j1‘?P喜羔二：基2蚤E盎00毫矗匕它0叁毒圭=：矗0譬^a喜^^羞：：眢：尊0々'警盘喜古毒拳：口00《眷0叁鲁A冀Y；7；x：Y置孓：；最；3{：t=t；霉皇=：=譬：6：：：筝￡o寄}：譬：碍军军：=：亡毒{：寄：巴罨矗：e基：：q：=善f￥善0-fY：≥五0符0i§￡4t。嚣=嚣o：：喜：亡嚣t芒丑：：筝ag=a9-：t盎e霉：《ot晕毒：o=t譬毒oot《鬟譬二V器三￡0_。三零誊：盖0《|：尊口≮霉；尊嚣矗’；霉譬曹0矗嚣拳：口薯0譬蔼蠢拳0霉簪：0；譬最攀《巍譬矗≮々瑶学00学0墨Y托喜M二：Z鼓}羔兰=：二《一《拳#0：§：：＆眚营奄：：e乞；嚣0善葚=：：管：：tt≮譬：：o：嚣誊直巴寄矗譬6：暑：o掌F5YA：：：嚣：}耋：二宰e牮：：gj。二o：o=：：毫9c：e：牮：：：：：g：毫}：eoa簪c艺鼍霉宰：霉c：￡二￡：三蔓了：五：Z二0ii车毒0辱o；；宰l霉’；莓t●謇：毫；譬oil字毒鼍：霉譬0毒00：譬0嚣霉毒；《霉；；写毒窖窑鬟二：￡Y冀￡：：0：0量瓠：竞芒二：00乞眷矗嚣营0髓毫直毒0毒0矗^营：矗尊眷0畚0当畚矗盎嚣矗0等遗0盎毒0密a巴口盛5F嚣；慕：Y：■ZY葛婶叠嚣芒§≤霉口：罩eo&霉群：t：：扛_墨：o：譬c蕾：盘：to矗：匕嚣：#ct：o：t：c：ec：；矗赢譬#：iV篡：￥：嚣：’0：：t《；≈铺#t错t霹鼍ot虿：c暑o￡毒t：靠to譬暑簪ot暑瞽：誊苷o：譬蠢暑o：盅0翌0￡：V：譬01：矗0：’{辱^毒巷誊蕾《0拳：筝；盎曩00每叠§00：譬：喜毒0；嚣0：j鼬簪盎毒拳=●00弓■霉毒0Z芏冀V：Z}V：#兰篓譬：’童二；e肇^8喀童搴荨基专c芝乞亡：t二=巴乞tt：_：：盎￡：巴謇蕾：o巷々=鲁=餐专誊e々々￡嚣T：F葛：XF毒；荔#Y：：3岳荦写t譬譬鼋：：：：e：；；：罩t：等：：管；：=：￡o：：；帑#：季：＆a；￡：：o：：0￡筹喜0矗S二：0；美二：gS：毒：；；t：§；：；io篁霉：叠军：：；霉《；：管0：毒#：譬譬；霉譬．：-9@'-9；o；；o：嚣：?_耋鲁麓鉴五蔓尝§盖箩量i￡：0=0巷口氛盎丧誊蒜e}00嚣皇0暑毒蠢冉0：=拳董二善誊譬毒誊各盆嘧袅备譬々：鲁嚣墨；05S敬嚣F：K譬·0嚣鼻X：喜4：譬乞0毒嚣譬oe∞o皇謇=矗矗e譬邑；oa0々夺毫#餐：c8§#《s鞴=鼍富夺o℃e钟?章鑫赢氛蔓S：T氧芽；：矗莓：：二毒t书9：霉：B：o署：鼋：t譬掌：譬￡：：：E：譬：：丑：：g胃2譬：霉：：-_9,sto，：o蓑：筝0V三Y量：善Y摹!誊：：毒：；=；珏0冉嚣；i；；嚣《；堪；摹0童C0‘t；暂；；嚣0；0《摹毒曩孽嚣；宰0：0G●0二暑Y}Y0：Y0：毒笺：警0三二：Ea备0誊毒奄矗：董0芑=：基t牮基巴：蔷巴0矗t口巷§宝§&0t芒：盘矗0：=06宅；芒co茸薹：嚣：Y嚣三XF≥}蓑#：：耋：霉写审“：”薯：：乞o=量：c薯tc：：：鼋&c：：o点基《_巴鼋霉霉每：≮筝：e恿：0譬：3：SI：；二-0：Z最0譬0：；每毒囊譬《：：o：；零囊耄留氛0：霉晕：90：=鼍：餐霉譬t：纛e==J：謇《o嚣窜毫譬囊暑9毒霉釜要二譬警五A譬§美雾0黧刍0：2埠：尝00誊矗=0=嚣蒜0惫嚣拳盘警最口誊=窖《暑矗毒基譬。等0嚣墨拳巷矗巷嚣奄苷《毒罨矗考拳F叠Fi簿￡VYX}：笺讶芭基：i：毒e：鼙：t矗霉：窜：女盎二二蚤4：^“PIj髓m陪∞nsen昭d抛m酏惦脚ebe∞舶协cled。click硼搬eima驰beIowIof凼潮枷限刚阪30035O3。311图2．3VvSAMSl蛋白ORF区及保守结构域Fig．2．3Theopenreadingframe(ORF)andconserveddomainofVvSAMSlgene2．3．3．2预测的珀^翻^舔的理化性质分析16 辽宁师范大学硕士研究生学位论文利用在线网站(http：／／www．expasy．ch／tools／protparam．html)对得到的5个VvSAMS的核酸和氨基酸序列进行理化性质分析(包括ORF长度、编码氨基酸个数、氨基酸分子量、理论等电点等)，这对于我们了解葡萄SAMS的功能有很大帮助。分析结果表明：5个VvSAMS基因的ORF长度在1170bp．1185bp之间；终止密码子均为TAA：预测的VvSAMS蛋白的分子量在42、43kDa左右；理论等电点均在5、6左右，呈偏酸性；从基因的不稳定系数看，5个VvSAMS蛋白均为稳定蛋白(结果见表2．3)。表2．3VvSAMS的核酸和氨基酸序列组成以及其理化性质Tab．2．3ComposedofnucleicacidandaminoacidsequencesofVvSAMSsandtheircharacterofphysicalandchemical2．3．3．3VvSAMS蛋白二级结构的预测通过PSIpred服务器预测这5个VvSAMS蛋白的二级结构，该服务器是通过严格交叉验证预测的，预测结果准确率高达80％(结果见表2．4)。结果显示，在5个VvSAMS蛋白的二级结构中，0【螺旋和随机卷曲是其主要组成部分，而且同一结构在不同基因中所占百分比非常相近。由此，我们可以推断VvSAMS蛋白的二级结构是比较保守的。表2．4VvSAMS蛋0--级结构分析Tab．2．4TheanalysisofsecondarystructureofVvSAMSprotein2．3，3，4VvSAMS蛋自信号肽和跨膜结构域预测及分析利用SignalP(http：／／www．cbs．dm．dk／services／SignalP／)140]和]qVlHMMserver17 葡萄黝^艿基因的克隆、原核表达及分析(http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM-2．0／)‘411在线程序分别对5个VvSAMS蛋白进行信号肽和跨膜结构域预测。预测结果显示，该蛋白中不存在信号肽序列(如图2．4所示为VvSAMSl蛋白信号肽预测分析结果图，其余见附录4)和跨膜结构域(如图2．5所示为VvSAMSl蛋白的跨膜结构预测分析结果图，其余见附录4)。这表明VvSAMS蛋白不是分泌蛋白，也不是膜蛋白，它在细胞中合成，直接在细胞质内发挥作用。图2．4VvSAMSl蛋白的信号肽预测分析Fig．2．4Thes咖alpepfidepredictionofVvSAMS1protein图2．5VvSAMSl蛋白的跨膜结构域的预测分析Fig．2．5ThetransmembranedomainpredictionofVvSAMSlprotein2．3．3．5葡萄．渊基因与拟南芥．翻^舔基因相似性分析^兰吾DoJa 辽宁师范大学硕士研究生学位论文拟南芥是一种模式植物，所以研究者对它的研究比较深入。更有研究表明，基因在进化关系上比较相近，则其在结构功能上也会存在一定的相似性。因此，本研究选择拟南芥．劝^舔基因与得到的5个n^翱^裙基因进行相似性分析。所以研究葡萄与拟南芥SAMS基因的相似性关系，这对于我们进一步研究葡萄中SAMS基因的结构功能等具有重要参考作用。拟南芥SAMS基因序列是从NCBI(h位p：／／www．nebi．nlm．nih．gov／)中查找获得的，其序列登录号分别是4幽n绷(NM179246)、AtSAMS2(NM116415)、AtSAMS3(NM001124986)和彳毛5：。4^么舛(NM112618)。将其与预测的5个VvSAMS基因的氨基酸序列，利用MEGA4软件(采用NJ法)进行相似性分析，构建进化树(图2．6)。分析结果显示：VvSAMSl、VvSAMS3、VvSAMS5和AtSAMSl、AtSAMS2、AtSAMS4相似性比较高，VvSAMS2、VvSAMS4和AtSAMS3相似性比较高。卜———————————叫0．1图2．6葡萄SAMS基因与拟南芥的相似性关系Fig．2．6ThesimilarityrelationshipbetweenVvSAMSandAtSAMS2。4讨论从葡萄叶片中提取高质量的总RNA是非常困难的。这主要是由于葡萄组织中含有大量的多糖和酚类，实验研究表明利用Trizol法很难从葡萄叶片中提取葡萄总RNA。所以常用的提取葡萄总RNA的方法有CTAB法、SDS法、改良的SDS法和热酚法等。本实验采用的方法是改良的sDs法【421提取葡萄总RNA，SDSn-T以使核酸复合物与蛋白、多糖、色素和多酚化合物等物质分离【431。此外，p．巯基乙醇不但能抑制RNase活性也能防止酚 葡萄SAM5'基因的克隆、原核表达及分析类被氧化【删；PVP作为螯合剂可与酚类化合物形成螯合物，这样就可以抑制它们被氧化，并在之后的抽提过程中这些螯合物可以被去除1451。此种方法简单易操作，且费用较低，缺点是该方法易提出基因组DNA，所以提取RNA后一般需要对RNA进行纯化。本研究利用NCBI的ORFfinder和CDD程序对得到的5个阮‘翱^舔基因的ORF和结构域进行预测分析；同时对其核苷酸和氨基酸序列进行了理化性质分析；还对其蛋白进行了信号肽、跨膜结构域分析，从分析我们推测出，VvSAMS蛋白不是分泌蛋白，也不是膜蛋白；还对5个VvSAMS蛋白进行了二级结构分析，发现a螺旋和随机卷曲是其二级结构的主要组成部分；与拟南芥燃基因相似性分析发现，VvSAMSl、VvSAMS3、VvSAMS5和AtSAMSl、AtSAMS2、AtSAMS4相似性比较高，VvSAMS2、VvSAMS4和AtSAMS3相似性比较高。此外，根据得到的珀硼栅基因序列设计特异性引物，成功克隆得到了含有完整ORF区的n^翱^ZS』基因和踟&眦站基因。这对于我们继续研究欧洲葡萄IS舭S基因的功能具有重要理论和实际意义。20 辽宁师范大学硕士研究生学位论文3葡萄副肟基因在不同胁迫下的实时定量表达研究3．1材料处理(I)SA处理：常温下，在第一株葡萄上，选择5片叶子，其中4片涂抹2mMSA溶液，处理Oh、1h、2h、8h和12h依次取样、编号，在液氮中研磨，分装，于．80。C冰箱中保存备用。(2)MeJA处理：常温下，在第二株葡萄上，选择5片叶子，其中4片涂抹lmMMeJA溶液，处理oh、1h、2h、8h和12h依次取样、编号，在液氮中研磨，分装，于．80。C冰箱中保存备用。(3)伤害处理：常温下，在第三株葡萄上，选择6片叶子，其中5片创伤处理，处理Oh、30min、lh、2h、8h和12h依次取样、编号，在液氮中研磨，分装，于．80。C冰箱中保存。3．2RNA的提取、纯化及eDNA的合成方法同2．2．2．1、2．2．2．2和2．2．2．3。3．3引物设计在VvSAMSl基因ORF内设计一对特异性引物，并以葡萄Actin基因作为内参，引物序列为：引物名称引物序列Actin．F5。一TGGAAGGTGCTGAC_WⅪATGC．3’Actin-R5'-GCACTTGCTCCCAGCA(；CAT．3’VvSAMS1一F5’．TCCCCGACAGGGAGATACTCA．3’VvSAMS1一R5’—．TCTCTGCCAAAGTGCCCATAA．3’3．4实时荧光定量PeR(1)PCR反应体系：试剂体积cDNAl皿2×TransStart*MGreenqPCRSuperMix101xL引物F0．59L引物R0．5rtL灭菌水upto20rtL(2)反应条件：21 葡萄SAMS基因的克隆、原核表达及分析95℃30s95℃5s、40Cycles60℃30s-J95℃15一s60"C30s95℃15s。在不同胁迫(SA胁迫、Me3A胁迫和伤害处理)诱导下，采用2’△AcT方法【锎计算相对表达量；3．5结果3．5．1葡萄RNA电泳检测28s18s5s图3．1葡萄总RNA电泳检测Fig．3．1EleclrophoresisoftotalRNAfrom所如viniferaleaf图3．1为提取的葡萄总RNA电泳检测，从电泳图结果看出，电泳条带清楚完整，没有降解，可以用此RNA进行接下的实验。3．5．2实时荧光定量PCR葡萄叶片经过SA、MeJA和伤害处理后，VvSAMSJ，基因表达量发生了不同程度的变化(图3．2)。实时荧光定量PCR结果显示：在受到SA胁迫时(图3．2A)，VvSAMSl基因表达量为先上升后下降的趋势，在2h时表达量最大，大概是原来的5倍左右，随后迅速下降；在受到MeJA胁迫时(图3．2B)，VgSAMSl基因表达量先是逐渐上升，随后又逐渐下降，在2h时表达量最大，大概是原来的4倍左右；在受到机械伤害时(图 辽宁师范大学硕士研究生学位论文3．2C)，VvSAMSl基因表达量迅速上升，在30min时即达到最大值，是原来的10倍左右，随后迅速下降，直到最后恢复至正常水平。Time[h)ABC图3．2VvSAMSl基因在处理后的表达量变化A：SA胁迫；B：MeJA胁迫；C：伤害处理Fig．3．2TheexpressionofVvSAMSlaftertreatmentsA：SAstress；B：MeJAstress；C：mechanicaldamage3．6讨论本实验克隆得到了VvSAMSl基因，在SA、MeJA和伤害胁迫处理下，其表达量都发生了不同程度的变化：SA、MeJA胁迫处理后，VvSAMSl基因表达量在2h达到了最大值，其表达量都呈现先上升后下降的趋势；在伤害胁迫处理后，踟鲥比S』基因表达量在30min时就迅速达到了最大值，随后又恢复至原有水平，其表达量也呈现先上升后下降的趋势。这些数据证明了植物在遭受逆境胁迫时，SAMS基因参与逆境胁迫响应途径，通过该基因在植物中的相对表达量的改变来调节逆境胁迫对植物的损伤，所以，在植物响应逆境胁迫过程中，SAMS基因可能发挥了重要作用。关于渊基因参与胁迫响应 葡萄|5m签基因的克隆、原核表达及分析途径，本实验进行了初步研究，对于今后更进一步的研究葡萄中SAMS基因的功能等具有重要的理论和实际意义。24 辽宁师范大学硕士研究生学位论文4葡萄,．cAMS基因的原核表达4．1实验材料、试剂及溶液的配制4．1．1实验材料和试剂E．coliBL21：为本实验室保存原菌；pET28a表达载体：为本实验室保存质粒；实验中所用引物：由上海Invitrogen公司合成；限制性内切酶(BamHI和EcoRI)：购自TaKaRa；T4DNA连接酶：购自TaKaRa。4．1。2溶液的配制(1)1．5MTris-HCl(pH8．8)：称取Tris18．159，加入无菌水50mL，用浓HCI调节pH值到8．8，再加无菌水定容至lOOmL。(2)1MTris．HCI(pH6．8)：称取Tris12．19，加入无菌水50mL，用浓HCl调节pH值到6．8，再加无菌水定容至100mL。(3)lO％(w／v)SDS：称取SDSlOg，用无菌水定容至lOOmL。(4)2×SDS-PAGE上样buffer：Tris-HCl(pH6．8)90mmol／L，甘油20％(v／v)，SDS2％(w／v)，溴酚蓝O．02％(w／v)，DTT100mmol／L。(5)10％过硫酸铵(APs)：量取过硫酸铵o．59，加ddH20定容至5mL，贮存于4"C。(6)5×电泳缓冲液：在三角瓶中加入Tris15．19、甘氨酸949、SDS59，然后加ddH20定容到1L，室温保存。(7)染色液：在棕色广口瓶中依次加入以下组分：冰醋酸92mL、甲醇450mL、考马斯亮蓝0．59、ddH20450mL，混匀溶解，滤纸过滤，4"C冰箱中保存备用。(8)脱色液：甲醇、冰乙酸和去离子水，按3：1：6比例混合配制。4．2实验方法4．2．1目的基因的获得(1)在已经克隆得到的VvSAMSl基因的ORF序列两端设计一对引物，根据对VvSAMSl的ORF序列的分析，表达载体pET28a具有酶切位点EcoRI和BamHI，而目的基因中不含有这两个酶切位点。所以选择在其上下游分别引入EcoRI和BamHI酶切位点序列。则设计的引物序列为：25 葡萄SAMS'基因的克隆、原核表达及分析VvSAMSl-ORF’oF：5’．C哑丛!!￡ATGGAGACCTTCCTATTCACC．3。(划线部分为互2DRI酶切位点)vvSAMS1-ORF-R：5‘一CG至趋丛堡￡TTACGCTTGCGTCTTCTCC一3’(划线部分为BamHI酶切位点)(2)PCR扩增，获得带有酶切位点的目的基因。PCR反应体系(20止)：试剂体积cDNA质粒模板0．2止10xPCRBuffer29L10mmol／LdNTP1．69L引物．F0．411L引物-R0．49LTaqDNA聚合酶0．29L灭菌水upto20止PCR反应条件：94℃5min94℃30s]57℃30s}35CvcYlesj72℃lmin30s72℃10min4．2。2重组表达载体的构建(1)用BamHI和EcoRI这两个限制性内切酶对pET28a进行双酶切，酶切产物进行电泳、切胶、回收纯化大片段，方法同2．2．2．5。(2)目的基因与pMD．19T连接转化后提质粒，将目的片段用BamHI和EcoRI这两个限制性内切酶进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，利用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收纯化。与pUD一19TVector连接转化方法见2．2．2．6和2．2．2．7，质粒提取方法如下：①取1-2mL过夜培养的菌液，4。C，12000rpm离心2min。②弃上清，沉淀菌体重悬于1509L冰预冷的SI(25mMTris-HCl，10mMEDTA，50mM葡萄糖，pH8．O)中，剧烈振荡，使菌体与SI充分混匀。③加3009L现配制的SII(o．2MNaOH和I％SDS按l：l比例混合)，反复颠倒5次，充分混匀，冰上5min。 辽宁师范大学硕士研究生学位论文④加300此冰预冷的SIII(5MKAc，60mL；冰乙酸，11．5mL；水，28．5mL)，上下颠倒5次，混匀，冰上静置5min。⑤4℃，12000rpm离心5min，转上清液到一新EP管中。⑥加入等体积氯仿，剧烈振荡5min混匀。⑦重复步骤⑤，室温，加等体积异丙醇，沉淀DNA，慢慢的颠倒EP管5-6次，使之混匀，室温，静置10min。⑧20oc，12000rpm离心5min，弃上清，除净残余液体。⑨用lmL75％乙醇洗涤沉淀2次。⑩重复步骤⑨，室温静置5min，使沉淀晾干。口用20止含有RNase的ddH20溶解沉淀，．20。C保存备用。(3)酶切体系(201xL)：试剂体积BamHI1此EcoRI11．tL10xK2此H2011皿目的基因／pET28a59L终体积201．tL在37。C酶切3h，将酶切产物进行电泳，并进行回收纯化(方法同2．2．3．5)。(4)将目的基因和表达载体(pET28a)相连接连接反应体系(10止)：试剂体积pET28a表达载体l止目的基因71．tLT4DNA连接酶lgL10x连接Buffer11．tL终体积10止反应条件：16。C连接过夜。(5)连接产物转化(方法同2．2．3．4)先转化大肠杆菌DH5a，并用Kan作抗性进行筛选：挑取单菌落做PCR检测；摇菌提质粒，做双酶切检测；将检测正确的质粒转化到表达宿主菌BL21中。27 葡萄SA345'基因的克隆、原核表达及分析4．2．3诱导表达(1)挑取单菌落，接种到含有5mLLB液体培养基(Kan抗性)的大EP管中，37"C、150rpm过夜摇菌。(2)按1：100接菌，37。C、150rpm继续振荡培养，至09600=0．6时为止。(3)以未诱导的菌液lmL作为对照组；实验组中加入IPTG，至终浓度为lmM。37。C、150rpm，继续振荡培养4h，取样(1mL)。(4)20。C，12000rpm离心2min，收集菌体，用1001．tLSDS将菌体吹打混匀，沸水浴至少5min。(5)20℃，12000rpm离心lmin，吸取上清，SDS-PAGE电泳分析检测。4．2．4SDS-PAGE电泳检测聚丙烯酰胺凝胶的配制：(1)分离胶按以下组分配制(12％)：试剂体积H203，3mL、30％Acrylamide4．0mL1．5MTris-HCl(pH8．8)2．5mL10％SDS100止10％过硫酸铵100皿TEMED4止将上述试剂充分混匀，灌制分离胶，进行水封。(2)浓缩胶按以下组分配制(5％)：试剂体积H203．4mL30％Acrylamide830pL1．0MTris-HCl(pH6．8)6301aL10％SDS50此10％过硫酸铵50此TEMED5止分离胶胶凝后，将分离胶上的水尽量全部除去，灌制浓缩胶，插入梳子。+(3)待胶凝后，拔出梳子，在电泳槽中加入1×Tfis～Gly电泳缓冲液，接通电源进行电泳，溴酚蓝指示条带到分离胶最底部时，断电，停止电泳。(4)染色：胶剥，将胶放入染色液中染色过夜。 辽宁师范大学硕士研究生学位论文(5)脱色：先用ddH20冲净凝胶上的残留染色液，放入装有脱色液(脱色液必须能够将凝胶全部覆盖)的培养皿中，轻摇脱色，至蛋白带清晰时即可。4．3结果4．3．1重组质粒的构建PCR扩增得到一条长度为1182bp的目的基因片段(图4．1)；目的基因与双酶切的pET28a连接后进行双酶切检测，其结果如图4．2所示，证实含有目的条带，大小为1182bp。1M图4．1VvSAMSl的PCR扩增产物Fig．4．1TheproductofVvSAMS1geneM：Trans2K■PlusDNAMarkerI：VvSAMSlM12图4．2双酶切鉴定M：Trans2K■PlusDNAMarker1：未酶切的pET28a2-重组质粒的双酶切Fig．4．2dualenzymedigestionM：Trans2∥PlusDNAMarkerI-pET28a2：Recombinantplasmiddualenzyme4．3．2SDS-PAGE电泳检测29 葡萄SA／9艿基因的克隆、原核表达及分析M1234567图4．3SDS．PAGE电泳检测图M：蛋白分子量标准一低l：诱导的空载pET28a2-7：重组质粒的诱导表达Fig．4．3SDS-PAGEeleclrophoresisdetectionM：Lowmoleeularweightproteinmarkerl：InducedemptyvectorofpET28a2—7：Inducedexpressionoftherecombinantplasmid取鉴定正确的含有重组子的菌液，37℃、150rpm，振荡培养至OD,oo=0．6时，加入IPTG至终浓度为lmmol／L，在37℃继续振荡培养4h，进行SDS-PAGE电泳，在43kDa处有一条明显的表达带，其大小与理论值相符(图4．3)，表明VvSAMSl基因已经实现异源表达。4．4讨论本论文选择的表达载体是pET28a。它有以下特征：(1)该表达载体含有T7启动子和终止子、lacoperator；(2)包含有His标签，可以使用Ni柱进行纯化；(3)其抗性为Kan抗性；(4)带有多克隆酶切位点。¨^朗^舔，基因的ORF序列中不含有EcoRI和BamHI这两个酶切位点，所以在引物上下游分别引入这两个酶切位点。经电泳检测得到的目的基因与预测大小相符。用＆DRI和BamHI这两个限制性内切酶分别对目的基因和pET28a表达载体进行双酶切，利用T4DNA连接酶将得到的两个大片段相连接。经双酶切鉴定证明已经成功构建了VvSAMSl原核表达载体，SDS．PAGE电泳结果初步证实重组蛋白得到了表达。诱导重组蛋白表达的过程中，对诱导条件(主要包括时间、温度以及IPTG浓度)进行了优化。实验分析显示IPTG浓度和温度对蛋白表达量的影响并不大，粗略分析当IPTG浓度为lmM、温度为37℃时，表达量相对最大，所以选择诱导蛋白表达的IPTG的终浓度是lmM、诱导温度在37℃；重组蛋白表达量随着时间的不断延长而不断增加，但当到达4h时，基本处于一个稳定状态，所以，最后选择诱导的时间是4h。243Ol3卯酌舭”加H 辽宁师范大学硕士研究生学位论文一一—————————————————————————————————————————————————————————一优化结果表明，在优化的诱导条件下，诱导重组蛋白表达，进行SDS·PAGE电泳分析检测，重组蛋白得到了表达，这为。锯拢S基因表达的蛋白功能的深入研究打下了坚实基础。 葡萄．Sm舔基因的克隆、原核表达及分析5结论根据实验研究结果，得出了以下结论：1．对葡萄基因组数据库进行检索分析，最后得到了5个具有完整ORF区和保守结构域的葡萄SAMS基因。并对5个VvSAMS基因的核酸和氨基酸进行了初步的生物信息学分析：对相关的理化性质进行分析；二级结构分析结果显示5个VvSAMS蛋白二级结构主要是由a螺旋和随机卷曲组成，并且同一结构在不同基因中所占比例非常相近；信号肽和跨膜结构域分析发现它们都不存在信号肽序列和跨膜结构域，都不是分泌蛋白，也不是膜蛋白；相似性分析发现，VvSAMSl、VvS√蝴S3、VvSAMS5和AtSAMSl、AtSAMS2、AtSAMS4相似性比较高，VvSAMS2、VvSAMS4和AtSAMS3相似性比较高，有研究表明进化关系相近则其结构和功能等也可能较相似，因此，这对于研究葡萄SAMS基因的结构以及功能等方面的研究具有重要作用。2．以欧洲葡萄为实验材料，克隆得到两个含有完整开放阅读框的VvSAMSl基因和VvSAMS3基因，这为继续研究这两个基因功能等做好了充分准备。3．利用实时荧光定量PCR的方法，对VvSAMSl基因在遭受逆境胁迫处理下的表达量进行了分析。分析结果显示，在受到SA、MeJA和伤害胁迫处理下，其表达量都发生了不同程度的变化，其表达量呈先上升后下降的趋势，但在不同胁迫处理条件下，其在表达量的变化上也有所不同。实验结果表明阴^蜘^ZS，基因参与植物逆境胁迫响应途径。4．成功构建了盹姐MS，的原核表达载体，并将重组子转入到大肠杆菌BL21中，经IPTG对重组子进行诱导表达，通过SDS．PAGE电泳鉴定已实现异源表达，这为深入研究葡萄黝^豁基因的性质以及功能等方面奠定了坚实的基础。 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葡萄5m舔基因的克隆、原核表达及分析Query∞q．supett砒Ltes№lti-d嘶ains附录CVvSAMS家族成员ORF及保守结构域的预测主《．囊蒜鑫掌：譬．《矗；鑫0=‘；；：；0≮；0墨00；嚣00矗罨；00000矗巷；：V叠：F：f：兰￡差Y冀⋯二霉尊毫。拳专：羞：：0：Ce：蠹＆掌：：：ti：罾§：：毒e窑：：=o告霉毒：口：：毒乞：墓；嚣}嚣；嚣器0■菩嚣矗：：：甚：：a霉§：霉o：o譬：：：霉1；_to：t8譬^o：：2车甚oj节：E矗4军2：譬嚣：雩芑：e盖：二￡0F三耋Z?置：：辱二譬●苷■嚣曩；尊；●#o霉薯#40毒矗l：。’g；=#；0；；；晕j器霉●譬●；嚣￡：=Z：冀擎：?堂皇翌：：0寄矗嚣0矗0僦蠡巷寄0：鱼矗盎毒薯聋a矗0乏茏0盏袁0羞矗拳丧篆：誊鲁0嚣《0嚣蠢=盎00：Z五嚣VXY三Z：Y蒜0：：S：：筝：t霉量誊；：§：：管；at：=：譬：e=：t《：：嚣：∞霉譬管：：乞o；¨譬o=0囊3：；F节SX0■§：0五：挚螽譬誊：囊t=工譬otti譬：o：：：管：：矗t：t：：窜鼍o：毒t毒蠢霉矗誊霉#：：譬量：0冀0塞￥：．节譬：芝Q巷耋鍪2善嘎：薯：c嚣嚣眷0iIW苷善誊=t0最堂《荽00矗0000辛00鼻藏矗毒^荽0嚣：口●譬眷毒譬：五：Y冀：冀：苌嚣}=!曼Et皂：省肇点毒。艺巷蕾t等eo：t6管；：：^：。’。七}0苷青^巴羞巴莓：0＆潍尊舂芒：；赢；D0§嚣}5Y童：≥专3二霉毒基量嚣；誊：t霉t霉：：筝：：：：：6：：：矗20：羞：争：：：：：霉=：jo=0《艺：PE：f二：蔓了：孟：曼《一岳=：乙誉霉毒菩0潞l●0：0_暮：：￡l毒∞g尊寄萃曩毒晕矗毒：簖；誊嚣童：#0000：耋AZ二l：￡V羔冀：{§：拿暑0三巴岱掌0名壮睿皇∞：謇矗嚣誊嚣0毒^罄毒00怂盎毒摹尊焉0：岱嚣嚣辱基基二喜0∞青麓：嚣乎嚣0算了0Y：Y薯￥黛§篆《t羞：；盘{善军霉=譬尊矗誊c：二⋯：譬：：：：o量鲁：e膏eF：：=矗；§：：0乞；c：o算E03五■}：；'‘．篡：Y：垂：二害：：：￡基基ot：蠹t：t：；A：《&6a：：霉巴：基：＆e^：霉&霉￡矗霉t：怠霉c：Y耋：0篡0￡：V：譬竺鑫：五￡摹《磊‘譬巷磊嚣0≮矗矗蠢《《嚣口鲁蕞=譬：譬每：嚣毒蠢霉4擘台t《=嚣●0；嚣嚣毒嚣棠々0毒嚣Z艺二蔓!篡警：兰善譬：芋#0’0二：皇：：：骺盎：聋皇：：t謇基誊：童：：：：：_：童0：备；a矗誊o：菩毒毒宣掌蕾t誊譬苷鲁Y：器0：了：FX：Xf毒嚣’毫萎：：=譬：：蠹：t窄簪：嚣霉每：o：：t：9每霉带悬c窜：鑫雩譬霉：：：盎毒基晕尊避昔j霉譬善Y：0P篡§叠A0=：墨矗’辱；i{譬a：^蔗：毒t：：零摹0蕾：：：lo拳茗09誊嚣=筝；《暑：0{：嚣尊：霉譬；拿《≮蔓：0：r毒转喜盖基奎010巷誊瑶孓霉0甚：；掌=00毒譬0龟盎0窖矗：000蛊奇譬喜&譬口0巷奄毫暑端0盘誊：盏督0莲二f5；#叠}：篡Y0嚣5苎耋二；c基=o：苎：t《：：基尊蕾：＆W：：口：e矗喜嚣基拳：譬：0叠：≮管：：：∞0营=^翠：Y置0AZ5■7轰毒；鍪：善o：=；ooo《：=9c：譬o§=：室：e：t#筝巴：：：：：§：晕：：5t：簪≯：譬：芑二五【置量：?0譬墨Y五：鑫Y争9：00毒餐臻毒00葛；；譬；辱；管；譬；；；《；譬餐矗0毒盘；=毒0舞毒囊器嚣器霉聋霉●毒嚣芒兰}：SV芋970=譬嚣：S兰：：二《矗乞=o嚣0等盎：蠹^搴宣盎：童：o：：寄《：：：擘。毫}=点矗：a鱼：盎毫0：t：0喜：：F≥Z0；；’；：#F-爷}0二≥雹二：t：E霉争：：矗争霉≯!～薹：：t：￡基：0a暑：：=：≯=：o=莓6嚣霉}争t每辱a!誊#；：S：X三0：菱iS；：0《霉鼋。毒毒拳蔫=；毒霉霉：；o霉2霉毒；g鑫o：譬：：霉霉g：a：留鼋毒oa；：：霉字鼋霉三冀}≥}：薰：五夤X喜簦堂皇二二搴：00乏0蠡0；袅0006：邑：：0：：0：：：00是畚毒0二0：：6a警e鑫誊0：0矗a0R0叠}0亨三w=：?冀主：嚣：二§《oct誊6尊04譬；：o：e＆二童i0摹￡嚣蠢”Putativeconserveddomainshavebeendelected,dickontheimagebelowfordetaledresults．C塑鲤妄墅堕．垂匦贬j附3．1VvSAMS2蛋白ORF区及保守结构域 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辽宁师范大学硕士研究生学位论文Query9明．Sul地rfaaLHesHulti-d∞alns一’‘。。嚣毫备毫誊譬善嚣0譬t羞嚣；鲁蠡眷嚣；盘0霉a誊；o暑譬；霉誊毒眷馨量熏聋嘻毒0毒害0：．1r"：f：罩誊；Y》暮摹冀二：2：性簪t：矗点膏：t每：牵：譬盘：：矗筝tt毫：c0霉毒暑餐，-嚣抟霉ot：警at辱o：f0嚣：0≥0：j誊五Y：0五：毫?：窖00：；霉毒■0毒垂譬摹：0c；霉●搴晕拿等t，■量霉：：窑∞；·篁；鼋-量●：0：：譬0￡二￡备奎#参耋鼓Y二‘：芑：2二：矗00矗喜霉考00矗基0：t誊拳暑含，矗t鲁：I}拳嘻矗0{§兰暑0墨o：矗譬0矗·I鱼：嚣：嚣：了：Fi喜：#0墨4筝c：j矗=：t暑蔫毫：：点=簪j譬6·&霉jt=晕t彳eq气霉基=ec基：I≯：：茹霉蹿i篝二誊警E嚣：Y塞拳：器五；蠡；譬；；霉I抟；；；霉。嚣；％霉毒纛喜●；霉≮罾鼋譬零嚣t；霉毒；霉牵0馨●0毒●毒；g嚣¨耋堂V誊芝耋V3∑参量垫拦0Se’盏童直0t鲁0t誊鑫薯等鸯矗等叁誊蕾蔷矗童盏童眷0·矗毒矗譬喜善拳=拳毒：矗t暑掌营鲁0矗鼍Z?：?嚣：￡0i擎0：矗0毒喜：霉目一：譬t=oao霉尊co矗：：t=e：：t矗彳_I≯：o‘戈霉矗嚣霉e霉etc霉雩t霉o：0Y基0毫二：基事}￡：奎；‘{51晕口；巷‘0母●霉譬铽霉毒；一．；；；霉口0；毒；0J。；叠每；；毒；霉毒蠢量00c毒；瘩0吝基!鑫鼍二：当芝：荽{苎0誊6掌搴：簟，。嚣。拳尝t譬^譬00也芒尊嚣摹0鼍暑尊滟惫∞^皇筝誊毫}尊窖嚣#00乏：。雾：善最．；-：盖：嚣：墨i誊：1o守：：：霉ec：譬矗量霉t：：帮o^·B絮a毒：孽譬：300：劈警e盎：：锯：：警≈譬t羲：￡¨冀鬟嚣S：0喜鞴：蓉e—ic毒00●；霉《0鑫●譬羹霉0窑●蠢奋≮掌●0；霉w霉毒曩；●；：；0蠢●0#●00毒；挈毒§鼓：0¨：Y芝?}秘喜M∈二”《譬暑霉e基·j；霉乞摹0亡aet：0鼙巴譬t：篁毒06鹄簪t薯拳：：盘t巴：o：j：0鑫五■霉：募?嚣：Y：善：喜毒：0硝c量=早基=霉矗鼻≈氍馨t：0嚣ta：霉tc譬矗霉et：譬c：搴o：譬a：0t：岔曼嚣￡=V：珏盆￡：盖五譬二’棼’曩毒寄0●管0毒；鑫t0蠢；0毫●拳0嚣0●：0霉‘0窑00嚣番霉蠢矗霉；≮00。；《瑶曩；拱芏冀譬：款荽：¨誊￡嚣r：0’叁0肇a尊^基基t00毒to等t00基：ot：5蠢oo髓等等0餐譬oo譬薯皇乞皂掌々芒at等￡萎：}妻：茸暮S鑫雾亨?：’警’孽弘譬崤渔oo=o矗：霉宁：霉^：譬。l譬g=ot；to：《弘。孽：t毒ttt：eto墨0#基鑫0盖S二：耋最装：妻毒i誊；互0●00蒋：毒：譬鼙蠹0C：；口嚣0《蠢霉e00毒0牮《謇0《；巷口乏0c0：t0：Y茎S嚣3二跫善S3；f￡￡’：∞譬％基t管霉矗：oooe口：56萱鼙々彳霉毒；叁擘富誊壮留譬基鼙亡t：基：at暑5毒襄蚤霉：嚣Y0囊毒3五了：争三：尊：=章譬霉g毒譬譬∞霉量：t毒管6弘tt=霉：=謦e：t1器蘩g譬ot；霉coo口：节釜盖鹫羞：V盖篓警二盖象莹一1苦锚：《0誊嚣；0薯誊嚣巷霉尊：0乙o^：矗0嚣嚣矗t0嚣鼙；尊e誊皇000毒基0芒毒毒￡：譬0Y5￥五：嚣Y手￡f：耋：皇：：基：f：叠tt：t：鼙t=霉嚣：3％：基；霉c=e∞譬譬毒6—＆每tt=：：t霉e：：S?}●0：了五：§嚣：}0：≥蒜’o●；譬4譬t：：o：：4毒譬iz；荦：膏t^●鲁^摹i孽：：：：譬毒：：‘：i譬-oo：鬟!：嚣二譬翌￡S}》!采#二二二2霉喀蠹?。盘乏拳霉：∞蠢己：矗a00t90aC0乞0矗矗誊毒10霉0e00毫0矗矗00e0；、’：；：描：叠：嚣；每蒋摹：：墨，i‘辩：：o々t苷￡基霉tt：直誊c：霉c^：基嚣譬—孽毫#基：：t誊霉鼋基。弘孽矗。譬a：采}：嚣：置五苫S嚣}§蠢》蚤：王予毒#搴嚣簪毒0：≮；毒∞：，潞警●毫孽t：窜：霉鼍毒霉0镰窑t；摹摹；孽拳誊謦毒掌藉毒譬#警!：霹￡V鼓荽二裴矗￡鬟：2每’奄1：_00矗量0喜誊：毒靠：2暑：二0呈”R船蜘洲抟帅棚翻喇瞻蛔始翮翻ect峨cI}ck硼船I釉错堋删骱锺嘲姗悖s删陵两酾五面面葡丽可鲫日05B390附3．1VvSAMS5蛋白ORF区及保守结构域41 葡萄姒^艿基因的克隆、原核表达及分析附录DVvSAMS家族成员蛋白的信号肽和跨膜结构域预测120,2F●■lti*附4．1VvSAMS2蛋白的信号肽预测50'aO1502∞250,3003翻tra,q蝴'rlixane，—·—-·-—-——，nside—-----—一附4．2VvS√～MS2蛋白的跨膜结构域预测420啦Slg卺～～●k々茄854O0O参一五田丘oJd 辽宁师范大学硕士研究生学位论文附4．3、～SAMS3蛋白的信号肽预测58{00150200250300350t：{lils期em旨毫fle～——reside——0啦sl髻e———附4．4VvSAMS3蛋白的跨膜结构域预测432，8642口10x羔五面no．IA 葡萄5m签基因的克隆、原核表达及分析附4．5VvSAMS4蛋白的信号肽预测H毓n舯e潮瞎囊ne——}nsido～0潼slg嚣⋯附4．6VvSAMS4蛋白的跨膜结构域预测x总一|q∞ooLa 辽宁师范大学硕士研究生学位论文o‘a¨1208060402P奇#iti4懈附4．7VvSAMS5蛋白的信号肽预测501001502002,gO300350transmem黯Brleiaside——附4．8VvSAMS5蛋白的跨膜结构域预测45oft,side’”’。‘。’。’～》芝一互田ooLa 葡萄湖基因的克隆、原核表达及分析攻读硕士学位期间发表学术论文情况鞠妍，侯和胜．SAM合成酶基因的研究进展与应用现状．天津农业科学．2012， 辽宁师范大学硕士研究生学位论文致谢在论文定稿之际，我感慨万千，回顾三年的研究生生活，真的使我学到了很多东西，无论是科研上的还是生活上的，我都觉得我的人生因为这三年的研究生生活有了更多的收获，我也觉得我的人生因此而变得更精彩了。本论文从选题、实验方案的确定、直到实验结果的分析，以及最后论文的定稿，都是在侯和胜教授的指导下完成的。是侯老师给了我最大的指导、帮助以及支持，才使得我的实验研究能够顺利的进行并最终完成，我最真心的向侯老师表示感谢，谢谢老师!!!在我实验研究过程中，还要感谢本实验室的师兄：李世国、乔坤、李泽昀、刘纪元、翟建盛；师姐：宣慧、任晓咏、邱玲玉、吴倩倩、杨帆、黄佳玲；同届的：于和平、姚美玲、姚雪、刘丽、石颖；师弟：陈吻升、吴健、刘佳鑫；师妹：张瑜、初雪鹏、席海秀、孙秀、蔡建平、刘晶莹。还要感谢同寝室的周鹏、咸强强和李宏宇。感谢你们在实验和生活上对我的支持和帮助。最后，还要特别感谢养育我长大成人的父母，谢谢你们在人生的道路上伴我一路走来，给予我无私的支持、鼓励和爱护!