超声造影剂介导靶向基因治疗大鼠肝癌的实验研究

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1、华中科技大学博士学位论文超声造影剂介导靶向基因治疗大鼠肝癌的实验研究姓名：程文申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：张青萍2003.4.1华中科技大学同济医学院程文博士论文·前言前言近年来随着分子生物学、肿瘤免疫学等相关学科的迅速发展和基因工程技术的不断改进提高，基因治疗的研究曰新月异。基因治疗已从实验研究、基础研究过渡到临床试用阶段，有些业已取得良好效果。肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其每年发病人数在一百万人以上，且发病率和死亡率呈逐年递增的趋势，严重威胁人类的健康和生命，基因治疗被认为是治愈肝癌的新希望。目前肝癌的基因治疗方案主要有抑癌基因治疗、反义基因治疗

2、、自杀基因治疗、免疫基因治疗、抗血管基因治疗和联合基因治疗等。P53基因是一种抑癌基因，肝癌组织均存在不同程度p53基因的缺失、失活、突变或异常表达，增强或恢复p53抑癌基因的表达或功能成为近年肝癌基因治疗的新手段。将野生型p53基因导入肝癌细胞中，可以替代缺失或异常表达的抑癌基因，抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，明显增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，明显抑制VEGF表达，进而抑制肿瘤新生血管生成，达到抗肿瘤转移的效果。尽管基因是治疗疾病的新方法，但其临床应用仍受到一定限制，其主要问题是难以找到～种安全、有效输送到特定组织或器官的转载系统。治疗基因常常是生物大分子，有几千个碱基

3、对构成，分子重达几百万个道尔顿，不易通过血管的内皮细胞间隙，内皮屏障限制其通过毛细血管进入周围组织。脂质体、微囊等常见基因载体的直径多大于100rim，也较难通过血管壁内皮屏障而进入靶组织。此外，通过外周静脉注入的治疗基因稳定性差，容易被血清酯酸酶所降解。目前认为，使得转基因载体在肿瘤内聚积的最佳途径就是直接在瘤体内穿刺注射，它最直观、最简便地在导入途径上对基因治疗进行靶向控制。直接将基因注射入肌肉可增加基因的表达，但在其他的组织内直接注射裸基因的效果不显著。此外，直接注射也是～种有创性操作，在有些脏器技术难度要求较高。脂质体、阳离子物质、病毒等可作为基因的载体，并能促进基因的

4、转化，但脂质体包裹质粒DNA的转移方法所引起基因转移效率较低，所转移的基因多为短暂表达，较难获得稳定、持久的表达，且靶向性差，故限制了在基因治疗中的实际应用。病毒类载体华中科技走学同济医学院程文博士论文·前言存在免疫原性高、毒性大等缺点，能引起机体的免疫反应，目前临床上已有因病毒类载体的免疫反应引起死亡的报道。此外，病毒类载体也可导致突变。经血管输入治疗基因，既可转染入病变区的细胞和组织内，也可以在非病变区细胞内发生转化，给正常的组织和细胞造成损害，可见，基因治疗的靶向性对于其临床应用异常重要。如何将治疗基因安全、高效、简便、准确地导入特定组织和细胞内，是基因治疗成功的前提和关

5、键。近年来超声医学发展迅猛，随着声学理论研究的深入、计算机技术的改进和完善、生物学效应研究的提高，超声医学已超出经典超声影像学的范畴，在基因治疗中己展现出广阔的应用前景。最近大量的体内外实验表明，超声照射可促进治疗基因在细胞内的转染和表达，其机制可能为超声的空化效应和机械效应所致，多数学者更倾向于前者。超声造影剂最初用于诊断，经外周静脉注射后可显示正常组织和病变区的血流灌注状态和功能。但近年来的研究证实，造影剂微气泡通过增强超声的空化效应可提高细胞膜的通透性；超声照射可破坏微气泡，使微血管破裂，内皮细胞间隙增宽，血管壁的通透性增大，微气泡破坏产生的局部冲击波可促使外源性物质进入

6、间质；微气泡外衣可保持其固有的生物学特性，与治疗基因相结合，可作为治疗基因的载体和空化核。待经周围血管输入的造影剂到达治疗区域时，通过放置于体外的超声探头发射超声波击碎微气泡，可使其结合的治疗基因在局部释放出来，增加了基因在局部的剂量，并通过通透性增大的血管壁和细胞膜进入靶细胞；此外微气泡破裂产生的局部冲击波可促使基因进入周围组织。目前国外已有学者应用此种方法将治疗基因成功地导入心脏、肾脏和肌肉等。本研究拟采用免疫抑制法制作大鼠皮下和肝内原位肝细胞癌模型，用常规超声和造影增强的二维灰阶超声观察肿瘤的生长及血管灌注情况，并将超声造影剂和／或人的野生型p53质粒DNA粘附后通过外周

7、静脉、超声引导下注射、瘤体内直接注射方式导入大鼠肝癌细胞内，用二次谐波模式超声照射肝癌区。采用半定量RT．PCR法检测肝癌细胞内p53基因的相对表达量，以探讨一种新型、无创、高效、安全的靶向基因治疗方法。2华中科技大学同济医擘院程文博士论文·中文摘要超声造影剂介导靶向基因治疗大鼠肝癌的实验研究博士研究生：程文博士生导师：张青萍教授华中科技大学同济医学院附属同济医院超声影像科武汉430030中文摘要第一部分超声监护下免疫抑制大鼠肝癌模型的建立及超声造影表现目的二用超声监测免疫抑制大鼠肝癌模型的