腺病毒介导的肝癌靶向SEACD80基因治疗及免疫学机制的初步研究.doc

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1、腺病毒介导的肝癌靶向SEACD80基因治疗及免疫学机制的初步研究作者：司少艳，胡沛臻，黄杨，李侠，葛伟，张秀敏，隋延仿,张建中，张铭【摘要】目的：观察肝癌靶向性葡萄球菌肠毒索A（SEA）/CD80基因重组腺病毒载体对肝癌的疗效，并对其免疫学机制进行初步研究。方法：利用AdEasy腺病毒系统分别构建并制备甲胎蛋口（AFP）启动子和增强子I调控的SEA和/或CD80基因重组腺病毒载体,然后采用瘤体内直接注射的方式对小鼠皮下移植性肝癌进行治疗，采用RTPCR和Westernblot方法检测腺病毒注射部位的SEA和CD80mRNA和

2、蛋白的表达情况；采用ELTSpot方法和IDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肝癌特异性IFNY分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞（CTLs）对Hepal6细胞的特异杀伤活性；通过观察荷瘤小鼠经治疗后肿瘤体积的变化及生存时间，评价重组腺病毒对肝癌的治疗作用。结果：我们构建的腺病毒能够使SEA和/或CD80mRNA和蛋白靶向地在肝癌组织中表达；与空载体组和PBS对照组相比，双基因组和单基因组分泌IFNy的T细胞数量均明显增多，CTL对Hepal6细胞的特异性杀伤作用均明显增强，荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小，生存期明显延长；双基因组的疗效

3、和对免疫系统的激活作用明显高于单基因组；CD80和SEA的组之间、空载体和PBS组之间无明显差异。结论：我们制备的肝癌靶向性重组腺病毒对肝癌有良好的治疗作用，联合基因治疗优于单个基因治疗。【关键词】葡萄球菌肠毒素ACD80共表达腺病毒肝癌靶向治疗金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcalenterotoxinsA,SEA)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种具有超抗原活性的细菌毒素，它无需抗原提呈细胞的加工处理，以完整的蛋白分子直接与抗原提呈细胞的MHCII及T细胞的TCR结合激活大量的T细胞，同时产生大量的细胞因子，如T

4、NFci、TL2、TFNy等，从而促进系统的抗肿瘤效应。近年来，SEA在肿瘤治疗中的研究十分活跃［1,2］,已先后有2种单克隆抗体(mAb)靶向性超抗原基因工程药物进入I期临床实验，并取得一定的疗效［3,4］o而SEA诱导的T细胞活化需要TCR和CD28介导的活化信号的共同参与［5］oCD80是能够与CD28分子结合的共刺激分子之一，它与T细胞上CD28分子的结合为T细胞有效活化提供笫二信号。高效性和靶向性是肿瘤基因治疗的两个关键性问题,利用肿瘤特异性基因调控序列控制治疗基因的表达，是获得靶向性基因治疗的途径之一。由于70%

5、以上的原发性肝癌甲胎蛋白(AFP)表达水平明显升高，因此，在肝癌的靶向基因治疗中，AFP调控元件常被用来调控目的基因的表达［6］。在基因治疗中，腺病毒由于具有承载容量大、宿主范围广、可达到较高滴度及以染色体外形式存在等优点而逐渐成为基因治疗载体的主力军。本实验旨在通过制备AFP调控元件调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体，对肝癌进行靶向免疫基因治疗，并对其抗癌免疫学机理进行初步研究。1材料和方法1.1材料C57BL/6小鼠（6〜8周龄，雌性）为第四军医大学实验动物屮心提供。小鼠高表达AFP肝癌细胞株Hepal6为第

6、二军医大学卫立辛教授惠赠。AdEasy系统包括腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttleCMV、骨架质粒pAdEasy1、E.coliBJ5183及其包装细胞HEK293细胞，均为第四军医大学生化教研室馈赠。兔抗SEA抗体，生物素化的羊抗兔IgG购口美国Sigma公司，生物素化的马来西亚苍鼠抗小鼠CD80抗体为美国CALTAG公司产品。小鼠IFNYELTSPOT检测试剂盒为法国DTACLONE公司产品，Cytotox96检测试剂盒为美国Promega公司产品。1.2方法1.2.1重组腺病毒载体的构建肝癌靶向性SEACD

7、80基因共表达重组腺病毒载体rAdAFPBIS和rAdAFPSEA的构建及制备分别参见文献[7,8],同理制备和rAdAFPCD80。1.2.2腺病毒介导的SEA/CD80在肝癌组织中的靶向表达1.2.2.1瘤内注射AdAFPCD80、AdAFPSEAtm、AdAFPBTS和Adempty,正常肝脏组织注射AdAFPBTS取C57BL/6小鼠10只，分为5组，每组2只：(1)空载体组；(2)CD80组；(3)SEA组；(4)BTS组注射；(5)正常肝组织组。常规培养Hepal6细胞，胰酶消化，PBS洗涤2次，制备溶于PBS浓

8、度为1X1010/L的细胞悬液，第(1)~(4)组每只小鼠右后肢皮下注射100»L细胞悬液，每天观察肿瘤生长情况，当肿瘤长径达0.5cm时，分别相应瘤内注射1X109PFU腺病毒Adempty.AdAFPCD80、AdAFPSEAtm和AdAFPBTS;第(5)组为正常小鼠，肝脏注射1X1