实验简单染色与革兰氏染色

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实验五简单染色与革兰氏染色 一实验目的1、学习微生物涂片、染色的操作技术；2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；3、初步掌握无菌操作技术；4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二实验原理——简单染色常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。二实验原理——革兰氏染色 三实验材料培养24小时的大肠杆菌（E.coli），金黄色葡萄球菌;每个小组从土壤中分离得到的菌种；载玻片﹑接种环﹑酒精灯及火柴﹑结晶紫染色液﹑碘液﹑95％乙醇﹑番红染色液﹑吸水纸﹑显微镜。 四实验步骤简单染色制片→染色→水洗→干燥→镜检 （1）制片：取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固定；（2）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。（4）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（5）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。注意无菌操作 制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→观察革兰氏染色 实验结果 实验完毕后的处理①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。 五注意事项1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。3、染色过程中勿使染色液干涸。4、选用幼龄的细菌。5、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞；6、滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡；7、盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。 六思考1、简单染色和革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？2、绘制简单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。3、简单染色和革兰氏染色的原理？