高效液相色谱定性定量分析方法

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1、高效液相色谱定性定量分析方法申海艳2012-11-10色谱分析的目的：对未知组分进行定性分析对已知组分进行定量分析根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性定量分析。液相色谱定性分析液相色谱定量分析影响定量分析的因素色谱峰的定性鉴别：通过保留值（通常指保留时间）进行定性需要制定保留时间误差范围在相同分析条件下保留时间相同并不一定是同一组分保留时间不同肯定不是同一组分用“标样”的保留值定出被测组份的位置标准加入法将已知标准物质加到待测样品中，若某一峰增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使该峰增高，则可基本

2、认定该峰与标准物质为同一物质。DAD检测器可同时比较保留时间和紫外光谱图。如果两项均一致，则可基本上确定为同一物质；如果保留时间一致，而紫外图谱有较大差别，则判定两者不是同一物质。两谱联用技术1如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。2可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和质谱对化合物进行定性，目前两用技术有：HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS,HPLC-NMR等。液相色谱定性分析液相色谱定量分析影响定量分析的因素确定样品的类型，主要成分/痕量

3、成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法定量分析的具体内容准确度的衡量色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等的因素，其结果同“标样”的准确程度关系密切一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数相关系数：其中，X及Y分别代表不同方法的实验值及平均值准确度的影响因素标样的可靠性及其配制的准确度色谱方法的可靠性色谱泵的精确度（GPC的影响更大）进样器的准确度，进样技术定量分析基本要求要有纯物质做标准被定量组分

4、峰要与其他组分达到基线分离符合定性参数要求选择合适定量方法定量分析基本公式在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）Ci=fiAiCi=fiHi实际修饰公式为：y=ax+b定量分析方法面积归一化法标准曲线法内标法标准加入法按测量参数分为峰面积法和峰高法定量分析色谱定量分析，峰高法和峰面积法的选择主要取决于检测器线性范围内，峰高和峰面积的准确性和重现性。归一化法最好选择峰面积法。标准曲线法、内标法和标准加入法可选择峰高法或峰面积法定量。面积归一化法不能作为准确定量的方法

5、、仅在特殊情况下使用公式：特点：各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响应因子相当进样量不要求严格不需标样无需做校正、简单、快速标准曲线法Ci=fiAi+afi为i组分工作曲线的斜率是实验室最准确的定量方法，定量较准确。标准曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误。注意的问题1绘制标准工作曲线时，不同浓度的标准样品的数量一般不少于3个，多数取4-6个;2标准样品的浓度间隔一般是等间隔，或两头稍密，中间宽些；3待测组分浓度最好在标准工作曲线的中部，标准工作曲线一般不能外推；4在扣除各种空白干扰后，一般可将原点视为标准工

6、作曲线应通过的一点，即a值尽可能小。标准工作曲线的绘制——线性回归在色谱定量分析中检测器的响应值与待测组分浓度应呈线性关系，如无误差存在，所有的点都应在一条直线上；实际上，由于随机误差不可避免，特别是误差较大，实验点较多时，要得到一条使所有实验点误差都最小的直线（最佳回归线），采用的方法是对数据进行回归分析，求出回归方程，再配线作图。当自变量为一个时称为一元回归。色谱定量分析中绘制标准工作曲线的过程就是一元线性回归方程的求解和配线过程。线性回归方程y=ax+bb称回归系数，是标准工作曲线的斜率；a是常数项，是回归直线的截距，此项应很小接近零；a值过

7、大说明实验过程中有系统误差。回归直线就是在所有直线中使差方和（各数据点的误差的平方的加和）最小的那条直线，即回归直线的系数a和常数b项应使差方和达到极小值。此求回归直线的方法通常被称为最小二乘法。相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；相关系数越接近1，说明线性关系越好；绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。如达不到要求，可能存在以下原因：所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器响应值的线性范围；实验数据的精密度太差，过于分散。无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线。优点适合大量样品的分析；不需要所有组

8、分都流出或被检测到。需要标准品进样量要准确仪器稳定性良好每次样品分析的色谱条件很难完全相同，容易出现误差绘制标准工作曲线一