高通量测序技术平台流程及应用

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1、高通量测序技术平台流程及应用主要内容高通量测序平台简介三大NGS平台测序流程主要步骤三大NGS平台其他应用方向NGS其他应用方向测序流程举例以Illumina平台为例SOLiD全称为supportedoligoligationdetetion，它的独特在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。2005年底，454公司推出了革命性的基于基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，其特点是边合成边测序（sequencing-by-synthesis）。之后454公司被Roche以1.55亿美元收购。一

2、年后推出新一代GSFLX。GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术”DNA簇”和”可逆性末端终结(reversibleterminator)”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Solexa于2007年被Illumina以6亿美金收购三大NGS平台其他应用方向ABISOLiD系统应用方向测序和重测序全基因组表达图谱分析SNP分析microRNA分析ChIP分析DNA甲基化分析RocheGSFLX系统应用方向微生物（基因组和抗药性）艾滋病毒（抗药突变和预诊）肿瘤基因组和突变环境基因组（Metagenomics）传染病源快速鉴定D

3、NA甲基化多重单核苷酸多态性（SNP）分析转录基因组研究全基因组小分子RNA（miRNA）分析细菌人工染色体人体基因组结构和突变染色质免疫沉淀考古学IlluminaGenomeAnalyzer系统应用方向DNAFragment文库测序DNAMate-pair文库测序SmallRNA测序数字化表达谱测序转录组测序DNA甲基化测序ChIP-seqMeta-GenomicsDNA测序血浆微量DNA测序NGS其他应用方向测序流程举例--以Illumina平台为例基因组DNA的随机打断↓DNA片段的末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3′末端↓在DNA片段的末端加上特定接头↓PCR扩增

4、连上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation的成簇扩增↓Illumina GenomeAnalyzer上的测序↓生物信息组装/分析IlluminaDNAFragment文库测序流程IlluminaMate-pair文库测序流程基因组DNA随机打断特定大小片段（2-10kb范围可选）↓末端修复↓生物素标记↓环化↓获得来自大片段两端共计400-600bp的DNA片段↓修饰、加接头↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息组装/分析IlluminaS

5、mallRNA测序流程从总RNA中分离smallRNA↓5′接头连接和纯化↓3′接头连接纯化↓RT-PCR扩增↓SmallRNA文库的纯化↓文库的检测↓DNA在ClusterStation成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析Illumina数字化表达谱测序流程mRNA的分离和cDNA第一链的合成↓cDNA第二链的合成↓限制性内切酶NlaIII的酶切↓连接GEXNlaIIIAdapter1↓限制性内切酶MmeI的酶切↓连接GEXAdapter2↓Adapter连接cDNA产物和PCR富集↓文库的检测↓DNA在ClusterStation上的

6、成簇扩增↓Illumina GenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析TotalRNA的DNaseI酶消化↓mRNA分离和随机打断↓cDNA第一链和第二链的合成↓DNA片段的末端修复↓将“A”碱基加入到DNA片段的3′末端↓在DNA片段的末端加上特定接头↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库的检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩增↓Illumina GenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析Illumina转录组测序流程基因组DNA随机打断↓DNA片段的末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3’末端↓DNA片段末端加上特别处理的甲基化接头↓重

7、亚硫酸盐处理↓去盐处理↓PCR扩增连上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation上的成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生物信息学分析IlluminaDNA甲基化测序流程染色质免疫共沉淀↓目的DNA片段↓DNA片段的末端修复↓将‘A’碱基加入到DNA片段的3‘末端↓DNA片段末端加上接头↓PCR扩增加上接头的DNA片段↓文库检测↓DNA在ClusterStation成簇扩增↓IlluminaGenomeAnalyzer上的测序↓生