高通量测序技术及其应用

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１）：１０９１１４高通量测序技术及其应用１，２３１１２王兴春杨致荣王敏李玮李生才（１山西农业大学生命科学学院太谷０３０８０１２山西农业大学农学院太谷０３０８０１）（３山西农业大学文理学院太谷０３０８０１）摘要高通量测序技术是ＤＮＡ测序发展历程的一个里程碑，它为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇。详细介绍了以４５４、Ｓｏｌｅｘａ和ＳＯＬｉＤ为代表的第二代高通量测序技术，以ＨｅｌｉＳｃｏｐｅＴＩＲＭ和ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓ

2、ｃｉｅｎｃｅｓＳＭＲＴ为代表的单分子测序技术，以及最近ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ公司推出的ＩｏｎＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）测序技术等高通量测序技术的最新进展。在此基础上，阐述了高通量测序技术在基因组测序、转录组测序、基因表达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究领域的应用。最后，讨论了高通量测序技术在成本和后续数据分析等方面存在的问题及其未来的发展前景。关键词高通量测序深度测序下一代测序基因组测序转录组测序中图分类号Ｑ３作为最重要的分子生物学分析方法之一，ＤＮＡ测命科学

3、研究中的应用，以期使科研工作者尽早地了解序不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物该技术，并将其更好地应用到科研工作中。学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等１高通量测序技术及其发展现状应用研究中也发挥着重要的作用。随着科学的发展，传统的Ｓａｎｇｅｒ测序技术的局限性日益突出。一方面，高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里该技术依赖于毛细管电泳，不但费时，而且测序反应数程碑，该技术可以对数百万个ＤＮＡ分子进行同时测也受到限制（目前常用的ＡＢＩ３７３０测序仪每次只能分序。这使得对一个物

4、种的转录组和基因组进行细致全析９６个样品）；另一方面，该技术基于酶法测序，成本貌的分析成为可能，因此也称其为深度测序（ｄｅｅｐ较高。自２００５年以来，以Ｒｏｃｈｅ公司的４５４技术、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）［２］或下一代测序技术（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＩｌｌｕｍｉｎａ公司的Ｓｏｌｅｘａ技术和ＡＢＩ公司的ＳＯＬｉＤ技术［３］ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）。目前，所说的高通量测序技术主为标志的高通量测序技术相继诞生。虽然高通量测序要是指４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ公司、ＡＢＩ公司和Ｉｌｌｕｍｉｎａ

5、公技术建立的时间不长，但发展非常快。已经应用于基ＴＭ司推出的第二代测序技术以及ＨｅｌｉｃｏｓＨｅｌｉｓｃｏｐｅ和因组，包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ推出的单分子测序技术。［１］究的许多方面。高通量测序技术已经将人们带到了１．１第二代测序技术真正的高通量测序时代，这些技术必将在生命科学领２００５年，４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ公司（现已被Ｒｏｃｈｅ公司域得到广泛的应用，并产生极大的推动作用。然而，许收购）首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高多科研人

6、员仅知道高通量测序技术的大概原理，而对通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。于该技术在生命科学领域的应用却知之甚少。为此，该技术的原理是酶级联化学发光反应：首先将ＰＣＲ扩本文详细阐述了高通量测序技术的最新进展及其在生增的单链ＤＮＡ与引物杂交，并与ＤＮＡ聚合酶、ＡＴＰ硫收稿日期：２０１１０４１１修回日期：２０１１０６０２酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素山西省青年科技研究基金（２０１００２１０３０１）、国家自然科学基金（３１１００２３５）资助项目酶和５′磷酸硫酸

7、腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中通讯作者，电子信箱：ｗｘｉｎｇｃｈｕｎ＠１６３．ｃｏｍ；ｓｘａｕｌｓｃ＠１２６．ｃｏｍ只加入一种ｄＮＴＰ，若该ｄＮＴＰ与模板配对，聚合酶就可１１０中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３２Ｎｏ．１２０１２以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。技术完全摒弃了上述测序平台所基于的ＰＣＲ扩增的信焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ＡＴＰ，ＡＴＰ就会促使氧合号放大过程，真正达到了读取单分子荧光的能力。具荧光素的合成并释放可见光。ＣＣＤ检测后通过软件转体

8、原理为：首先，将待测ＤＮＡ样品随机打断成小片段，化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正在每个小片段的末端加上ｐｏｌｙｄＡ；然后，将小片段［４］比。此后，Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司和ＡＢＩ公司相继推出了ＤＮＡ模板与固定在检测芯片上的ｐｏｌｙｄＴ引物进行杂［５］［６］Ｓｏｌｅｘａ和ＳＯＬｉＤ（ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｏｌｉｇｏｌｉｇａｔｉｏｎｄｅｔｅｔｉｏｎ）测交并精确定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子。序技术。它们与焦磷酸测序法的原理类似，核心思想在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗