生物化学实验报告材料

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1、文档生物化学实验报告动物营养研究所张树润2015.10.12猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地1.通过实验了解活性物质的分离提取。2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。二．实验原理超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后，研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其命名为超氧化物歧化酶1-

2、2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5等）等方面具有了广泛的应用前景。超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶,文档可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应,生成H2O2和O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-S

3、OD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。SOD提取、纯化制备方法各异,常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单

4、位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000μg。三．实验试剂与器材1.实验试剂文档ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/LpH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA钠盐溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等1.实验器材紫外光分光光度计、可见光分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管

5、、离心机、烧杯、移液枪、试管架、EP管等。三．实验方法1.SOD的提取[1]取新鲜猪血20ml于50ml离心管，4000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。[2]向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.35倍体积的

6、95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，量其体积即为除血蛋白上清体积，留样500ul（样1）。将上层液用2层纱布进行过滤除去脂肪物质，然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min文档离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，量其体积即为热变性后上清体积，留样200ul（样2）。[3]向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置4小时，4000r/min，10m

7、in，弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，为丙酮沉淀后体积，备用（样3）。2.SOD活力测定[1]邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml50mmol/LpH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/LHCl作空白，325nm波长下每隔30s记录光

8、吸收值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min左右。[2]酶活力测定样1、样2及样3中SOD酶活力测定操作与[1]基本一致，加入邻苯三酚前，先加入20µlSOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。[3]酶活性单位计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：文档单位活性（U/ml）=×反应液总体积数×其中，Ao为邻苯