革兰氏染色与荚膜染色.ppt

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革兰氏染色与荚膜染色1、掌握革兰氏染色法和细菌荚膜染色法。2、观察菌体的一些简单结构。二、实验原理一、目的与要求： （一）革兰氏染色法原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 （二）荚膜染色法原理荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以加热固定，避免加热蒸发，影响观察。 三、实验器材1、菌种：枯草杆菌（Bacillussubtilis），大肠杆菌（Escherichiacoli），未知菌（环境中分离）（斜面培养物）褐球固氮菌（Azotobacterchroococcus）装片。2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红、二甲苯、香柏油3、器材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、废液缸 四、革兰氏染色法实验步骤流程路线：涂片干燥固定草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥碘液媒染1min水洗干燥95%乙醇脱色15~20秒水洗干燥番红复染1min水洗干燥镜检 (1)涂片干燥固定:21 （2）草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥 （3）碘液媒染1min水洗干燥 （4）95%乙醇脱色15~20秒水洗干燥 （5）番红复染1min水洗干燥镜检 五、注意事项：（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。（5）选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 荚膜示意图： 荚膜染色步骤：1、总路线：涂片用1%结晶紫染色3分钟用20%CuSO4冲洗镜检2、涂片： 3、结晶紫染色： 4、CuSO4冲洗： 注意事项：（1）不能加热固定，否则荚膜受热失水收缩，失去原形。（2）涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原形.(3)要用CuSO4冲洗，不要用水。 第4组值日 荚膜示意图： 革兰氏染色步骤涂片干燥固定草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥碘液媒染1min水洗干燥95%乙醇脱色15~20秒水洗干燥番红复染1min水洗干燥镜检荚膜染色步骤：涂片用1%结晶紫染色3分钟用20%CuSO4冲洗镜检 1、细胞壁 实验报告给出枯草杆菌，大肠杆菌，未知菌形态图，并注明其革兰氏染色反应。绘图示褐球固氮菌的形态特征 思考题1.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?3.革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？