离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定.doc

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1、离体脊髓星形胶质细胞的纯化与鉴定【摘要】目的探索新生大鼠脊髓星形胶质细胞的分离、培养与传代及纯化方法，鉴定其培养纯度。方法分离、培养新生大鼠脊髓星形胶质细胞，用换液时暴露结合旋转法加以纯化，酶消化法传代后进行免疫组化鉴定，并染核计数星形胶质细胞的纯度。结果星形胶质细胞贴壁快，多在12h内，3d后数量显著增加；免疫细胞化学染色显示，NFXXXX年，神经胶质细胞(astrocyte,AST)已成为神经科学研究的热点之一[1]，它不仅具有支持、分隔、营养和保护神经元的作用，而且参与了脑的高级功能活动，并在突触形成中起

2、着重要作用[2-3]□AST的分离、培养方法报道较多，取材部位以大脑皮层为主，脊髓相对较少，纯化方法常以多次传代为主。因此，有必要对星形胶质细胞的分离、培养与传代和纯化进行系统的研究，并对其培养纯度进行鉴定。1材料与方法1.1试剂与仪器DMEM培养基、D-Hank液和胎牛血清（FBS）皆购自Gibco公司丄•谷氨酰胺、Hoechst、胰蛋白酶和小鼠抗神经微丝单克隆抗体（NF200抗体）购自Sigma公司，兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP'FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗小鼠・lgG和抗体稀释液皆购

3、自北京中杉金桥生物技术有限公司。显微镜型号为OlympusBX-60,荧光激发装置为OlympusMODELBH2-RFL-T3,CO2培养箱THERMOFORMA3111o1.2细胞的分离和培养取新生24h内Sprague-Dawleyr大鼠（购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心），参照McCarthy等［4］的方法加以改进。取新生24h内的SD大鼠酒精浴后在无菌条件下取脊髓，置冰浴D-Hank液中，分离、剪碎脊髓组织置离心管中加10倍0.125%胰蛋白酶，在37°C下消化15mim,用含血清培

4、养基终止消化，过200目筛网，1100r/min离心5min,弃上清，加入DMEM培养基（含10%FBS）,轻柔吹打，制成细胞悬液，调节细胞密度为1x106/mL,接种在25cm2培养瓶中，置37°C二氧化碳孵箱，每3d半量换1.3AST的纯化每次换液都要将培养液吸干，使细胞在空气中暴露10秒钟以杀死少突胶质细胞；待细胞基本铺满培养瓶后，在37°C.280r/minJg18h,倒去培养液并用新鲜培养液漂洗3次，将所得纯化星形胶质细胞用二次酶消化法传代，用含血清(10%)培养液将细胞密度调至1x106/mL,种植

5、到培养皿中的盖玻片上(用作免疫组化鉴定)和培养瓶内，每3d半量换全培养液1次，直至细胞融合。1.4AST的鉴定对培养的AST作免疫细胞化学染色鉴定,GFAP与NF200抗体作免疫荧光双标，并用Hoechst染核标识细胞总数，计数AST的纯度。简言之，培养盖片经PBS漂洗2次,4°C丙酮室温固定10min,PBS漂洗5minx4次，加NF200抗体(1:1000)50pl/盖片，379湿盒孵育1h后49冰箱过夜，PBS漂洗5minx3次,TRITC标记山羊抗小鼠-IgG(1:400)379孵育1.5h,PBS漂洗

6、5minx3次，加GFAP抗体(1:500),以等量的抗体稀释液作为对照，37°C湿盒孵育4h后PBS漂洗5minx3次，FITC标记山羊抗兔IgG(1:400)379湿盒孵育1h后Hoechst（终浓度为1pg/mL）染细胞核5min;漂洗封片后荧光显微镜观察、照相。1.5细胞计数在显微镜下随机选取20个视野，分别计数发蓝光的细胞核数量（表示细胞总数），GFAP阳性细胞数（绿光）和NF200阳性细胞数（红光），算岀平均每个视野中GFAP阳性细胞所占细胞总数的比例。2结果脊髓AST原代培养时，细胞悬液接种后贴壁

7、较快，12h时绝大部分细胞都已贴壁，部分细胞已长出细小的突起，24h后胞体发出许多长而分支的突起，胞体较大、胞质较丰富、形状不规则。3d后数量增加显著，逐步形成网络状连接。培养10d后，细胞基本长满培养瓶壁。传代后细胞生长更活跃，培养7d便可长满瓶壁，很快融合成片状。NFXXXX年，AST参与突触发生、发育日益受到学者们的重视，被看作是继突触前、后成分之后构成突触的第三成分[1]o而离体培养是一种较好的研究细胞形态、功能以及神经生物学和神经药物学等的重要方法。因此，有关星形胶质细胞培养的文献很多，但多数是培养大

8、脑皮质的AST培养或细胞株培养，有关脊髓AST培养的资料较少，尤其是其纯化方法和培养纯度的测定报道更为少见。获得较为单一的、高纯度的细胞成分是进行深入研究的基础，因在体AST与其他种类细胞混杂存在，无法完全分离，故高纯度的AST只能通过体外细胞培养来获得，且必须对培养的AST进行纯化方可获得。AST体外培养及纯化常采用植块培养法和分离细胞培养法。前者应用较早，一般以中枢神经系统的白质组